无菌实验室技术:电镀方法

Published 5/11/2012
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Biology
 

Summary

媒体和试剂用于培养微生物的工作时,必须实行无菌技术,以确保污染降到最低。多种电镀方法通常用于隔离,传播,或列举细菌和噬菌体,所有这些都纳入程序,维护实验材料的无菌。

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Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. J. Vis. Exp. (63), e3064, doi:10.3791/3064 (2012).

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Abstract

微生物是创造无处不在实验室中的可能污染来源,无生命表面上。实验的成功依赖于科学家消毒工作台面和设备,以及防止接触表面非无菌消毒仪器和解决方案的能力。在这里,我们提出几个电镀经常在实验室中用于隔离,传播,或枚举微生物,如细菌和噬菌体的方法步骤。所有五个方法采用无菌技术,或程序,维护实验材料的无菌。描述的过程包括:(1)条纹电镀细菌培养分离单菌落,(2)倒入电镀,(3)传播电镀枚举可行的细菌菌落,(4)软琼脂覆盖隔离噬菌体和枚举斑块,( 5)副本电镀转移细胞从一个板块向另一个在相同的空间格局。这些程序可以在t他实验室长凳上,只要涉及非致病微生物菌种(生物安全等级1,BSL-1)。如果BSL-2有机体的工作,那么这些操作必须在生物安全柜。咨询微生物和生物医学实验室生物安全最新版本(BMBL)以及感染性物质的材料安全数据表 (MSDS),以确定生物危害的分类,以及问题中的微生物所需要的安全防范措施和防护设施。可从保持特定组织,如美国菌种保藏中心 (ATCC)的研究调查,公司,集合菌株和噬菌体股票。它被推荐用于学习各种电镀方法时,非致病性菌株。在本协议中所述的程序之后,学生应该能够:

  • 执行无contaminati电镀程序吴媒体。
  • 连胜电镀法分离单菌落。
  • 使用倒电镀和扩散电镀方法,以确定细菌的浓度。
  • 噬菌体时,执行软琼脂覆盖。
  • 细菌细胞转移到另一个使用副本电镀程序从一个板块。
  • 由于实验任务,选择适当的电镀方法。

Protocol

1。准备一个安全和无菌工作区

  1. 熟悉与微生物时,应采取所有实验室规则和安全注意事项。无论生物危害的分类,与微生物接触的所有材料被视为感染性废弃物处置前必须进行消毒。按照安全指引,按照体制环境健康和安全部门提供的,立即和妥善处置可能受污染的材料(生物危害)设立适当的废物容器。
  2. 消毒所有的工具,解决方案和电镀过程中使用它们之前的媒体。
  3. 清除所有材料实验室的长椅上塞满您的工作区。
  4. 用消毒剂清洁工作区,以尽可能减少污染。
  5. 成立本生灯和工作缓慢,仔细,故意在无菌区面积updra创建英尺的火焰。
    • 如果BSL-2生物体工作,成立了生物安全柜在您的工作空间。本生灯不能使用柜内,因为从火焰的热量会破坏其功能必不可少的空气流动。
  6. 排列无菌区附近的实验室长凳上的程序所需的所有用品。确保所有的材料有适当的标签。组织工作领域,最大限度地提高工作效率,避免不必要的运动,将最大限度地减少空气污染物的实验材料的曝光时间。
    • 在板凳上将本生灯到您的权利,。
    • 地方琼脂板或培养皿中,在您的左边。
    • 排列细胞培养,试管,烧瓶,并在该中心的板凳瓶。
    • 松开管,瓶和瓶帽,使他们可以轻松地用一只手在随后的操作打开。
  7. 用消毒肥皂和温水彻底洗手前处理微生物的水。

2。连续板程序:使用象限法的菌落分离

连胜板程序设计,通过简单的机械分离纯培养的细菌,或殖民地,从混合种群隔离。单一的殖民地组成的数以百万计的细胞或在琼脂平板上( 图1)集群中成长。一个单细胞,是一个殖民地,不像肉眼可见。从理论上讲,在一个殖民地的所有细胞都来自一个单一的细菌最初存入板,并因此被称为克隆,或基因完全相同的细胞群。

  • 细菌存在于各种形状和大小。例如,单个大肠杆菌细胞杆状,而2微米,宽0.5微米的平均长度链球菌细胞平均直径1微米的球形。一些细菌(苏CH E 大肠杆菌 )作为单细胞存在,而其他形成鲜明的关联模式。 链球菌 ,例如,生长在成对或形式链或细胞群。人们普遍认为,从一个单一细胞进行二分裂产生一个单一的殖民地,然而,这种假设是不自然存在的细菌对链,或群集或其他机制的鸿沟的真实。另外,如果有太多的细菌是镀金的,那么重叠的细胞可能发生,并增加了两个或两个以上的细菌引起这似乎是一个单一的殖民地的概率。为了避免这些并发症的描述或列举固体培养基上生长的细菌培养时,菌落被称为菌落形成单位(CFU)。

与连胜板的过程中,细胞的混合物在半固体琼脂的营养培养基的培养皿的表面等,越来越少的细菌传播细胞被存放在介质表面上相距甚远点,孵化后,发展成殖民地。将这里描述为从细胞混合物分离单菌落象限法。

  1. 连续电镀可以完成了许多不同的工具( 图2)。一个金属环,可以多次使用,并利用条纹电镀常规实验室菌株。一次性塑料循环,商业和使用较为普遍时,BSL-2菌株在生物安全柜工作。许多研究的科学家更喜欢使用一次性的,预先消毒的木棍或扁牙签条纹电镀。这是一种廉价的替代品的一次性塑料循环,如土壤环境样品中可能含有孢子形成的细菌时,特别有用。
    • 一次性预消毒棍棒和牙签不需要用本生灯周四被火烧小号孢子形成的细菌和实验室表面或与孢子的琼脂板的交叉污染,防止不必要的雾化。
  2. 标签周围的琼脂平板上,至少你的姓名,日期,生长介质的类型,和机体类型介质上镀底部(不盖)的边缘。
    • 没有盖子,预温至室温连胜电镀前的冷凝板必须完全干燥。如果储存在4°C板,除去他们几个小时甚至前一天。传播他们小,不超过2-3板交错堆叠,让他们干。
  3. 连胜板将接种的样本可能是一个悬浮细胞在肉汤或琼脂平板从另一个现有的殖民地。开始,它被推荐使用,只有一个样本接种单一板块。为了节省时间和材料,单盘可用于多个桑普LES,但只有当你成为精通裸奔盘子上的一个样本。
  4. 第一象限,拿起样品和介质表面使用一种快速,平稳,背部和往复运动(面板图3)一季度散布。提起从板凳上倒板的下半部分。移动环,棒,牙签,来回多次琼脂表面从边缘到中心的板块。
    • 如果接种是一种细胞悬液,获得一个金属环或用移液器5至10μL一个loopful。务必漩涡或漩涡的细胞悬液消除电镀等分之前。使用无菌操作技术,同时执行这一步,燃烧后取出接种前不仅循环,但也瓶或管的边缘。另外,不要触摸循环或桶的移液器管或瓶的两侧。如果移液接种免除到的approp上的细胞悬液riate上板的地方,然后用一个循环,棒或牙签遍布该板块的第一象限。
    • 如果接种是一个殖民地,从另一个板块,轻轻触摸循环的殖民地,棒或牙签,然后蔓延在第一象限的板块。务必触摸殖民地之前冷却的金属环。为了确保循环是不是太热,轻轻触摸它琼脂平板上,在指定的地方没有裸奔会发生。只有少数细胞都需要从殖民地,而不是整个殖民地。
    • 如果用一个金属环,火焰使用本生灯前板( 图3中的 B小组)取得的接种。约3-4英寸的循环启动,线与蓝色锥的尖端,在火焰中最热的部分。应该成为赤热的金属。移动线,使火焰接近循环。此操作防止细菌从以前使用的环路上留下的气雾。
    • 火焰山杀死细菌(虽然不是孢子)和热空气对流,防止其他空气污染物上的金属丝在随后的操作解决。
    • 如果使用无菌扁牙签,保持较窄的一端轻轻地,你的拇指和无名指之间,在10至20°角中期,使用广角端连胜象限。如果使用循环或木棍,按住它像铅笔在相同的角度。不按这么辛苦,环,棒或牙签挖成的琼脂。
  5. 完成后的第一象限,反转和设置到盖在板凳上的背面板。棒或牙签或重新火焰处理的金属环,在第4步中所述。
  6. 打开培养皿中90连胜的第二象限。提起倒板的下半部分,从板凳上,然后按循环,坚持到最后连胜结束不久的第一象限或牙签。使用背面和来回的模式,跨越拉斯维加斯在第一象限的条纹丁字裤的一半,然后移动到空的第二象限。反转,并定下在板凳上板回盖子,一旦第二象限充满。
    • 循环,棒或牙签不应该返回到原接种大部分沉积在第一象限的条纹上半年。
    • 一种新的塑料环,用木棒或牙签应该用于每个象限。
  7. 第三和第四象限重复步骤#6的两倍。
    • 务必处置棒或牙签或重新火焰每个象限之间的金属环。
    • 避免裸奔第四象限时,要到第一象限。
  8. 孵育盘倒挂,所以盖子上积累的凝结,不滴水的殖民地。

