从整个成年果蝇大脑细胞记录

Biology

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Summary

这个视频演示隔离准备从单个神经元,使用标准的全细胞技术记录整个大脑在成年果蝇的过程。它包括绿色荧光标记的细胞和神经元在录制过程中查看的图像。

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Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (6), e248, doi:10.3791/248 (2007).

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Abstract

在这段视频中,我们展示了整个隔离准备从单个神经元记录在成年果蝇大脑的过程。我们首先通过描述的解剖解决方案,并在我们的研究中所使用的成年女性的捕获。删除整个大脑完好,包括视叶,程序说明。也显示夹层覆气管。孤立的大脑不仅是小的,但需要特殊照顾,在此阶段处理,以防止损坏的神经元,其中有许多是接近外表面的组织。我们展示了如何使用我们开发的是一个特殊的人来稳定大脑中的录音室。设置一个标准的电是从单个神经元或神经元对的记录。一个荧光图像,通过录音显微镜观看,从GAL4推动GFP的表达(GH146)说明了如何确定在活的大脑投射神经元(PNS)。高功率Nomarski图像显示了正在有针对性的全细胞记录单个神经元。当大脑无损伤成功拆除,大多数神经元的自发活动,发射动作电位和/或参展自发突触输入。在现场准备,确定在整个大脑的神经元的全细胞记录可与遗传和药理操作相结合,这是一个有益的模式探索在成人中枢神经系统的细胞生理学和可塑性。

Protocol

一,剖析大脑成人飞

  1. 解剖解决方案中心在35毫米培养皿中放置一个小滴(约100μL)。
  2. 捕获的成年女性使用吸引器。在解剖显微镜下,用两个注射器针头杀头飞。
  3. 将头部的解剖生理盐水的小水滴在培养皿(用木瓜蛋白酶添加)。
  4. 头的位置与面临的菜底部的长鼻。
  5. 保持角质层覆盖针1左复眼。做一个对角线切割背侧延伸到了2针,只是内侧针1腹面。
  6. 与针1次举行的口器和使用针2水平的削减延伸,从左眼腹面右眼长鼻基地的水平,。
  7. 按住针1对复眼的角质层覆盖。做一个对角线切割背侧延伸到了2针,只是内侧的针1腹面。
  8. 旋转头部,使培养皿的表面上喙侧。喙角质层和大脑之间插入针1次,并用针2,遵循相同的路径,作为第一针。理想的情况下,将囊剥离因为这些连接都视叶的大脑是在稳定记录大脑的重要。
  9. 气管,气囊,和其他结缔组织使用两个精尖钳小心取出。
  10. 整个清扫应采取3-10分钟

二。安装的中枢神经系统

  1. 大脑是用一个黄色的提示吸管转移到录音室。
  2. 在录音室中,大脑是稳定放在铂帧两个细十字线与视叶和中央的大脑区域之间的交界处组织的联系。
  3. 每个大脑是允许连续灌注含氧生理盐水(95%氧气和5%的二氧化碳),在录音室休息至少10分钟。整个录音期间继续灌注含氧生理盐水室。制备可视化使用一个堂堂正正的一个固定的舞台和一个40倍水浸泡的目标(Achroplan;数值孔径为0.8;蔡司)和Nomarski光学显微镜(Axioskop 2FS,德国蔡司,奥伯科亨)。绿色荧光蛋白被认为与BP 505-530荧光过滤器。

三。电

  1. 8-14兆欧吸管用于全细胞记录
  2. 电流钳和电压钳记录使用列表EPC7或Axopatch 200B中的放大器,一个Digidata 1322A DA转换器(分子器件的Foster City,CA),一个戴尔Dimension 8200电脑(Round Rock的戴尔电脑,德克萨斯州), pClamp 9软件(Molecular Devices公司)。

