Isolatie van Mouse speekselklier Stem Cells

Biology
 

Summary

Een geoptimaliseerde protocol voor de isolatie van stamcellen van de muis speekselklier wordt beschreven. De methode maakt gebruik van enzymatische en mechanische spijsvertering, en laat de isolatie van salispheres met cellen met kenmerken van stamcellen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pringle, S., Nanduri, L. S., Marianne, v. d., Ronald, v. O., Coppes, R. P. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (48), e2484, doi:10.3791/2484 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ouder speekselklieren van zowel mens en muis oorsprong bestaan ​​uit een minimum van vijf celtypen, die elk de productie en de uitscheiding van speeksel vergemakkelijkt in de mondholte. Sereuze en slijmvliezen acinaire cellen zijn de eiwit en slijmvliezen produceren de fabrieken van de klier respectievelijk, en vertegenwoordigen de herkomst van de speekselproductie. Eenmaal gesynthetiseerd, worden de verschillende enzymatische en andere eiwitachtige componenten van speeksel uitgescheiden door middel van een serie van ductale cellen die epitheliale-type morfologie, tot de uiteindelijke verdrijving van het speeksel door middel van een grote buis in de holte van de mond. De samenstelling van het speeksel is ook aangepast door de ductale cellen tijdens dit proces.

In de manifestatie van ziekten zoals het syndroom van Sjögren, en in sommige klinische situaties zoals radiotherapie de behandeling van hoofd-halskanker, speeksel productie door de klieren wordt drastisch verminderd 1,2. De resulterende xerostomie, een subjectief gevoel van een droge mond, beïnvloedt niet alleen het vermogen van de patiënt om te slikken en spreken, maar ook stimuleert de ontwikkeling van tandcariës en kan worden sociaal invaliderend voor de patiënt.

De restauratie van speeksel productie in de bovengenoemde klinische aandoeningen is dan ook een onbeantwoorde een klinische noodzaak, en als zodanig een aantal studies hebben aangetoond dat de regeneratieve capaciteit van de speekselklieren 3-5. Naar aanleiding van het isolement van stamcel-achtige populaties van cellen van verschillende weefsels in de muis en het menselijk lichaam 6-8, hebben we laten zien met behulp van de beschreven methode die stamcellen geïsoleerd uit muizen speekselklieren kan worden gebruikt om de speekselproductie in bestraalde speekselklieren te redden klieren 9,10. Deze ontdekking maakt de weg vrij voor de ontwikkeling van stamcel-gebaseerde therapieën voor de behandeling van xerostomic aandoeningen bij mensen, en ook voor de verkenning van de speekselklier als een micro-omgeving bevat cellen met multipotente zelfvernieuwende mogelijkheden.

Protocol

1. Regent Voorbereiding

  1. Buffer: 1% (w / v) bovine serum albumine in gebalanceerde zoutoplossing Hank's
  2. Reconstrueren enzymen. Hyaluronidase enzym: 40 mg / ml, opgelost in buffer. Collagenase II: 23 mg / ml, opgelost in buffer. Gebruik vers bereide oplossingen enzym vers voor elke isolatie. Toen opgelost, bewaren bij 4 ° C tot gebruik voor de spijsvertering.
  3. 50 mM calciumchloride in gedestilleerd water. Filter steriliseren door een 0,2 uM poriegrootte filter.
  4. Muis speekselklier (MSG) cultuur medium: DMEM: F12 met penicilline (100 IU / ml), streptomycine (100 ug / ml), Glutamax (2 mM), epidermale groeifactor-2 (20 ng / ml), fibroblast groeifactor -2 (20 ng / ml), N2 supplement (1%), insuline (10 ug / ml) en dexamethason (1 uM).