3。倒入盘中的程序:混合样品中细菌细胞计数

这种方法通常是使用d来计算混合样品中微生物的数量,这是添加到熔融琼脂培养基,其凝固前。均匀分布在整个固体培养基时适当稀释样品镀殖民地的过程的结果。这种技术被用来执行可行的平板计数琼脂和琼脂表面上的单盘内的菌落形成单位的总数,其中枚举。可行的平板计数提供科学家一个标准化的手段,产生生长曲线,计算样品镀管细胞的浓度,并探讨各种环境或细菌细胞的存活或生长速度生长条件的影响。

  1. 标签左右(不盖)与至少您的姓名,日期,生长介质的类型,和生物体的类型,被添加到融化的琼脂培养基无菌,但空的培养皿底部的边缘。
    • 如果平台,包括稀释因子ING 连续稀释 ,或一系列的反复稀释,导致系统在样品中的细胞浓度减少。连续稀释准备是必要的,如果样品中的细胞数量超过琼脂平板上,在统计学意义的范围是30至300 CFU的能力。如果有超过300 CFU的盘子上,然后将殖民地拥挤和重叠。
  2. 获得含有18毫升溶化琼脂培养基管。
    • 应取消琼脂培养基试管和预先灭菌,高压灭菌器。在同一天,它是一个实验的需要,应在蒸锅30分钟,然后转移到55℃水浴融化琼脂。应只有尽可能多的实验需要的琼脂融化,因为它不能被重新使用。
    • 浇注板的前10分钟,融化的琼脂管应转移从55°C水浴热块上的劳动atory工作台设置在48°C。琼脂一旦达到这个温度,它是准备倒。如果琼脂是太热了,样品中的细菌可能会被杀害。如果琼脂是太爽了,媒体可能是块状一次凝固。
  3. 得到你的样品,这应该是一个肉汤培养或暂停从殖民地到缓冲区或生理盐水混合细胞产生的细胞。
    • 可能源于一系列的单个样品的稀释样品。
    • 镀的样品量应介于0.1和1.0毫升。
  4. 打开空培养皿的盖子,并免除中间板(面板图4)您的样品。盖上盖子。
    • 整个过程中使用无菌技术。
    • 使用的血清吸管或微量移液器,将您的样品板。样品流量控制,因此它不会飞溅板。
  5. 从浴缸里取出了帽融化的琼脂的E,并通过开管通过本生灯火焰的边缘。
  6. 打开包含您的样品的Petri菜盖和琼脂倒在仔细( 图4中的 B小组)。盖上盖子,然后轻轻摇动板与琼脂混合样品。
  7. 允许琼脂彻底巩固之前反相板孵化。

4。扩散板程序:离散菌落计数板,富集,选择,或筛选的形成

这种技术通常被用来在一个小的样本量,分散在琼脂平板表面,形成离散分布在琼脂表面均匀地镀适当的细胞浓度时的殖民地中独立的微生物。此外,使用这项技术可行的平板计数,菌落总数,其中星上形成单位乐板枚举,用来计算从该样本被镀管细胞的浓度,扩散电镀日常使用中富集,选择和筛选实验。这三个实验的结果通常是相同​​的板计数,离散殖民地分布在整个琼脂表面形成的。然而,我们的目标是,以确保所有活细胞形成菌落。相反,只有那些细胞内的人口,有一个特定的基因型增长。如果最终目标是殖民地隔离作进一步的分析,因为菌落生长在琼脂表面上通俗易懂,过程可能会受聘在枚举实验倒板技术的扩散板,而他们成为镶嵌在琼脂倾板程序。

在这里描述的扩散板程序有两种策略。第一个(方法A)涉及使用一个转盘,玻璃或金属ROD形像曲棍球棒。第二个(方法B),简称为“科帕卡巴纳方法”,涉及摇预消毒的玻璃珠。既方便,甚至蔓延整个琼脂表面的细胞。

方法A:传播与一个转盘,玻璃或金属棒电镀

  1. 标签周围的琼脂平板上,至少你的姓名,日期,生长介质的类型,和机体类型介质上镀底部(不盖)的边缘。
    • 如果电镀系列稀释包括稀释因子。
    • 没有盖子,预温至室温蔓延电镀前的冷凝板必须完全干燥。如果储存在4°C板,除去他们几个小时甚至前一天。传播他们小,不超过2-3板交错堆叠,让他们干。
  2. 中心转盘上板( 图5)。
  3. 获得你ŕ样品,这应该是一个肉汤培养或暂停从殖民地到缓冲区或生理盐水混合细胞产生的细胞。
    • 可能源于一系列的单个样品的稀释样品。
    • 镀的样品量应介于0.1和0.2毫升。
  4. 打开培养皿的盖子,并分配到的琼脂中心的样品。盖上盖子。
    • 整个过程中使用无菌技术。
    • 使用移液器将您的样品板。样品流量控制,因此它不会飞溅板。
  5. 浸入到70%(V / V)乙醇的烧杯,玻璃棒或金属棒(也称为吊具)。
    • 注意:不要蘸酒精烧杯热吊具。
    • 乙醇必须触及底部吊具和干的第一英寸。
  6. 排水和通过一个包子的火焰点燃多余的乙醇连接刻录机。
    • 火焰应旅行所接触到的乙醇,然后迅速扑灭吊具和干的长度。
    • 应烧杯乙醇着火,不要惊慌!在烧杯中放置一个玻璃盖,将迅速扑灭大火。
  7. 琼脂平板上的盖子打开,在你的左手,用拇指和食指拿着盖子。沿靠近篮筐的边缘,它通过触摸琼脂冷却吊具。
    • 请勿触摸的细胞,加入琼脂。热吊具将杀死细胞。
  8. (同时仍持有的琼脂平板上的盖子),用左手慢慢旋转转盘。
    • 虽然最好避免使用,如果你必须把盖子,将面临在的本生灯无菌领域消毒表面。有盖朝上,有一个更大的污染的物体或手的动作的机会,创造气流导致下降到盖子的内表面的微生物和尘埃粒子。
  9. 用你的右手,轻轻地按住吊具琼脂表面上,并逐渐遍布整个板样品均匀。整个板块的移动吊具,来回转盘转动。
  10. 允许样品吸收彻底颠倒板孵化前(至少5分钟)。

方法B:扩电镀玻璃珠:“科帕卡巴纳法”

