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समग्र संयंत्रों में जनरेशन Medicago truncatula Nodulation Assays के लिए इस्तेमाल किया

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Summary

हम कैसे बालों की जड़ समग्र पौधों मुश्किल परिणत प्रजातियों में संयंत्र rhizobium बातचीत और nodulation अध्ययन किया जा सकता का प्रदर्शन

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Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays. J. Vis. Exp. (49), e2633, doi:10.3791/2633 (2011).

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Abstract

Agrobacterium tumerfaciens के लिए इसी प्रकार, Agrobacterium rhizogenes संयंत्र रूट उत्प्रेरण स्वायत्त (री) प्लाज्मिड पर आधारित कोशिकाओं में विदेशी DNAs हस्तांतरण ए कर सकते हैं. rhizogenes संयंत्र के ऊतकों पर बालों की जड़ गठन का कारण है और परिवर्तन के बाद समग्र पौधों के रूप में कर सकते हैं. इन समग्र पौधों में, पुनर्जीवित जड़ों की कुछ ट्रांसजेनिक हैं, जंगली टी डीएनए और इंजीनियर द्विआधारी वेक्टर प्रकार ले, जबकि शूटिंग अभी भी गैर ट्रांसजेनिक हैं, ऊर्जा और विकास का समर्थन प्रदान करने की सेवा. इन बालों की जड़ समग्र पौधों ट्रांसजेनिक बीज का उत्पादन नहीं है, लेकिन वहाँ महत्वपूर्ण विशेषताएं है कि संयंत्र के अनुसंधान में इन समग्र बहुत उपयोगी पौधों के एक नंबर रहे हैं. सबसे पहले, एक व्यापक रेंज मेजबान के साथ ए, rhizogenes कई संयंत्र प्रजातियों, विशेष रूप से dicots को बदलने प्रजाति की एक किस्म में जेनेटिक इंजीनियरिंग की अनुमति कर सकते हैं. दूसरा, ए rhizogenes ऊतकों और explants सीधे संक्रमित, परिवर्तन करने के लिए पहले कोई ऊतक संस्कृतियों समग्र पौधों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, उन्हें बदलने अड़ियल संयंत्र प्रजातियों के लिए आदर्श बना रही है. इसके अलावा, ट्रांसजेनिक जड़ ऊतकों हफ्तों के एक मामले में उत्पन्न किया जा सकता है. Medicago truncatula के लिए, हम के रूप में कम के रूप में तीन हफ्तों में ट्रांसजेनिक जड़ों को बनाए रखने, सामान्य पुष्प डुबकी Arabidopsis परिवर्तन की तुलना में तेजी से कर सकते हैं. कुल मिलाकर, बालों की जड़ समग्र संयंत्र प्रौद्योगिकी एक बहुमुखी और उपयोगी उपकरण के जीन के कार्यों का अध्ययन और जड़ से संबंधित phenotypes है. यहाँ हम प्रदर्शन कैसे बालों की जड़ समग्र पौधों एम. मुश्किल से परिणत प्रजातियों संयंत्र rhizobium बातचीत और nodulation का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है truncatula.

Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक मॉडल फली प्रजातियों एम. में किया गया है बालों की जड़ समग्र पौधों उत्पन्न किया truncatula. इसी तरह के प्रोटोकॉल कम से कम आठ संयंत्र 1-4 प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया गया है. हम एम. इस्तेमाल किया truncatula बालों की जड़ समग्र पौधों को जड़ और गिरह के विकास में जीन के कार्यों का अध्ययन करने के लिए. प्रोटोकॉल चार वर्गों में विभाजित था: 1) संयंत्र की तैयारी सामग्री, 2) बालों की जड़ समग्र पौधों पैदा; 3) सहजीवी Rhizobia संक्रमण है, और 4) ट्रांसजेनिक जड़ पहचान. हम द्विआधारी पौधों में समग्र ट्रांसजेनिक जड़ 3 स्क्रीनिंग के लिए एक पत्रकार के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन (GFP) युक्त वेक्टर का इस्तेमाल किया. एंटीबायोटिक दवाओं के आधार पर चयन करने के लिए तुलना में, GFP आधारित स्क्रीनिंग तेज़, आसान और सस्ती है. हमारे निर्माण में ईआर अभिव्यक्ति अनुकूलित GFP जीन सुपर ubiquitin प्रमोटर, जो ट्रांसजेनिक जड़ों में मजबूत विधान GFP संकेतों द्वारा संचालित है, ट्रांसजेनिक और गैर ट्रांसजेनिक जड़ों के बीच आसानी से भेद की अनुमति.

1. संयंत्र सामग्री की तैयारी

  1. एम. truncautla बीज एक ग्रीनहाउस में बड़े पौधों (50% सापेक्ष आर्द्रता, 16 / 8 घंटे प्रकाश / अंधेरे, 22/18 ° सी दिन रात / तापमान) से harvested रहे हैं. परिपक्व बीज 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता
  2. 10 मिलीलीटर केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड (95-98%, सिग्मा Aldrich, MO) में लगभग 100 बीज आवधिक झटकों के साथ 10 मिनट के लिए scarified हैं.
  3. बीज कोमल आंदोलन के साथ बाँझ पानी के साथ 5-7 बार rinsed हैं.
  4. बीज तो कमरे के तापमान पर पानी में 6 घंटे के लिए भिगो 4 में रखा डिग्री सेल्सियस 36-48 घंटे के लिए अंकुरण सिंक्रनाइज़ करने के लिए.
  5. लगभग 20-30 बीज नम फिल्टर एक पेट्री डिश में रखा कागज़ों पर फैले हुए हैं. वे 22 पर रखा जाता है ° सी, 16 / 8 घंटे / प्रकाश अंधेरे चक्र, और 40 के साथ μmol.m -2 एस -1 प्रकाश तीव्रता, 5-6 दिनों के लिए .
  6. अंकुरित seedlings मिट्टी में स्थानांतरित कर रहे हैं और एक महीने के लिए ग्रीन हाउस में रखा है.

2. रोंआर रूट समग्र संयंत्रों उत्पन्न

  1. बाइनरी ब्याज की जीन ले जाने constructs में तब्दील किया गया मानक प्रोटोकॉल का उपयोग rhizogenes. हम इंजीनियर द्विआधारी एक मार्कर है कि ट्रांसजेनिक ऊतकों की स्क्रीनिंग की सुविधा के रूप में GFP जीन युक्त वैक्टर का एक सेट है. ये वैक्टर विभिन्न प्रमोटरों होते हैं और सभी गेटवे अभिव्यक्ति या लक्षित 3,5 जीन का मुंह बंद के लिए क्लोनिंग साइटों (Invitrogen, Carlsbad, CA).
  2. ए rhizogenes 50ml उपयुक्त एंटीबायोटिक चयन के साथ 28 पर लेग मध्यम ° 16-24 घंटे के लिए सी में सुसंस्कृत है.
  3. बैक्टीरिया एकत्र कर रहे हैं और 600 आयुध डिपो के अंतिम एकाग्रता के लिए फिर से निलंबित कर दिया = नाइट्रोजन मुक्त संयंत्र पोषक तत्व समाधान (टेबल 1 और 6) में 0.3.
  4. लगभग 3 3 सेमी के प्लग में बालों की जड़ उत्थान, एक निष्फल समर्थन मैट्रिक्स ("रॉक ऊन, Hummert इंटरनेशनल, पृथ्वी सिटी, MO) का समर्थन करने के लिए काट रहा है. हम एक पेट्री डिश में 4 प्लग जगह है.
  5. प्रत्येक एक पिपेट टिप का उपयोग प्लग के शीर्ष पर एक छेद poked explants की प्रविष्टि को सुविधाजनक बनाने के ए. rhizogenes (5 एमएल) प्रत्येक प्लग करने के लिए जोड़ा है.
  6. 2-3 कक्षा कलियों के साथ एक गोली मार अनुभाग एक तिरछा कटौती द्वारा excised है. explant फिर प्लग में डाला है, और 22 डिग्री के बारे में तीन सप्ताह के लिए सी हो. हम पहले 10 दिनों के लिए पानी के बिना Medicago explants रखने तब उन्हें पानी 5 मिलीलीटर नाइट्रोजन मुक्त समाधान जब आवश्यक के साथ. हमने पाया है कि शिखर meristem हटाने आकस्मिक जड़ों के गठन में कमी हो सकती है.

3. सांकेतिक Rhizobia संक्रमण (Sinorhizobium Meliloti)

  1. तीन सप्ताह के बाद, कुछ आकस्मिक जड़ों रॉक ऊन से उभरेगा. बालों की जड़ समग्र पौधों रेत या vermiculite (निष्फल) को हस्तांतरित रॉक ऊन के साथ या बिना. वे ग्रीन हाउस में 22 बजे बड़े हो रहे हैं डिग्री सेल्सियस, 16 / 8 घंटे / प्रकाश अंधेरे चक्र, और 300 -2 μmol.m -1 एक और सप्ताह के लिए प्रकाश की तीव्रता .
  2. पहले rhizobia संक्रमण, एस. meliloti 1201 50 मिलीलीटर खमीर निकालने mannitol 30 डिग्री सेल्सियस (2 टेबल, और 6,7) पर 7 दिनों के लिए मध्यम में सभ्य है .
  3. फिर से निलंबित कर दिया rhizobia कोशिकाओं 600 आयुध डिपो की एक अंतिम एकाग्रता = 0.08 नाइट्रोजन का उपयोग कर मुक्त पोषण समाधान के लिए पतला कर रहे हैं . एक 10 मिलीलीटर एस के ताजा निलंबन meliloti प्रत्येक समग्र संयंत्र के लिए लागू किया गया था गुत्थी गठन प्रेरित.

4. ट्रांसजेनिक रूट पहचान

  1. Rhizobia टीका के बाद दो सप्ताह, समग्र पौधों पानी में धोने के द्वारा निहित हैं. जड़ें आसानी से पानी में रेत या perlite से अलग किया जा सकता है.
  2. हम एक यूवी खुर्दबीन (SMZ1500 Nikon, 460 500nm उत्तेजना, Dichroic 505nm, 510nm से अधिक बैरियर) के तहत बालों जड़ों की जगह है. ट्रांसजेनिक जड़ों GFP सकारात्मक रहे हैं और आकस्मिक जड़ें नकारात्मक GFP हैं. हम तो जड़ों accordin इकट्ठाछ GFP संकेत, और गुत्थी संख्या गिनती, रूट लंबाई को मापने के लिए, और पार्श्व रूट घनत्व की गणना. GFP नकारात्मक जड़ों को नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है.

5. प्रतिनिधि नतीजे

हमारे प्रयोग में, नए बालों की जड़ों explants से के बाद 2-3 सप्ताह में पुनर्जीवित innoculation rhizogenes. यूवी खुर्दबीन के तहत, ट्रांसजेनिक GFP जीन ले जाने जड़ें मजबूत हरी प्रतिदीप्ति (चित्र 1) दिखाते हैं . पुनर्जीवित और जड़ों GFP सकारात्मक जड़ों के भाग की राशि explants और समग्र plants.On औसत के विकास पर्यावरण की शर्तों पर निर्भर करता है, उत्पादन जड़ों की 25% ट्रांसजेनिक बालों 3 जड़ों परिवर्तन दक्षता, 1) को बढ़ाने के थे. प्लास्टिक कवर कयामत, के रूप में वीडियो पर दिखाया गया है, पहले कुछ दिनों के लिए विकास ट्रे में नमी बनाए रखने के लिए पर्याप्त है, और पौधों केवल पहले कुछ दिनों में बहुत कम पानी की आवश्यकता होती है. अत्यधिक पानी बालों की जड़ गठन के लिए हानिकारक है,) 2 Agrobacterium innoculant की एकाग्रता परिवर्तन के लिए महत्वपूर्ण है . कोशिकाओं की अत्यधिक मात्रा में बालों की जड़ गठन या गुत्थी गठन के लिए मददगार नहीं हैं. गुत्थी गठन के लिए, पानी समाधान के लिए नाइट्रोजन मुक्त होने की जरूरत है, अन्यथा, कुछ पिंड फार्म का होगा.

