PCR optimizado basado en la detección de Mycoplasma

Biology
 

Summary

El kit de detección de Mycoplasma LookOut PCR utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que se ha establecido como el método de elección para la mayor sensibilidad en la detección de contaminación por Mycoplasma, Acholeplasma y Ureaplasma en cultivos celulares y cultivo celular otros derivados biológicos.

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Dobrovolny, P. L., Bess, D. Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma. J. Vis. Exp. (52), e3057, doi:10.3791/3057 (2011).

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Abstract

El mantenimiento de líneas celulares libres de contaminación es esencial para la investigación celular. Entre las mayores preocupaciones de los contaminantes son la contaminación por micoplasma. A pesar de micoplasma no suelen matar a las células contaminadas, son difíciles de detectar y pueden causar una variedad de efectos sobre las células cultivadas, incluyendo la alteración del metabolismo, se redujo la proliferación y aberraciones cromosómicas. En resumen, la contaminación por micoplasma compromete el valor de las líneas celulares de proporcionar información rigurosa para la investigación en ciencias biológicas.

Las fuentes de contaminación por micoplasma en el laboratorio son muy difíciles de controlar por completo. Como ciertas especies de micoplasmas se encuentran en la piel humana, pueden ser introducidos a través de una técnica aséptica pobres. Además, pueden provenir de los suplementos contaminados, tales como el suero bovino fetal, y lo más importante de otros cultivos de células contaminadas. Una vez micoplasmas contaminantes de una cultura, que pueden propagarse rápidamente a contaminar otras áreas del laboratorio. Estricto cumplimiento de buenas prácticas de laboratorio, tales como una buena técnica aséptica son fundamentales, y las pruebas de rutina para micoplasma es muy recomendable para el éxito del control de la contaminación por micoplasma.

PCR basado en la detección de micoplasma se ha convertido en un método muy popular para el mantenimiento rutinario línea celular. Métodos basados ​​en PCR de detección son muy sensibles y pueden dar resultados rápidos, lo que permite a los investigadores para responder rápidamente a aislar y eliminar la contaminación una vez que se detecta en comparación con el tiempo necesario utilizar las técnicas microbiológicas. El kit de detección de Mycoplasma LookOut PCR es muy sensible, con un límite de detección de sólo dos genomas por microlitro. Tomando ventaja de la polimerasa de ADN altamente específicas JumpStart Taq y un primer diseño patentado, los falsos positivos se reducen considerablemente. El práctico formato de 8 tubos, tiras pre-recubiertos con dNTPs, primers y asociados ayuda a aumentar el rendimiento para satisfacer las necesidades de los clientes con grandes colecciones de líneas celulares.

Dada la extrema sensibilidad del kit, el gran cuidado se debe tomar para prevenir la contaminación accidental de las muestras y reactivos. El protocolo de paso a paso se demuestra destaca las precauciones y prácticas necesarias para la detección de micoplasma fiable. También mostrar y discutir los resultados típicos y su interpretación. Nuestro objetivo es asegurar el éxito de los investigadores que utilizan el kit de detección de Mycoplasma LookOut PCR.

Protocol

1. Detección de Mycoplasma

  1. Sobrenadantes de cultivo celular se puede probar directamente, o la muestra se puede preparar para su uso en una fecha posterior. Para prepararse para su uso posterior a cabo 100 l de sobrenadante en un tubo estéril de amplificación y se incuba a 95 ° C durante 5 minutos. Una vez que se completa la muestra se puede almacenar a 2-8 º C durante un máximo de una semana. Justo antes de ejecutar el centrifugar brevemente muestra (5 segundos) para sedimentar los restos celulares.
  2. Para preparar las muestras para PCR, determinar el volumen total de ADN Taq polimerasa Jumpstart / rehidratación búfer necesario para las reacciones. Vamos a preparar cinco reacciones total. Cinco reacciones requerirá 2.5μl de Taq y 114.5μl de tampón de rehidratación. Este contendrá un mínimo de una unidad de Taq por reacción y 22.5μl de tampón de rehidratación por reacción de la muestra y el control negativo más 24.5μl de rehidratación de amortiguación para el control positivo. 1 unidad de ADN polimerasa por reacción, debe añadirse a la cantidad adecuada de tampón de rehidratación. Esto va a variar con la Taq utilizado.
  3. Coloque el volumen calculado de la ADN polimerasa Taq en un tubo de microcentrífuga limpio y seguir con el volumen calculado de tampón de rehidratación. La ADN polimerasa / rehidratación buffer se debe mezclar suavemente agitando el tubo. Esta mezcla no debe ser vortex.
  4. Para preparar el control negativo y las muestras de uso de los tubos de reacción transparente en el kit. Los tubos de reacción en el kit ya contienen la nuclueotides, cebadores y el ADN de control interno. 23 l de mezcla de Jumpstart Taq ADN polimerasa buffer / rehidratación, como se prepara en los pasos anteriores, debe ser colocado en cada uno de los controles negativos y los tubos de muestra. Añadir 2 l de agua libre de ADN con el control negativo y añadir 2 l de la muestra a cada uno de los tubos de muestra y la etiqueta. Mezclar el contenido de revoloteo de los tubos. Contenido no debe ser vortex.
  5. Para preparar el control positivo utilizar los tubos de reacción de color rosa en el kit. Los tubos de reacción en el kit ya contienen la nuclueotides, cebadores y el ADN de control interno. Añadir 25 l de mezcla de Jumpstart Taq ADN polimerasa buffer / rehidratación, como se prepara en los pasos anteriores, para los tubos de reacción y la etiqueta. Mezclar el contenido de revoloteo de los tubos. Contenido no debe ser vortex. Incubar el control negativo, control positivo y los tubos de la muestra a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  6. Para el PCR a tener lugar las muestras deben ser colocadas en un termociclador. Al utilizar JumpStart Taq un paso de activación no es necesaria. Coloque los tubos de reacción en el termociclador. Los ciclos deben establecerse de la siguiente manera: 94 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 40 segundos. Estos ciclos se ejecutará 40 veces.
  7. Una vez que los ciclos de PCR se han completado las muestras deben ser enfriados hasta 4.8 ° C por dejarlas fuera del termociclador y colocarlos en hielo. Cuando se hayan enfriado las muestras que serán cargados en el gel de agarosa para electroforesis. De carga de gel y colorantes no son necesarios puesto que ya están presentes en los tubos de reacción. Directamente carga de 8 l para cada PCR en un carril separado. Detener la electroforesis después de la migración de 2,5 a 3,0 cm.

2. Resultados representante

El control negativo debe mostrar una banda de aproximadamente 481 pb. Esto se puede ver en la columna de control negativo en la electroforesis en gel que se muestra al principio del vídeo. La ausencia de la banda de control negativo en 481 puntos básicos es un buen indicador de que la actividad de la polimerasa no se sufficienttaq utilizado no fue lo suficientemente sensible.

Mycoplasma muestras positivas se muestran las bandas en el rango de 270 ± 8 pb. La banda será pesada para muestras muy contaminadas y débiles de las muestras ligeramente contaminados. Las variaciones en la intensidad se puede ver en las columnas muestra positiva en la electroforesis en gel que se muestra al principio del vídeo. Todas las muestras contienen un control interno negativo para demostrar que el PCR dio como se esperaba. Es normal que la ausencia del control interno en muestras muy contaminadas.

Si no hay una banda en el rango positivo o una banda en el rango negativo en la muestra de esto es un buen indicador de que sus muestras están inhibidos. Si la muestra se inhibe los inhibidores de la PCR se pueden eliminar mediante la realización de una extracción de ADN.

Figura 1
Las bandas de la figura 1 amplicón relevantes:. Resultados de la detección de micoplasmas por PCR se muestran. El carril 2 es el control negativo, que debe mostrar una banda de aproximadamente 481 pb. La ausencia de la banda de control negativo en 481 puntos básicos es un buen indicador de que el utilizado taq no era lo suficientemente sensible. Mycoplasma muestras positivas se muestran las bandas en el rango de 270 + 8 pb, como se muestra en los carriles de 3 a 6. La banda se heavy para muestras muy contaminadas (calle 6) y débil para las muestras ligeramente contaminados (calle 4). Todas las muestras contienen un control interno negativo (481 pb) para demostrar que el PCR dio como se esperaba. Es normal que la ausencia del control interno en muestras muy contaminadas.

Discussion

Debido a la extrema sensibilidad de los kit, cuando se realiza correctamente el equipo debe dar resultados precisos que indica si la muestra tiene la contaminación por micoplasma. El kit ha sido optimizado para su uso con la polimerasa de ADN Taq JumpStart. Taqs se pueden usar otros en la preparación de las muestras, pero la banda de control interno en 481 pb, deben estar presentes para indicar la sensibilidad de la alternativa correcta taq. Es posible que las bandas positivas para exponer diferentes densidades en función del nivel de contaminación. Es posible observar la ausencia de la banda de control interno en muestras muy contaminadas. Precaución y utilizando la técnica adecuada en la preparación de las muestras para evitar la contaminación son fundamentales para la correcta. detección cuando se utiliza el kit de detección de Mycoplasma LookOut PCR.

Disclosures

Los autores son empleados de Sigma-Aldrich que producen los reactivos y las herramientas utilizadas en este artículo.

Acknowledgements

Financiado por Sigma-Aldrich

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma-Aldrich MP0035
JumpStart Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D9307
GenElute Blood Genomic DNA kit Sigma-Aldrich MP0030
Nunc amplification tubes Sigma-Aldrich T0447

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References

  1. Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines. Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).
  2. Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT). Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).
  3. Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques. Molecular and Cellular Probes. (2011).

Comments

1 Comment

  1. how may runs per kit provides the kit???What is the price?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 16, 2011 - 7:58 PM

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