  1. 标签周围的琼脂平板上,至少你的姓名,日期,生长介质的类型,和机体类型介质上镀底部(不盖)的边缘。
    • 如果电镀系列稀释包括稀释因子
  2. 琼脂平板上的盖子打开,在你的左手,用拇指和食指拿着盖子。然后打开玻璃管或瓶含预消毒GL屁股珠。用你的右手,阻燃管或瓶的边缘,然后小心地免除琼脂平板上10-12无菌玻璃珠( 图6)。板盖,火焰管或瓶的边缘再次关闭前盖更换和设置它放在一边。
    • 轻轻倒出管或瓶以上的琼脂几厘米的珠子,使珠不反弹的培养皿。
    • 使用,直径4毫米的玻璃珠。消毒在121°C,在玻璃瓶或试管中反应釜上的干燥周期为30分钟(重力设置)。
    • 珠,而不是使用一个吊具的优势之一是重复燃烧所需的乙醇没有打开容器。
  3. 琼脂平板上的盖子打开,并分配到的琼脂中心的样品。盖上盖子。
    • 整个过程中使用无菌技术。
    • 分装100至150μL每盘样品。这量甚至将促进细胞的扩散。使用移液器将您的样品板。样品流量控制,因此它不会飞溅板。
  4. 传播横跨6至7倍的琼脂表面轻轻晃动的珠子样品。为了确保细胞均匀分布,使用水平晃动议案。
    • 不要漩涡的珠子,否则所有的细胞会结束时,板的边缘。
    • 提示:如果处理得当,程序听起来像“惊天马拉卡斯”。
  5. 旋转板60°水平再次撼动6至7倍。
  6. 旋转板60°第二次和水平再次动摇。现在,你应该达到甚至整个琼脂表面的细胞扩散。
  7. 完成蔓延电镀时,样品应吸收和琼脂表面应干燥。到显着的集合,其中包含10%含氯漂白剂的烧杯,倒入污染的珠子。
    • 别丢弃在垃圾桶里的珠子!所用的珠子会被冲洗和灭菌,重新消毒重复使用。
    • 注:如果摇三次后仍然是湿的琼脂表面,使板几分钟坐下来允许液体被吸收的琼脂,然后重复步骤#4-6,直到出现板面干。
  8. 倒置孵化板。

5。软琼脂覆盖程序:形成斑块(斑块检测噬菌体的分离与计数)

这种方法通常用于检测和量化噬菌体(噬菌体),或细菌病毒,范围在100至200纳米大小。电子显微镜是需要看个人的噬菌体颗粒。然而,存在感染的噬菌体颗粒可以检测琼脂平板上的斑块图7A)。噬菌体不能复制的细菌细胞以外的主机,所以传播1三维检测需要镀前混合噬菌体和宿主细胞在一起。为软琼脂覆盖过程中,体积小,一般在50μL到200μL范围噬菌体悬浮液,配发到管含有约10 8个细菌(宿主细胞)被均匀地分散在2.5-3.0毫升软(0.5至0.7%[W / V),营养琼脂融化。由此产生的混合物倒在硬盘(1.5至1.9%[W / V)营养琼脂平板表面。板震撼,足以确保在软琼脂覆盖整个硬盘琼脂表面。然后板被放置在一个水平面上,直到顶端琼脂层有时间巩固和随后可放置在孵化器。

随着时间的推移,阴天悬挂的细菌细胞,称为草坪 ,成为整个软琼脂培养基( 图7B)可见。斑块形成噬菌体感染细菌细胞之一,在次复制E细胞,然后溶解细胞释放子代噬菌体多达100个(又名突发大小 )。软琼脂扩散到新的噬菌体颗粒,细菌感染裂解细菌细胞周围地区。经过多个周期的感染和裂解,阴天,在软琼脂细菌细胞悬液消失,留下了结算的区域,被称为牌匾。每个斑块包含超过10 9噬菌体颗粒,所有的基因完全相同的原感染的噬菌体颗粒。因为从一个单一的噬菌体粒子产生斑块,导致斑块形成单位(PFU),可算和原的浓度,或滴度的噬菌体悬液,可以计算。这种类型称为斑块检测的实验,也提供科学家产生一步生长曲线,调查宿主范围的特异性,并转导的细菌细胞遗传实验的标准化手段。

  1. <>准备指标细菌:细菌宿主菌成倍增长的文化需要准备软琼脂覆盖实验。每个主机都有其自身的成长需求。需要为每块板之间的暂停指示菌0.3毫升和0.5毫升。如果一个指示菌瓶准备(例如,25毫升),文化应分为小等分(例如,5毫升到无菌的螺丝帽管配药等分),以尽量减少交叉污染的可能性。管可保持冰(在4°C),直到准备在实验中使用。使用无菌操作技术,接种无菌营养肉汤,然后孵育根据菌株规范。吃剩的文化应该被丢弃在这一天结束。
  2. 准备吸附管放置在机架的两个无菌的离心管。标注“噬菌体”第一管和第二管“控制”的盖子盖。
    • 典型LY 系列稀释的噬菌体裂解制备和镀额外的离心管中,在这种情况下,将增加在机架和标有稀释因子。
    • 噬菌体的股票,应当从单一斑块新鲜和保存在4°C分解噬菌体颗粒,股票应热身环境温度进行实验前。
    • 噬菌体股票应轻轻处理 - 不要大力涡或吸管。
  3. 第一管加入50μL噬菌体样品,然后加入50μl噬菌体缓冲区的第二管,这将作为一个斑块检测的阴性对照。
    • 整个噬菌体和细菌的所有操作使用无菌技术。
  4. 接下来,添加500μl到每个吸附管的指示菌。
    • 细菌细胞将落户管底部,如果长时间坐在冰或替补。如果文化不能混为一谈编前去除实验等份,没有足够的细菌细胞将被转移到吸附管。必须有足够数量的检测斑块(即,草坪)在软琼脂形成的菌落。用旋涡混合器轻轻重新成均匀悬浮等份转移到吸附管前暂停的指示菌。
  5. 轻轻弹管,混合细菌细胞和噬菌体。
  6. 孵育15-20分钟噬菌体/细菌混合物,在适当的温度指标应变(不超过30分钟)。
  7. 准备营养软琼脂及硬琼脂平板:虽然吸附发生,地方两个软琼脂管在实验台的加热块(以前融化,并储存在55°C)设定在46-48°C。
    • 融化的软琼脂加热块的温度为10-15分钟必须是平衡的。如果熔化的软洋菜坐在长于15分钟,它就会开始巩固和硬盘上的琼脂倒时会形成团块。如果熔化的软琼脂坐不到10分钟,它会太热添加到噬菌体/细菌混合物时,宿主细胞死亡之前电镀。因此,可能不会形成草​​坪和可能很少或没有斑块检测。
    • 如果电镀系列稀释的噬菌体裂解准备额外的软琼脂管。
  8. 标签周围的养分硬琼脂平板至少您的姓名,日期,生长介质的类型,和“噬菌体”或“控制”对应的吸附管板底部的边缘(不盖)。
    • 包括标有电镀系列稀释的稀释倍数,如果其他板块。
    • 硬琼脂板必须完全干燥,不上盖子,预温至室温之前加入软琼脂凝结。如果储存在4°C板,除去他们几个小时甚至达y前。传播他们小,不超过2-3板交错堆叠,让他们干。硬琼脂层中过多的水分会导致软琼脂稀释,使噬菌体斑块形成过程中更容易通过软琼脂扩散。因此,斑块大小会增加。
  9. 板吸附管一次如下:使用P1000的移液器无菌转移噬菌体/细菌混合物(约550μL)软琼脂管,然后迅速转动你的双手手掌之间的混合内容。不要动摇管,使气泡介绍。在你的左手拿着管,打开了你的右手硬琼脂平板的盖子,并立即倒入管硬琼脂平板表面上的全部内容。关闭前盖,轻轻地摇板,但迅速遍布整个板面软琼脂融化之前有时间来巩固。避免溅到熔化的软琼脂培养皿两侧。盖上盖子。
  10. 重复步骤#9,所有吸附管一管一次。
  11. 板放置在一个水平面上,并允许他们站在原状,直到软琼脂凝固。
    • 通常30分钟就足够了。
  12. 反转孵化板。
    • 可堆叠多个板块和粘贴在一起,然后孵化倒。