2. Mechanische en enzymatische Tissue Spijsvertering

  1. Weeg de ontleed speekselklieren.
  2. Hak klieren in een homogene pulp met gebruikmaking van steriele gebogen dissectie schaar in een kleine petrischaal.
  3. Verzamel gehakt weefsel in 14 ml buizen, met behulp van 1 ml van de buffer per 80 mg submandibulaire weefsel. Spoel de petrischaaltjes schoon van weefsel met behulp van een aantal van de buffer.
  4. Voeg nog een 1 ml buffer per 80 mg weefsel, gevolgd door 25 pi collagenase II enzymoplossing, 25 il hyaluronidase enzymoplossing en 250 uL calciumchloride oplossing per 80 mg weefsel. Als het werken met grote hoeveelheden weefsel, op een steenworp 2,4 tot 2,9 kan worden uitgevoerd in T25 weefselkweek flessen voor het gemak.
  5. Incubeer in een schuddend waterbad ingesteld op 37 ° C gedurende 20 minuten. Verwijder de buizen en vermaal met een pipet om grondig te mengen enzym door het weefsel opnieuw.
  6. Vervang in waterbad voor nog eens 20 minuten.
  7. Verzamel materiaal door middel van centrifugatie bij 400 xg, 8 minuten. Gooi supernatant.
  8. Resuspendeer in 2 mL buffer voor elke 80 mg weefsel, en herhaal enzym en calciumchloride aanvulling als hierboven. Incubeer 20 minuten in schudwaterbad. Verwijder de buizen en vermaal met een pipet om grondig te mengen enzymen.
  9. Incubeer voor de laatste 20 minuten in schudwaterbad. Verzamel cellen door centrifugeren, zoals hierboven, gooi supernatant.

3. Wasstappen

  1. Resuspendeer elk 80 mg van het weefsel in 2 mL buffer en pipet aan het weefsel vrij van enzymen te wassen.
  2. Centrifuge, zoals eerder te verzamelen. Gooi supernatant.
  3. Herhaal wassen met behulp van een mL buffer per 80 mg weefsel. Centrifuge te verzamelen, supernatant weggooien.

4. Filteren

  1. Resuspendeer weefsel oplossing in 1 ml buffer per 80 mg weefsel.
  2. Voeg oplossing tot 100 urn poriegrootte filter geplaatst over 50 ml Falcon buis. Niet van toepassing meer dan 3 ml van gehakt weefsel oplossing per kolom, zoals filters verstopt kunnen raken. Laat sijpelen door. Verwijder gefilterd materiaal opknoping aan de onderkant van het filter met een pipet, en toe te voegen aan filtraat.
  3. Gebruik injectiespuit met 26 gauge naald te filtraat te nemen van 50 ml buizen en tot 50 urn poriegrootte filters op 5 ml buizen toe te passen. Laat filteren door middel van, helpen door het losdraaien van deksels indien nodig.
  4. Centrifugebuizen zoals eerder te verzamelen. Gooi supernatant.

5. Plating-en Kleinbedrijf

  1. Combineer alle pellets in een volume. Tellen met behulp van geautomatiseerde cel-counter of hemocytometer.
  2. Plaat cellen op dichtheid van 0,4 x 10 6 cellen per putje van 12-well plaat, of 2,67 x 10 6 cellen per T25 weefselkweek kolf. Voeg 1 mL MSG medium aan elk putje of 6 mL aan elke T25 fles.
  3. Incubeer bij 37 ° C. Bollen moet duidelijk zichtbaar zijn op dag 2.

6. Representatieve resultaten:

Na twee tot drie dagen in cultuur, zullen kleine aggregaten van cellen (salispheres) blijken in de culturen. Salispheres zal blijven in omvang te groeien in een periode van tien dagen in cultuur. Vertegenwoordiger van fase contrast microscopie beelden van salispheres zijn weergegeven in figuur 1. Delende cellen die stamcel-geassocieerde marker eiwitten kunnen worden geïsoleerd uit deze sferen, optimaal tussen de dagen 3-5 na de isolatie, en zijn in staat van differentiatie in functionele, speeksel produceren acinaire cellen.

Figuur 1
Figuur 1. Salisphere vorming in vitro. Na de mechanische en enzymatische vertering met behulp van het huidige protocol, kan sferen van toenemende grootte te vinden in de zwevende culturen. Panelen zijn representatief voor fase-contrast-microscopie beelden van de bollen van dag 0 (A), 4 (B), 7 (C) en 10 (D). Schaalbalk = 50 pm.