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Discussion

孤立的整个大脑的准备,我们在这个视频说明允许在确定神经细胞,包括那些在嗅觉的处理途径,在成年果蝇大脑(谷和澳多德,2006年),的兴奋性突触传递的基本细胞机制的评估。这种方法是互补的完整的成年果蝇(Wilson等所有2004年)的大脑中的神经元活动的研究,在哺乳动物的大脑切片中的神经元相同的方式录音,录音清醒行为哺乳动物的互补。有两大优势原位果蝇大脑的编制相比,哺乳动物片。首先,整个果蝇大脑容易,所以它是没有必要的消费税从一个较大的神经回路发生时,哺乳动物的大脑切片的组织小块适合进录音室。因此,孤立的Drospohila大脑内的神经回路仍然基本完好。其次,大部分的神经元细胞体附近的脑表面,易于全细胞记录,和他们保持功能活跃,连续几个小时的含氧生理盐水灌注。

使用玻璃底的录音室,也可确定其位置和/或GFP表达的基础上的特定神经元。在此准备,在灌注过程中的录音需要稳定的大脑。这是不兼容的标准程序,包括战略地位的金线或尼龙网,有效的,如海马组织,由于整个大脑(〜1mm)的小尺寸。因此,我们设计与铂金框和尼龙交叉定位的联系只有两个位置的脑位于脑表面附近的神经元的损害降到最低毛的持有人。这种稳定的大脑,与前或后的一面朝上,相反的表面,只需轻轻的录音室的地板上休息。使用这种设备,我们能够经常保持稳定的全细胞记录长达一个小时,甚至包括凯尼恩细胞的小神经元,而这样做需要浴应用程序的特定药物的药理操作。持有人也应确保其他小的组织样本,如新生老鼠的脊髓切片的电生理研究。

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Acknowledgements

这项工作是由美国国立卫生研究院授予NS27501到DKOD支持。霍华德休斯医学研究所教授项目资助,以DKOD这项工作提供了额外的支持。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
#5 Foceps Tool Fine Science Tools No. 11251-10 Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain Reagent Worthington Biochemical 3126 20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope SMZ-2B Model:C-PS Nikon Instruments Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co 305175 & 309602 Cheap and durable
Upright microscope Axioskop2 FS plus Carl Zeiss, Inc. Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier 200 B Molecular Devices
Digidata D-A converter 1322A Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gu, H., O Dowd, D. K., K, D. Cholinergic synaptic transmission in Adult Drosophila Kenyon cells in situ. Journal of Neuroscience. 26, 265-272 (2006).
  2. Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).

Comments

5 Comments

  1. As a fly researcher with no prior experience in electrophysiology, I intend to set-up the necessary facility, gain skill and subsequently implement, in our ongoing Drosophila neuropharmacogenomic modeling work, recording from brains of intact organism as well as from single neurons from isolated brain as described in the present paper. In this backdrop, I would like to know if the materials and devices mentioned in this paper would be sufficient for recording from brains of intact organism. If not, what else will be required? Where from one can obtain them? Kindly also suggest alternative suppliers, if any, for material and devices that have already been successfully used in intact organism and single neuron recordings.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 18, 2007 - 6:50 AM
  2. We have not recorded from brains in intact Drosophila with our equipment but I believe the set up we describe in this video is very similar to that used by Rachel Wilson and her colleagues at Harvard who are recording from intact organisms. In our lab we use both the Axon Instruments and List patch clamp amplifiers and they both work well. We have only used the Zeiss upright microscope.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 19, 2007 - 8:09 PM
  3. Is it possible to obtain or buy the designed holder (platinum frame and nylon cross hairs)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 14, 2010 - 11:50 PM
  4. We make these in the lab. You just need a short piece of platinum wire. Bend to shape you want. Use nylon hairs glued to wire with super glue. Nylon fibers are from a fine nylon mesh. We make under microscope and the nylon fibers are stretched over frame, taped on either side so they are tight, and then super glue applied to frame over the fiber. Each fiber glued in place allowed to dry before next one put on. Then trim all excess at end.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 15, 2010 - 7:43 PM
  5. What is the diameter of the platinum wire? Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 21, 2015 - 12:10 PM

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