板潜伏期之后,可以检查斑块。阴性对照应该有细菌草坪(斑块指示无孔)。斑块的大小,形状和整体外观方面有所不同。一个可以分离出噬菌体型异构混合物的斑块仔细冲压用无菌牙签一个斑块的中心转移接种到无菌的离心ţUBE含有100到1000肉汤或噬菌体缓冲液。使用相同的程序,如上所述,这种裂解可镀。至少需要3到6连续单斑块隔离是必要的,以确保已获得纯噬菌体。往往必须在大范围内(10 -1到10 -10)找到一个盘子上产生非重叠斑块的滴度稀释裂解。数量取决于斑块的大小而变化。

6。副本板程序:筛选突变体及营养缺陷型细胞转移

这种技术允许在主板二级板比较细胞的生长,可选择的表型的屏幕细胞产生的一种手段。首先,小学或主板接种细胞蔓延镀产生单菌落稀释,或将它们转移到网格标记指定的空间格局板。中学板含有与增长inhib媒体从主盘的菌落接种细胞缺乏特定营养itors或媒体。殖民地的空间格局再现,首先按主板一块天鹅绒。细菌细胞的天鹅绒坚持,因为他们有更大的比琼脂天鹅绒的亲和力。细胞的天鹅绒上的印记,然后被转移到多个辅助板作为主盘,反映了相同的殖民地模式与细胞的生长。换句话说,它更像是一个橡皮图章,从一个板块复制到另一个经济增长模式。这种技术是有利的,因为它允许同时进行筛选,在一次实验中的许多表型相对大量的殖民地。

  1. 准备主板:左右至少您的姓名,日期,生长介质类型的琼脂平板(不盖)底部边缘的标签。
  2. 标志着一个格板底部至少有两个等距的垂直线和至少两个等距的水平线。数的结果平方。
  3. 使用预先灭菌的牙签接种与细胞样本每平方米。对于每个样本,民建联的中心广场。不要覆盖整个广场与细胞( 图8)或其他样品时,会长满培养和污染周围的广场。
    • 将接种肉汤培养或在另一盘殖民地来自不同的样品,每平方米。
  4. 反转和孵化的主要板块,将用于接种各种辅助媒体。
  5. 接种二次板块:栈主板和所有的二级板块。同一个标记,使板的侧面方向标志。确保每块板,而不是盖的底部是商标。
  6. 获得无菌的平绒布和它放在圆块女igure 9)。锁定平绒布料持有人的地方。注意块的方向标志。
    • 块应该是同样大小的培养皿的底部(直径10.2厘米)。它应该与锁紧环,夹棉绒的布块,而副本电镀。
    • 的平绒布(15.2 x 15.2厘米见方)必须预先消毒。烟囱10个或12个清洁广场,然后包装在铝箔,然后将他们的反应釜上的干燥周期(重力设置),在121°C 30分钟。副本电镀实验中使用它们之前,确保他们完全是把他们在几个小时的温暖烤箱干燥。请注意,平绒广场可能需要胶带灭菌前的LINTED。
    • 平绒平方可重新使用。已在高压灭菌器中消毒后使用平绒广场,他们应在平原水冲洗,并重新消毒如上所​​述。
    • 圆柱集团k和钳之间有一个简短的冲洗70%(V / V)乙醇或10%氯漂白剂的使用应消毒。
  7. 取下盖子和反转的主要板块。排队块标志板的方向标志。降低板,使琼脂表面接触平绒圆柱块布。轻轻地,但均匀按下主板回你的指尖,然后小心地从主板块。更换盘上的盖子。
    • 可用于从主板细胞的天鹅绒印象接种需要作出一个新的天鹅绒中学板约7-8前的印象。
  8. 重复步骤#7与各中学的板。
    • 作为阳性对照,在系列的最后一个板块应该是所有测试菌株生长的琼脂培养基。这种方式可以确认,细胞被转移到所有中学的PL阿泰在系列。否则,缺乏一个特定的测试介质的增长可以归因于细胞转移不足,而不是一个应变型。
    • 为了避免误报,二级板,要责令从最少到最有利的基板。否则,营养物质可以使细胞生长不利的介质上的板块之间转移。
  9. 反转板和孵化。
    • 注:当检查二次增长板,一定要区分增长和印记。后者是一种消极的结果。

7。清理的工作空间

  1. 关闭本生灯,然后收起所有用品,包括板或管,额外的媒体和其他试剂的文化。
    • 不要让古老的文化,是否对板或管,实验室长凳上或在存储领域积累。这些样本,是臭名昭著的污染来源如霉菌和有害的细菌物种,应该被丢弃,因为他们不再需要尽快。
  2. 地方沾染到妥善处置插座实验室器皿(手套枪头,kimwipes),玻璃器皿(管,瓶,瓶),危险废物(细菌培养或噬菌体的解决方案,用于板)。当工作与非致病性大肠杆菌大肠杆菌菌株(BSL-1),唯一的非传染病危险废物的产生。当这些病原微生物(BSL-2或以上)执行相同的程序,感染的危险废物产生。无论生物危害的分类,危险废物,必须进行高压灭菌或消毒前被丢弃。按照在BMBL所述的准则( 5版),以及提供的体制环境健康和安全部门立即在实验过程中产生的生物危害和妥善处置这些。
  3. 清洁与消毒的工作区。
  4. 洗手彻底杀菌肥皂和温水,离开实验室前。

8。代表结果

连续板技术。连胜电镀的一个示例应用程序如图1所示。这个程序是用来从混合细胞培养分离细菌菌落,是迄今为止最重要的技术掌握在微生物学和分子遗传学之一。每个殖民地代表的基因完全相同的细胞,是人口。对于许多下游应用领域,它必须开始与一个单一的殖民地或一个纯粹的细菌接种细胞从一个单一的殖民地媒体产生的文化。例如,殖民地内的单个细胞的形态,可以使用光学显微镜检查。从一个单一的殖民地开始了细胞培养分离出的基因组DNA测序小亚单位核糖体RNA基因的遗传特性,可以分配。和代谢特点,可谓细胞受到各种生理生化检测。只有通过执行这样的实验与纯培养可以是某些归因于某一特定微生物的性能。结果是没有遮挡,文化被污染的可能性。如果整个过程中保持连胜整个板块的细胞用于仪器的无菌技术可能会出现错误。忘记火焰循环或检索一个新鲜的牙签象限之间很难获得单菌落。一些细菌物种不能孤立,因为它们是依赖于合作组织具有一定的增长需求的另一个菌种的纯培养。这些生物体简称为syntrophs,可能只共培养条件下生长,所以殖民地(如果形成)总是将两个或两个以上的物种组成。在实验室中执行时遇到的另一个挑战条纹板程序是从环境样品的细菌细胞表现出偏离传统的实验室菌株,如大肠杆菌的生长特性大肠杆菌 。这种菌株可能产生殖民地丝状过的琼脂平板上的大断面的传播与分支机构(反对紧簇的细胞),钙化,从而由连胜板仪器渗透耐火材料,或由粘囊包围因此,个别殖民地不能看出端倪。这些特点使其很难净化连胜板技术的单菌落。

倒板技术。随着倒板技术,殖民地内形成的琼脂,以及表面琼脂培养基,从而提供了一种便捷的方式来计算样品中的活菌数。本程序是用在各种工业应用。例如,它是关键的废水TREatment厂,这是负责清理住宅,商业及工业物业以及农业做法所产生的废液(例如,污水,径流从风暴水渠),水样进行分析后,广泛的净化过程。重复使用在各种不同的方式处理过的废水(非饮用水) - 非粮食作物在农业灌溉,在住宅的卫生冲洗,工业冷却塔 - 所以它必须是免费的化学和微生物污染。必须净化饮用水(饮用水)根据EPA标准和使用微生物电镀列举具体的人类病原体的方法,使测试。 如图10所示,从细菌细胞产生的细菌菌落呈现在从公共饮水机收集水样。这是不大可能的细菌病原体产生这些殖民地饮用水净化措施;然而,微生物是每的地方,甚至非致病性菌株的污染,只能最小化,而不是完全消除。作为另一个例子,一家制药公司需要评估的微生物污染,或生物负荷的生产,储存和运输过程中的新药物,程度。通过采样过程中各个阶段的过程和使用倒板的电镀样品的药物,微生物负载,或污染细菌的数量,可以很容易地确定。预防措施,那么可以设计以减少或消除微生物污染。最常见的技术错误之一发生时,倒板技术是不足,导致融化的琼脂菌落聚集在一起,从而使平板计数不准确的样品混合。另一个常见的​​错误是浇注时,它是融化的琼脂太热,造成许多样品中的细菌细胞。这个错误也将影响平板计数的准确性号码,根据代表日Ë样品中菌落形成单位总数。

扩散板技术。扩散板技术是类似于倒板的过程,在其作为一种手段来执行可行的平板计数的效用。然而,因为使用的扩散板技术的殖民地,形成均匀分布整个琼脂培养基表面,从单个菌落的细胞可以被分离,并在随后的实验操作(例如,为连胜板或接种肉汤培养物)。在其中的扩散板技术是一个重要组成部分的三个常见的应用是富集,选择和筛选实验。在所有这三个应用程序,所需的细胞类型可以从混合物中分离出来,后来受到任何数量的生化,生理或遗传测试。

一个浓缩实验涉及电镀中等混合文化或潜伏在E盘nvironmental内的微生物样本展示所需的代谢特性,生长特性,或行为,有利于增长的条件。这一战略不会抑制其他生物,但结果在生长所需的微生物相对于其他文化的人数增加。因此,形成一个浓缩铭牌上的殖民地,可能表现,反映了所需的基因型的表型特性。例如,如果你的目标是培养固氮菌从环境样本含有超过1000种不同的细菌种类的混合物,然后镀上缺乏氮介质的样品将丰富这些细菌能产生这种化合物使用提供一套固氮基因的代谢能力的氛围。

一个选择实验涉及的媒介,使CON只有那些细胞混合培养的电镀TAIN成长的基因或一个特定的基因组。这种类型的实验是在分子生物学实验室共同含有抗生素抗性基因的质粒转化菌株时。如果你的目标是培育重组细胞,或者是那些成功了质粒,然后镀上已与适当的抗生素浓度培养基样品将这些细胞表现出抵抗这种特定的药物选择。

筛选试验涉及电镀混合文化的媒介,让所有可行的细胞生长;然而,所需的基因型的细胞可以从其他的细胞根据其表型区分。再次,这种类型的实验是在分子生物学实验室共同表演时突变检测到质粒或克隆基因。一个典型的例子, 如图11所示,使用lacZ基因ENCO丁β-半乳糖苷酶,这种酶可以对细胞代谢X-Gal的(5 - 溴-4 - 氯-3 - 吲哚基-β - D-半乳糖苷),其天然底物,乳糖底物类似物。 X-Gal的裂解β-半乳糖苷酶的结果,不溶于水的蓝色产品。因此,如果介质中含有X-gal的,并包含一个野生型(功能)或突变(非功能)lacZ基因的细胞样本被镀上这种媒介,然后孵化野生型细胞窝藏功能的lacZ基因会出现蓝色色素的殖民地,而与非功能的lacZ基因突变的细胞就会出现为未染色(“白”)的殖民地。

最常遇到技术上的问题时,首先学习如何执行分散在琼脂表面细胞的扩散板技术是不均匀的。当使用一个转盘和玻璃棒,样品可能被吸收过快等殖民地板中心附近形成。 W母鸡做“科帕卡巴纳方法”,“玻璃珠是众说纷纭,而不是整个琼脂表面动摇。因此,许多殖民地一起成长的板块外缘。分布的殖民地,在任何情况下不提供完整的表面积的优势使细胞聚集在一起成重叠的菌落平板计数不准确的或不可行的细胞类型的区别和成长。

软琼脂覆盖技术 。可用于理货噬菌体数扩散板技术用于细菌菌落计数类似于一个过程。而30和300之间的细菌细胞在琼脂表面传播的菌数(CFU /毫升),100和400之间传染的噬菌体颗粒混合层内10 8 10 9菌斑计数宿主细胞(PFU /毫升)软琼脂遍布硬营养琼脂表面。除非证明,否则,人们普遍假定ţ帽子单个细菌细胞分裂和积累大量的基因完全相同的细胞,称为一个殖民地,在一个单一的集群。如前所述,这个假设是有效的,当细胞生长在束(即,对四分,链条,或集群)或显示,如胶囊,阻碍单菌落形成的生长特性。斑块形成一个类似的假设,每个斑块的代表活动的一个单一的噬菌体。这种说法是真实的,只有一个噬菌体感染细菌。如果多个噬菌体颗粒感染一个单一的细菌,会发生什么?这个问题涉及到噬菌体进行实验时,必须考虑的一个重要的统计参数 - 多重感染(MOI), - 描述传染病的噬菌体颗粒样品中的宿主细胞的数量比例。由于一些细胞吸附超过一个噬菌体,而其他细胞的吸附,只有一个或没有噬菌体,宿主细胞的人口被感染低MOI(≤1)TO减少将超过一个噬菌体颗粒感染一个细胞的概率。用人作为一个功能定义的蚀斑形成单位(PFU),避免这些并发症时斑块计数来计算的噬菌体股票的滴度。

斑块形态的变化, 如图12所示,为不同的噬菌体。一些噬菌体产生小斑块(A组),而其他产生大斑块(B组)。许多变量影响斑块大小。这是导致这种变化的技术原因。例如,完整的媒体和厚硬琼脂支持较大的斑块的发展,因为宿主细胞可以维持一个较长时间的噬菌体增长。电镀的宿主细胞的高密度(> 10 9 CFU每盘),将导致斑块大小的减少。使用低浓度的软琼脂将增加在软琼脂噬菌体颗粒扩散的速度,从而增加斑块的大小。记得第在这个扩散速度增加,可能会出现无意的,如果硬琼脂平板不完全干燥的,在菜凝结或多余的水分冲淡了在软琼脂覆盖。这种技术监督斑块大小​​为一个特定的噬菌体会产生不一致的结果。

斑块大小也关系到一个宿主细胞的活动,包括吸附效率,潜伏期的时间(时间跨度从噬菌体吸附到宿主细胞裂解),以及突发尺寸(后代的数量公布一个单一的感染)。异构的混合物,可观察到的斑块大小的噬菌体颗粒感染宿主细胞在细菌生长的不同阶段。例如,那些在早期指数阶段,使更多的子代噬菌体吸附比那些较大的斑块,吸附在后期指数阶段。作为一般规则,而溶原噬菌体形式混浊斑块裂解噬菌体产生明确的斑块。何wever,一些裂解噬菌体产生有趣的图案,如“靶心”,在如图12B所示牌匾。这些明确的斑块混浊的光环包围,因为这些细胞在斑块的边缘未完全溶解或可能是抗噬菌体感染。一个“靶心”的格局观察温带噬菌体是一个明确的环包围了浑浊中心的牌匾。这种形态反映的MOI和生理与宿主细胞裂解溶源性决定。当细胞被噬菌体感染,内政部低,细胞生长迅速,因为营养丰富;在一起,这有利于溶解增长。随着越来越多的细胞被溶解,内政部增加和明确的牌匾形式。溶原菌在中心的牌匾,然而,继续增长,因为他们的免疫混浊中心的一个明确的牌匾引起裂解。

斑块的检测与真核细胞病毒可以修改覆盖技术。在以同样的方式噬菌体草坪细菌细胞在软琼脂上形成斑块,真核细胞病毒形成单层细胞凝胶覆盖的斑块。单层是一个融合细胞生长在培养皿的表面相映成趣,互相接触,而不是成长在彼此之上表。开展这种类型斑块检测,病毒等分添加到真核细胞中的敏感膜。单层覆盖琼脂糖为基础的营养培养基 - 凝胶限制子代病毒从被感染的细胞释放到相邻的细胞在单层的蔓延。因此,一个球形区域,或斑块,产生包含受损细胞释放的病毒粒子。为了帮助可视化斑块染料,染色的活细胞可应用于细胞培养,提供感染和未受感染的细胞之间的对比。

软琼脂覆盖技术被用于实验斑块检测以外。首先,它是significant记住硬盘营养琼脂是一个支持矩阵,允许细菌的生长。其次,软琼脂用于覆盖可以有不同的营养成分比硬琼脂。这样,软琼脂可以作为不同的生长特性或代谢特性的实验菌株的一种手段。例如,叠加技术用于屏幕上的细菌降解纤维素(1982年Teather和木材)的能力。单菌落生长在非选择性中等硬软琼脂培养基含有0.1%(W / V),羧甲基纤维素(CMC)在硬琼脂表面传播。孵化后,板充斥着污渍,结算区,允许各地在软琼脂殖民地可视化。结算是由打破在中纤维素的细菌分泌的水解酶。最近,覆盖技术已被用于检测细菌抑制的methanoge的增长NIC古发现家畜的瘤胃(吉尔伯特 2010)。从环境样品中的细菌株生长在坚硬的琼脂营养殖民地,然后用软琼脂含有的甲烷的文化叠加中等。孵化后,板块在菌落周围生长抑制区视察。这种方法确定菌株产生的甲烷在软琼脂抑制剂。

与软琼脂覆盖技术发生的最常见的技术错误,浇注融化的软琼脂,或者当它是太热或太爽了。如果实在太热,在介质混合细菌细胞就会被杀死镀前。如果是太爽了,然后将形成​​的软琼脂时,硬盘上的琼脂倒团块。在任何情况下,其结果将是最好的含糊不清或不可读。

副本板程序 。从一种类型的营养培养基转移文化到另一个测试增长的需求变得很费力,如果有超过只有少数菌株。副本电镀是一种方法,允许同时筛选大量的微生物。例如,诱变野生型细胞培养后,可以传播文化的板稀释获得单菌落板。主板中含有介质,支持包括所有细胞的生长的野生型prototrophs,其中合成生长所需的所有化合物,突变体营养缺陷型,携带基因突变在生物合成途径,使他们无法合成生长所必需的特定化合物。由电镀到一个完整的介质细胞的混合物,缺少的营养物质可以从环境。为了区分prototrophs和营养缺陷型,殖民地可以复制到一个最小的介质。只有prototrophs能够成长。由于主盘的空间格局保留,comparis对二级板与主板允许识别突变殖民地。以确定该化合物的突变体不再能够合成,殖民地可以复制到最小媒体辅以特定化合物(如氨基酸,碳源,维生素等)。这种方式,数百菌落可以在同一时间使用副本板程序筛选。可能出现的一个技术性错误使用琼脂平板,太湿,造成菌落涂片一起污染盘上的所有文化。这产生的结果是完全不可靠的。另一个技术性错误申请转让平绒细胞的辅助板时,压力太大。再次,二级板孵化后,由此产生的殖民地可能会重叠,而非营养缺陷型污染归因于生产增长的表型。

并非所有的野生型微生物物种prototrophs,所以副本-P可用于后期过程,同时屏幕的不同株野生型为特征的增长要求。在图13所示的“,的dabs”的细胞从四个不同的假单胞菌菌株接种一格标板包含完整的媒体称为YTA一式两份(A组)。菌株,然后被复制到三所中学的板(板乙,C和D)的基本培养基(MSA),辅以不同的碳源(乙酰胺,乳糖,甘氨酸),分别组成。结果表明,四个假单胞菌株( 绿脓杆菌斯氏假单胞菌 )都不能在这三个碳源生长。作为对照,株复制YTA培养基,以确认细胞,整个过程转移到了第四盘。由于所有4株的YTA控制盘上的增长,增长不足系列中的前三个板块展出是可靠的。副本镀结果列于表1。常用的一个错误的解释作为一个积极的结果二次板成长的印记。例如,比较体育的表型绿脓杆菌体育在MSA stutzeri +乙酰胺(B组)。后者显示印记的增长,这是一种消极的结果,可能会发生,如果从以前的板营养与母细胞转移。没有新的细胞生长发生,因为缺少的营养物质是不提供给子代细胞。这是很容易混淆与实际增长的印记。如有疑问,应重复实验使用一种替代方法,例如从小学到中学的媒体板条纹电镀细胞。

图1
图1。板的一个殖民地的例子。粉红色的球板中心附近的殖民地是沙雷marcesc的ENS,革兰氏阴性,杆状在家庭肠杆菌Proteobacterium。由于其偏爱潮湿的环境,通常发现这种微生物生长在角落的浴缸,水槽盆,瓷砖灌浆,浴帘, 研究沙雷氏菌很容易识别,因为它产生一个红色的色素,称为灵菌。这个板块上的菌落生成连胜板技术,使用出现在第四象限后,潜伏期为24小时,在30°C的单菌落。其他三个象限表明在细胞发展成重叠的殖民地的琼脂表面上沉积的融合生长。

图2
图2。仪器用于连胜板技术。从上到下,牙签(扁平不圆),线环,一个一次性的塑料环,和木棍。牙签是通常转移与广角端下来,然后用铝箔盖时,高压灭菌消毒,使用前的小玻璃烧杯。木棍被转移到18毫米的测试,然后高压灭菌消毒使用前管。

图3
图3。(一)连续板技术,采用象限法。一个预消毒的循环,棒或牙签使用遍布一季度快速,流畅,背部和第四,从板中心的边缘的议案琼脂表面的样品。这个动作重复为每个板的四个象限。孵化之后,细胞的生长出现沿用来存放仪表板细胞的路径。使用这种技术在混合样品应导致细胞的分离机械单菌落在第四象限(参见图1为例)。被称为单菌落菌落形成单位(CFU)。 (B)当一个金属环条纹电镀,它必须使用本生灯火焰事先联系与接种或琼脂培养基消毒。回想一下,火焰最热的部分是蓝色锥尖。握住仪器的手柄,电线放置在循环3-4英寸的火焰。离开它足够长的线变成红色热。移动线,使火焰接近循环。可以肯定的金属循环冷却之前触及接种。

图4
图4。倒板技术。 (A)样品体积小(介于0.1至1.0毫升)配发到一个空的,但无菌培养皿无菌条件下使用5.0毫升血清吸管。 (二)熔化琼脂平衡温度约48°C时再倒入培养皿样品。关闭盖子后,该板块是轻轻的旋转混合样品和融化的琼脂。琼脂允许巩固板然后倒孵化约30分钟。

图5
图5。转盘和玻璃吊具扩散板技术。琼脂板放在一个转盘上后,小体积的样品(0.1〜0.2毫升)配发无菌板使用移液器上的中心。吊具浸渍成乙醇的烧杯中,然后通过本生灯的火焰点燃多余的乙醇消毒。与样品接触之前,吊具应通过触摸它来琼脂板的边缘附近的冷却。吊具轻轻来回移动整个板块,而正在慢慢旋转转盘通过样品。这个动作可以让渐进的,但分散在琼脂表面样品。关闭盖子后,板应设置在板凳上顶ü至少5分钟,以使样品吸收到琼脂完全颠倒板孵化前ndisturbed。

图6
图6。扩展板与玻璃珠的技术(科帕卡巴纳方法)。倒入已预先消毒的高压灭菌器的玻璃珠到琼脂坐在板凳上顶板的表面。小体积的样品(100〜150μL)是无菌配药到琼脂使用移液器中心的。与板盖关闭,横摇运动是用来轻轻整个板块移动的珠子来回6至7倍,传播的样品。板旋转60°后,重复这个动作。另外60°旋转,摇晃动作重复第三次。一旦样品完全吸收到琼脂培养基,珠倒入​​烧杯中含有10%的漂白粉。 “板,然后倒孵化。

图7
图7。软琼脂覆盖技术,用于隔离和枚举基于斑块的形成(也称为斑块检测)的噬菌体。 (一)噬菌体的存在可以作为结算的区,或斑块检测,融合上的菌落生长在软琼脂悬浮。噬菌体T4是一个致命的双链DNA噬菌体感染的主机, 大肠杆菌 ,引起宿主细胞裂解并释放子代噬菌体。经过多轮,邻近的大肠杆菌感染和裂解大肠杆菌细胞在眼前的区域,周围原有的感染宿主细胞消失,留下含有T4噬菌体颗粒十亿美元的牌匾。噬菌体T4产生斑块,直径约1毫米。在这个实验中,10 -5 2×10 8 PFU / ml的噬菌体的股票稀释200μLT4混有大肠杆菌的约300μL在37°C, 大肠杆菌指标细胞成倍增长,加气的文化准备噬菌体和细菌都被添加到EHA之软琼脂管,混合,然后倒入一个EHA之硬琼脂平板表面上。请注意,这是没有必要让噬菌体和细菌吸附在这种情况下,电镀前。允许软琼脂巩固原状20分钟后,倒板和在37°C孵育24小时。 (二)在阴天悬挂在离散殖民地是不可见的细胞在软琼脂感染的噬菌体颗粒,细菌的生长结果的情况下。相反,在这种情况下,一个细菌细胞,甚至草坪E.大肠杆菌 ,整个软琼脂层的形式。

图8
图8。细菌样品(主)主板的制备。盘底保持样品举办,可以标记成一个网格,导致广场编号。每个样品可以分配一个正方形网格上。证明是正确与不正确的接种模式的例子。理想的情况下,少数的细胞被转移到广场的中心,如牙签,以“民建联”的样本(细胞#4)使用无菌接种工具。接种常见的错误,如在细胞#5(“补丁”)和“细胞”#6(“补”)描绘的,在孵化后的细菌样本增生的结果,因此污染相邻的广场。

图9
图9。的副本板技术,用来传输细胞从小学至中学板型屏幕。主板上的标记与商标一致平绒覆盖块,然后罗威红色,使琼脂表面的布联系。细胞转板的平绒掉以轻心,但均匀按压指尖的主要板块。这一行动将留下一个印记作为主板块在同一空间格局上的平绒的细胞样本。相同的程序是用来传输细胞平绒次要板。多达7-8二次板可接种平绒使用相同的主板印象。最后一盘的平绒接种应作为阳性对照。它应该是一个介质,支持所有菌株的生长,确保有足够的细胞转移发生在整个板块的整个系列。经过孵化,二次板可检查,并取得增长相比没有增长。因此,多个菌株进行筛选,同时在几个增长的媒介在一个单一的实验。

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图10。结果示例使用倒板技术。 1.0毫升样本的收集从公共饮水机的水配发到无菌的空培养皿。然后融化,但与样品冷却YTA浇入菜。琼脂还含有100微克/毫升放线菌酮,以防止可能已被水样中酵母菌和霉菌的生长。轻轻摇动混合后,该板块成立后,在平坦的表面和琼脂被允许完全巩固。板在37°C孵育48小时。显示的是这个实验的结果。注意:在外观上表面的殖民地,这是在大和圆形形状,与分型面的殖民地,这是非常小的不规则形状的差异,因为凝固的介质,抑制殖民地,在次表层蔓延。

图11
图11。 </ STRONG>结果示例使用扩散板技术。使用“科帕卡巴纳方法”板块的大肠杆菌细胞筛选试验的混合物。在这种情况下,生长培养基(LB),含有X-Gal的,所以这些细胞表达功能的β-半乳糖苷酶形成蓝色菌落,而那些在lacZ基因突变的细胞,从而无法 ​​表达功能的β-半乳糖苷酶的形式白色菌落。菌落两类通常被称为“蓝色/白色屏幕”,可以很容易区分彼此的同一个盘子。

图12
图12。示例斑块的检测结果,采用软琼脂覆盖技术。所示的主机上的应变耻垢分枝杆菌 MC 2 155(ATCC 700084),形成了由两个不同的pH值的斑块年龄:(一)分枝杆菌噬菌体驱逐舰和(B)分枝杆菌噬菌体MSSS。学生在加州大学洛杉矶分校的实验室的当然MIMG 103L在2010年春季,这些噬菌体分离。耻垢分枝杆菌是非致病Actinobacterium的,属于一个家庭分枝杆菌,其中包括已知会导致严重的疾病,如肺结核(M. africanum,结核分枝杆菌,牛分枝杆菌 )和麻风病( 麻风 )一些病原体。培养约50 10 -2稀释驱逐舰和10 MSSS每个-3稀释液500μL 研究 20分钟耻垢在37°C,然后混合MBTA的软琼脂倾注到类似物板(硬琼脂)。允许软琼脂巩固原状20分钟后,倒板和在37°C孵育48小时。请注意每个噬菌体产生明显斑块形态。驱逐舰(一)形成小(平均直径约1毫米)的裂解噬菌体的特点,明确斑块而MSSS(二)发展与周围混浊的光环(平均直径约3.2毫米)的明确中心的大型的“靶心”匾额。朦胧的环可抗噬菌体感染的细菌组成。这种模式是不同的溶原性噬菌体,从而产生混浊斑块形成。

图13
图13。结果示例使用副本板的过程。四假单胞菌株( 绿脓杆菌,恶臭假单胞菌,荧光假单胞菌,斯氏假单胞菌 )进行重复上三种不同的碳源乙酰胺,乳糖和甘氨酸增长。 (一)主板是一个完整的介质(YTA)表示,4株接种。在30°C培养24小时后,所有4株生长在YTA。主板被用来副本板到最低限度我dium(MSA)的单一碳源补充:乙酰胺(B)乳糖(C)和甘氨酸(四)。系列中的最后一个板块是一个积极的控制YTA板(五)。如上所示,株显示变量的增长模式,二级板孵化。需要注意的是,有时难以区分细胞的生长和印记。例如,比较体育所产生的印记上三个海事板的stutzeri上没有相同的三大板块由P.增长绿脓杆菌 。都是负的成绩相比,由P.展出的增长模式恶臭P.荧光 。然而,所有的阳性对照板确认细胞株生长转移到系列中的所有二级板块。这个实验的结果列于表1。

YTA
(主)
海事局+
乙酰胺
海事局+
乳糖
海事局+
甘氨酸
YTA
(对照组)
绿脓杆菌 + - - - +
恶臭假单胞菌 + + + + +
荧光假单胞菌 + + + + +
斯氏假单胞菌 + - - - +

表1。摘要副本电镀结果。增长显示加号(+)和减号( - )表示没有增长。 YTA是一个完整的培养基(酵母蛋白胨琼脂)和MSA是一个最小的介质(最小盐琼脂)。 MSA的板辅以单一碳源。

Discussion

培养微生物涉及电镀方法,所有这些都需要保持无菌技术在整个细胞和媒体操纵。在这个协议,五个不同的程序进行了描述。虽然这些电镀技术通常用于操纵细菌和噬菌体,他们也可以应用于哺乳动物细胞培养中常用的分子遗传学,如酵母(即, 酿酒酵母,白色念珠菌,裂殖酵母 ),藻类和原生动物和真核微生物(即, 团藻,衣藻,变形虫,草履虫 ),线虫(即线虫 )。也有许多(更复杂)各电镀方法的变化,根据实验的目标或正在研究的有机体。因此,重要的是不仅要选择最合适的技术对于一个给定的实验或目标微生物,而且裁缝的方法,这种T帽子的实验结果,适当解决所研究的问题或问题。

一些涉及本议定书中所讨论的电镀技术的最新应用技术的进步,产生高通量筛选和药物发现实验结果。例如,基因组测序中心,为扩电镀克隆库使用“科帕卡巴纳方法”,这是E。含有来自一种微生物的基因组DNA片段的质粒转化大肠杆菌细胞。因为几十大板(称为生物活性托盘)一次编写,自动化板振动筛是用于托盘的整批玻璃珠摇。此外,选择从这些板块的殖民地后,孵化时,机器人的殖民地选择器用来收集从LB培养基接种适当的殖民地,在384孔板的细胞。对于这种高通量筛选法,蔓延-P的程序原则申请后期的技术,但技术允许各种措施来实现自动化和扩展,允许大量的样品进行分析,同时在很短的时间框架。