Discussion

De weefselkweek hier beschreven methode is een reproduceerbaar protocol voor de isolatie van stamcellen-bevattende salispheres uit de speekselklieren van muizen. Studies met behulp van cellen die geïsoleerd op deze manier hebben gewezen op de regeneratieve capaciteit van de speekselklier stamcellen 9. Transplantatie van honderd van de c-Kit + cellen, afkomstig van de salispheres geïnduceerde functionele herstel van bestraalde muis speekselklieren. Deze gegevens zijn spannend en bieden een uitgangspunt voor het onderzoek van de stam-cel-gebaseerde therapie voor xerostomie. Veel wegen nog moet echter worden onderzocht, inclusief de volledige marker-eiwit expressie profiel van de stamcellen, het vermogen van submandibulaire klieren aan de functie van bestraalde parotis speekselklieren en vice versa te redden, en de karakterisering van de vermeende in vivo stamcellen niche van de cellen. Uiteindelijk is de vertaling van dit protocol om menselijk weefsel monsters en de daaropvolgende potentieel voor de behandeling van xerostomie in menselijke patiënten met behulp van de geïsoleerde cellen is de meest opwindende toepassing van de beschreven methode.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506 Store at – 20 °C
Collagenase II GIBCO, by Life Technologies 17101-015 Store at 4 °C
Epidermal Growth Factor-2 Sigma-Aldrich E9644 Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots.
Fibroblast Growth Factor-2 Sigma-Aldrich F0291 Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots.
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048 As manufacturer instructions.
Insulin Sigma-Aldrich I6634 Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
100 μM pore-size sterile cell strainers BD Biosciences 352360
Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) BD Biosciences 352235

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vissink, A. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).
  2. Napeñ, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth). Odontology. 97, 76-83 (2009).
  3. Denny, P. C. Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. 235, 475-485 (2005).
  4. Man, Y. G. Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat. J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).
  5. Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation. Differentiation. 79, 120-130 (2010).
  6. Eirew, P. A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability. Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).
  7. Gorjup, E. Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations. European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).
  8. Alonso, L., Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).
  9. Lombaert, I. M. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).
  10. Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage. Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).

Comments

8 Comments

  1. This is an urgent need for patients who had cancer radiation therapy.
    When are clinical trials on humans expected to commence?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 25, 2011 - 8:43 AM
  2. We are working at the moment on the translation of our stem cell isolation technique to human salivary gland tissue, and are characterising the stem cell-like attributes of these isolated cells. We hope to achieve translation of the technique to the clinical setting for use for therapy of xerostomia in human patients by ²017.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    April 26, 2011 - 7:46 AM
  3. Why not earlier?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 25, 2011 - 7:38 AM
  4. Mrs Pringle,How do you think ,Is it possible to be created or regenerated salivary glands if they were destroyed.
    I have atrophyc rhinopharyngitis.My salivary glands in the mouth are working ,but these on my throat were destroyed after incorect treatment over them and as a result of this
    I have lost my salivary glands in this area.Due to this I have a lot of health problems, and my hope is the scientists to discover a way of transplantation of salivary glands,using these glands ,that still are working.
    How do you think ,Is it possible?
    Thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2011 - 10:43 AM
  5. Dear Jana,

    Sorry to hear about your problems.
    We are focusing our research at the moment on providing at therapy for xerostomia in the major salivary glands of humans. This potential therapy is looking very promising. We work with these glands because they are the ones most commonly affected by radiation treatment. They are also large and easy to locate and work with.

    As far as we are aware, no-one is trying to develop a therapy for the minor salivary glands. This is mostly due to their high number and very small size - there are over 600 of them scattered throughout the oral cavity and throat. This would make a cell transplantation approach very challenging.

    So although I would love to be able to tell you that a stem cell-based therapy for xerostomia resulting from dysfunction of the minor salivary glands is in process, I think this is unlikely, I would not like to leave you with unrealistically high hopes!

    Regards,

    Sarah.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    October 31, 2011 - 4:31 AM
  6. Dear Sarah,
    thank you very much for your replay!

    The news are bad for me and maybe I couldn't see my small children grown up,but I believe that one day
    scientists like you will discover a way of solvetion of this serious problem.
    There are many people that suffer Seogren-sindrom and Empty nose(atrophic rhinitis),there is a web site "Empty nose sindrome association".I think ,if one day will be find a cure,many peopele would be saved!