बालों की जड़ समग्र पौधों सामग्री के रूप में शुरू cotyledons या entact seedlings का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है. प्रोटोकॉल के ऊपर केवल मामूली संशोधनों अन्य 8 ऊतकों से बालों जड़ों उत्पन्न ncessary हैं. महत्वपूर्ण बात है, प्रत्येक बालों की जड़ एक स्वतंत्र परिवर्तन घटना है. इसलिए, एक समग्र संयंत्र में मनाया phenotypes कई transforamtion घटनाओं है कि repetitions के द्वारा कई समग्र पौधों में पुष्टि होने की जरूरत की राशि

चित्रा 1
चित्रा 1. ए ट्रांसजेनिक जड़ों बालों जड़ों से हल कर सकते हैं. बी नोड्यूल्स बालों की जड़ समग्र पौधों में गठन किया गया है हम 4 सप्ताह पुराने एम. रखा . truncatula यूवी खुर्दबीन और GFP सकारात्मक जड़ों के तहत बालों की जड़ पौधों को आसानी से पहचाना जा सकता है है. (लाल तीर: GFP जड़, पीला तीर: गैर - GFP जड़)

स्टॉक g/200ml मिलीलीटर / शेयर लीटर
MgSO 4 0.7 एच 2 हे 12.3 2
CaCl 2 0.2 एच 2 हे 14.7 4
2 कश्मीर HPO 4 0.3 एच 2 हे 6.8 1
2 कश्मीर अतः 4 11 4
Fe 3 सीएल 0.6 एच 2 हे 0.49 2.5
सूक्ष्म पोषक नीचे देखें 1
सूक्ष्म पोषक प्रति लीटर जी
3 एच बो 3 0.142
4 MnSO एच 2 हे. 0.077
ZnSO 4 0.7 एच 2 हे ०.१७२५
CuSO 4 .5 एच 2 हे 0.037
4 NaMoO. एच 2 हे 0.024
2 CoCl. एच 2 हे .0025
4 NiSO 0.001

तालिका 1. पोषण Nitogen से मुक्त समाधान

K-2 HPO4 0.5g
NaCl 0.1g
MgSO 4 · 7 2 हे 0.2g
खमीर निकालें 0.4g
Mannitol 10g
= पीएच 6.8

टेबल 2 खमीर mannitol मध्यम निकालने (प्रति लीटर)

Discussion

बालों की जड़ समग्र संयंत्र उत्पन्न कई dicot प्रजातियों के लिए ट्रांसजेनिक सामग्री का बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए एक त्वरित और आसान तरीका है. हालांकि इस विधि ट्रांसजेनिक बीज का उत्पादन नहीं कर सकते, यह एक कुछ हफ्तों में ट्रांसजेनिक सामग्री का उत्पादन कर सकते हैं. विधि पौधों है कि ऊतक संस्कृतियों की स्थापना या स्थिर transformants पैदा करने में कठिनाई है के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है. वर्षों में, हम इस तकनीक का इस्तेमाल किया है जीन कार्यों, प्रमोटर कार्यों, microRNAs, जड़ और पार्श्व रूट विकास, रक्षा और अजैव तनाव प्रतिक्रियाओं, nodulation और अन्य सहजीवी प्रक्रियाओं, हार्मोन प्रतिक्रियाओं, चयापचय प्रोफाइलिंग, जीन रूपरेखा, प्रोटिओमिक विश्लेषण, और अध्ययन अन्य जैविक प्रक्रियाओं. प्रोटोकॉल और मजबूत replicable है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

लेखकों डॉ. क्रिस टेलर (ओहियो राज्य विश्वविद्यालय) करने के लिए हमारी प्रयोगशाला और डीआरएस बालों की जड़ प्रौद्योगिकी शुरू करने के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. सेंथिल सुब्रमण्यम (दक्षिण डकोटा स्टेट यूनिवर्सिटी), जुआन झांग (Ludong विश्वविद्यालय, शेडोंग चीन) के प्रोटोकॉल में सुधार लाने के लिए. हम भी इस वीडियो बनाने में मदद करता है के लिए धन्यवाद डॉ. Hao चेंग (नानजिंग कृषि विश्वविद्यालय). इस काम के हिस्से में (डे SC0001295) डो, NSF (MCB 0,923,779) और USDA (2010-65116-20514) से ओए अनुदान द्वारा समर्थित है

References

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