在发展高通量技术在微生物学和分子遗传学的最基本的技术,生物技术和制药公司投入大量资源。例如,有多渠道micropipettors,进行长达8个或12个样品一次量转让。即使是96通道移液器头的机器人工作站,机动!这些工作涉及多学科的科学家小组,配对生物学家,拥有工程师和计算机程序员可以开发执行与实验相关的机械操作所需的仪器与方法的专门知识。无论研究中的应用,开发这些技术的公司共同的目标是相同的 - 自动化laboratoRY流程,工具,系统和工具,使他们少劳力密集和更有效。

Disclosures

我什么都没有透露。

Acknowledgements

特别感谢IROC设计CORI桑德斯准备设立样品的文化和协助数字插图和克里斯Reddi在加州大学洛杉矶分校和Bhairav​​沙阿。霍华德休斯医学研究所(HHMI的批准号:52006944),为这个项目提供了资金。

Materials

1. Yeast Tryptone Agar (YTA)

Yeast extract 2.0 g
Tryptone 10.0 g
Agar 15.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml
pH 7.0

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

If preparing tubes for the pour-plate procedure, allow the agar to cool to ~55°C then add 2.0 ml of 50 mg/ml cycloheximide. Aseptically dispense 18.0 ml of the melted agar per 18 mm tube then store at 4°C. The agar will solidify and will need to be melted in a steamer or microwave prior to use.

2. Minimal Salts Agar (MSA) + 0.1% (w/v) carbon source

NH4Cl 1.0 g
NH2HPO4•2H2O 2.14 g
KH2PO4 1.09 g
MgSO4•7H2O 0.2 g
Carbon source* 1.0 g
Trace salts solution** 10.0 ml
Agar 15.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml
pH 7.0

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

* Carbon sources used for experiments presented in Figure 13 include acetamide, lactose, and glycine.

** Trace salts solution is prepared in 0.1 N HCl as follows. It is added to the base before sterilization (autoclave at 121°C for 20 minutes).

FeSO4•7H2O 300.0 mg
MnCl2•4H2O 180.0 mg
Co(NO3)2•6H2O 130.0 mg
ZnSO4.7H2O 40.0 mg
H2MoO4 20.0 mg
CuSO4•5H2O 1.0 mg
CaCl2 1000.0 mg
HCl (0.1 N) up to 1000.0 ml

3. EHA soft agar (0.65 % w/v)

Agar 6.5 g
Tryptone 13.0 g
NaCl 8.0 g
Na Citrate•2H2O 2.0 g
Glucose 3.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

4. EHA hard agar (1.2% w/v)

Agar 12.0 g
Tryptone 13.0 g
NaCl 8.0 g
Na Citrate•2H2O 2.0 g
Glucose 3.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

5. 1X Middlebrook Top Agar (MBTA soft agar, 0.5% w/v)

100 mM CaCl2 stock* 1 ml
7H9 liquid medium: Neat ** 50 ml
2XTA *** 50 ml

Melt 50 ml of 2XTA and allow it to cool to ~55°C. Using aseptic technique, add the CaCl2 and 7H9 broth to the melted agar. Aseptically dispense 4.5 ml of the mixture per 13 mm tube and store in a 55°C incubator ≤7 days. Cooling MBTA to room temperature or 4°C will cause the CaCl2 to precipitate out of solution.

* 100 mM CaCl2. stock must be stored at room temperature to prevent CaCl2 from precipitating out of solution.

** 7H9 liquid medium: Neat

7H9 broth base 4.7 g
40% glycerol stock 5 ml
Distilled water up to 900.0 ml

Mix the base with water then add the glycerol while stirring. Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

*** 2X Middlebrook Top Agar (2XTA, 1.0% w/v)

7H9 broth base 4.7 g
Agar 1.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Dispense 50 ml aliquots into 100 ml bottles and store at 4°C.

6. Middlebrook 7H10 Agar Plates (MHA hard agar, 1.9% w/v)

7H10 agar base 19.0 g
40% glycerol stock 12.5 ml
Distilled water 887.5 ml

Mix the agar base with water then add the glycerol while stirring. Heat the solution to boiling then stir for one minute to completely dissolve the base powder. Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Allow the agar to cool to ~55°C then aseptically add the following reagents:

AD supplement (pre-warmed to 37°C)* 100 ml
50 mg/ml Carbenicillin ** 1.0 ml
10 mg/ml Cycloheximide ** 1.0 ml

* AD supplement

NaCl > 17 g >
Albumin (Fraction V)> 100 g>
Dextrose (D-Glucose)> 40 g>
Distilled water> up to 2000.0 ml>

Filter-sterilize this solution; do not autoclave. Store at 4°C.

** Filter-sterilize and store these solutions at 4°C for ≤60 days.

7. LB agar (1.5% w/v) + X-Gal (60 μg/ml)

Tryptone 10.0 g
Yeast extract 5.0 g
NaCl 10.0 g
Agar 15.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml
pH 7.5 at 25°C

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Allow the agar to cool to ~55°C then aseptically add 3.0 ml of 20 mg/ml X-Gal solution. Freshly prepare X-gal stock by dissolving 400 mg X-Gal in 20 ml dimethylformamide (DMF).

Table of specific reagents:

Name of the reagent Company Catalogue number
Yeast extract Becton Dickenson 212750
Tryptone Becton Dickenson 211705
Agar Becton Dickenson 214030
NH4Cl Acros Organics 123340010
NH2HPO4•2H2O Sigma-Aldrich 30435
KH2PO4 Fisher Scientific BP 303-500
MgSO4•7H2O Sigma-Aldrich 230391
Acetamide Sigma-Aldrich A-0500
Lactose Fisher Scientific L6-500
Glycine Sigma-Aldrich G-7126
FeSO4•7H2O Sigma-Aldrich F8048
MnCl2•4H2O Sigma-Aldrich M-3634
Co(NO3)2•6H2O Sigma-Aldrich 230375
ZnSO4.7H2O Sigma-Aldrich Z4750
H2MoO4 Acros Organics 213621000
CuSO4•5H2O Sigma-Aldrich 209198
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016
HCl Fisher Scientific A144-212
Cycloheximide Sigma 038K1561
Carbenicillin Cellgro 46-100-RG
NaCl Fisher S271-1
Na Citrate•2H2O Fisher S279-500
Glucose (Dextrose) BD 215530
7H9 broth base BD 271310
7H10 agar base BD 262710
Glycerol Shelton IB15760
Albumin (Fraction V) Fisher S71907
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Teknova X1205
Dimethylformamide (DMF) Sigma D4551
Ethanol Fisher CDA19
Chlorine Bleach Chlorox 02490/06644884
CiDecon (disinfectant) Decon Laboratories, Inc. 8504

Table of specific equipment:

Name of equipment Company Catalogue number Experiment
Metal loops American Educational Products S17352 Streak plating
Disposable plastic loops Fisher 22-363-602 Streak plating
Wooden sticks Fisher 23-400-104 Streak plating
Flat Toothpicks American Educational Products S67859 Streak plating
Turn tables Fisher 08-758Q Spread plating
Glass rods Bellco Glass NC9004380 Spread plating
4 mm glass beads Fisher 11-312B Spread plating
Velveteen cloth Bel-Art Products 09-718-2 Replica plating
Cylindrical block Bel-Art Products 09-718-1 Replica plating

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comments

2 Comments

  1. I am not sure why you keep lots of care flaming your clean loop starting at the base and then up to the loop, but in contrast, flame directly the loop when it is full of bacteria.
    My suggestion is to flame always starting from the bottom of the wire and then up to the loop, which in theory may reduce the amount of aerosols produced.

    Reply
    Posted by: Ed K.
    June 8, 2012 - 11:02 PM
  2. Shouldn't the scientist be using gloves?

    Reply
    Posted by: Josh F.
    June 30, 2012 - 3:15 PM

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