    One more time,thank you for spared time!
    I wish you all the best and great success at your work!!!!
    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:14 AM
  7. Dear Jana,

    My wife was diagnosed with a metastatic undifferentiated nasopharyngeal carcinoma The primary was found deep in her throat at the base of the tongue. Radiation therapy commenced on ²² January ²007 with the last treatment on 5 March ²007. She received a relatively high radiation dose of 6,000 cGy on the sides and 6,500 cGy in the centre. Consequently she had the usual side effects of a permanent dry mouth and throat, sore tongue, sensitive and painful teeth and gums, difficulty swallowing even soft food, etc. The oncologist said that the salivary glands will never recover if they have not recovered even partially over a ² year period.

    During October this year, 4 years and 7 months after her last radiation treatment, her saliva returned in one day; not gradually. The doctors don²17;t know why. One guess is her high protein diet of milk, yogurt, cheese, etc. but its just a guess not based on any science.

    Don²17;t loose hope
    Regards
    Paul http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/²0698985 http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-²407-10-417.pdf Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration
    Abstract
    Background: Radiotherapy for head and neck cancer results in severe and chronic salivary gland dysfunction in most individuals. This results in significant side effects including xerostomia, dysphagia, and malnutrition which are linked to significant reductions in patients²17; quality of life. Currently there are few xerostomia treatment approaches that provide long-term results without significant side effects. To address this problem we investigated the potential for post-therapeutic IGF-1 to reverse radiation-induced salivary gland dysfunction.

    Methods: FVB mice were treated with targeted head and neck radiation and significant reductions in salivary function were confirmed 3 days after treatment. On days 4-8 after radiation, one group of mice was injected intravenously with IGF-1 while a second group served as a vehicle control. Stimulated salivary flow rates

    Conclusions: Post-therapeutic IGF-1 treatment restores salivary gland function potentially through normalization of
    cell proliferation and improved expression of amylase. These findings could aid in the rational design of therapy protocols or drugs for the treatment of radiation-induced salivary gland dysfunction in patients who have completed their anti-cancer therapies.

    Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) also known as somatomedin C is a protein that in humans is encoded by the IGF1 gene.

    IGF-1 is produced primarily by the liver as an endocrine hormone

    In rat experiments the amount of IGF-1 mRNA in the liver was positively associated with dietary casein and negatively associated with a protein free diet.
    IGF-1 then stimulates systemic body growth, and has growth-promoting effects on almost every cell in the body, especially skeletal muscle, cartilage, bone, liver, kidney, nerves, skin, hematopoietic cell, and lungs. In addition to the insulin-like effects, IGF-1 can also regulate cell growth and development, especially in nerve cells, as well as cellular DNA synthesis.
    ---------
    Casein
    From Wikipedia, the free encyclopedia
    Jump to: navigation, search
    For information about casein usage in artistic painting, see Casein paint.
    Casein (pronunciation: /G²;keɪsiɪn/, from Latin caseus, "cheese") is the name for a family of related phosphoprotein proteins (αS1, αS², β, κ). These proteins are commonly found in mammalian milk, making up 80% of the proteins in cow milk and between 60% and 65% of the proteins in human milk. Casein has a wide variety of uses, from being a major component of cheese, to use as a food additive, to a binder for safety matches. As a food source, casein supplies amino acids; carbohydrates; and two inorganic elements, calcium and phosphorus
    --------------------------------------------

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:58 AM
  8. Dear Paul,

    thank you for your letter ,your support and advices!
    I fight everyday to make my health condition beter, becouse I have children and they need me!But now I have atrophic rhinitis due to atrophic pharingiitis and day after day it becomes harder and harder to cope with this really
    serious problem!Despite every medical data I don't lose hope,becouse when there aren't any others possibilities ,the faith is the most important thing that can help us and give us strength!

    I hope that your wife is fine now ,after partly recovering of her salivary glands!I wish your family whole the hapiness in the world and the most important thing-"Health",you deserve these thinngs!!!!

    Paul,if you learn something new at this area of medicine,I beg you to write me!Here is my e-mail: tisho²001@mail.bg.

    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 10:18 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics