Automatic Translation

This translation into Danish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Medicine

Hyperinsulinemic-euglycemic Klemmer i bevidste, uhæmmet Mus

1, 2,3, 3, 2,3, 3, 4, 2,3, 2,3

1Diabetes and Obesity Research Center, Sanford-Burnham Medical Research Institute at Lake Nona, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Department of Pediatrics and Cellular and Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine

Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE
     

    Summary

    Den hyperinsulinemic-euglycemic klemme, eller insulin clamp, er den gyldne standard for vurdering af insulin handling

    Date Published: 11/16/2011, Issue 57; doi: 10.3791/3188

    Cite this Article

    Ayala, J. E., Bracy, D. P., Malabanan, C., James, F. D., Ansari, T., Fueger, P. T., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice. J. Vis. Exp. (57), e3188, doi:10.3791/3188 (2011).

    Abstract

    Type 2 diabetes er karakteriseret af en defekt i insulin handling. Den hyperinsulinemic-euglycemic klemme, eller insulin clamp, er almindeligt anset for den "gyldne standard" metode til vurdering af insulin handling in vivo. Under et insulin clamp, er hyperinsulinemia opnås ved en konstant insulin infusion. Euglycemia opretholdes via en samtidig glukose infusion med en variabel rente. Denne variabel glukose infusionshastighed (GIR) er bestemt ved at måle blodsukkeret med korte mellemrum hele eksperimentet og justere GIR i overensstemmelse hermed. Det GIR er tegn på hele kroppen insulin handling, som mus med forbedret insulin handling kræver en større GIR. Den insulin clamp kan inkorporere administration af isotopiske 2 [14 C] deoxyglucose at vurdere vævsspecifikke glukoseoptagelse og [3 - 3 H] glukose at vurdere egnetheden af insulin til at undertrykke antallet af endogene glukose udseende (endoRa), en markør for glukoseproduktion i leveren, og at stimuleresats af hele kroppen glukose forsvinden (RD).

    Den miniaturisering af insulin clamp til brug i genetiske musemodeller af metaboliske sygdomme har ført til betydelige fremskridt inden for diabetes forskning. Metoder til udførelse af insulin klemmer varierer mellem laboratorier. Det er vigtigt at bemærke, at den måde, hvorpå et insulin clamp udføres væsentligt kan påvirke de opnåede resultater. Vi har udgivet en omfattende vurdering af forskellige tilgange til at udføre insulin klemmer i bevidst mus 1 samt en vurdering af den metaboliske respons af fire almindeligt anvendte indavlede muse-stammer med forskellige klemme teknikker 2. Her præsenterer vi en protokol for at udføre insulin klemmer på bevidste, uhæmmet mus er udviklet af Vanderbilt Mouse Metabolic Fænotype Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu / mmpc). Dette omfatter en beskrivelse af den metode til implantering katetre anvendes under insulin clamp. Protokollen er ansat afVanderbilt MMPC anvender en unik to-kateter system 3. Et kateter er indsat i halsfedt for infusioner. En anden kateter er sat ind i halspulsåren, som giver mulighed for blodprøvetagning, uden at det er nødvendigt at begrænse eller håndtere musen. Denne teknik giver en betydelig fordel på de mest almindelige metode for at få blodprøver i løbet af insulin, klemmer, som skal prøve fra afhuggede spidsen af ​​halen. I modsætning til sidstnævnte metode, er prøveudtagning fra en arteriekateter ikke stressende at musen 1. Vi beskriver også metoder til anvendelse af isotopanalyse tracer infusioner at vurdere vævsspecifikke insulin handling. Vi har også fastsætte retningslinjer for passende præsentation af resultater opnået fra insulin klemmer.

    Protocol

    1. Udarbejdelse af katetre og mus Antenne til Sampling Access (MASA tm)

    1. Forbered arteriekateter ved at indsætte en 1,3 cm stykke af PE-10 (0,011 tommer indre diameter) i en 6 cm stykke silastic slange (0,012 tommer indre diameter) som vist i figur 1A. Bevel spidsen af ​​PE-10 med en skalpel, så længden fra slutningen af ​​silastic til spidsen af ​​den skrå kant er 0,9 cm.
    2. Forbered venekateter ved at skyde en 1 mm stykke silastic slange (0,020 tommer indre diameter) 1,1 cm fra det afskårne slutningen af en 6 cm stykke silastic slange (0,012 tommer indre diameter) som vist i figur 1B. Den 1 mm stykke silastic bruges som en fastholdende perle.
    3. At udarbejde en MASA tm, indsætte hver af to 1,3 cm stykker 25 gauge rustfri stål stik i hver af to 3 cm stykker af PE-20 (0,015 tommer indre diameter).
    4. Fastgør PE-20/connectors til hinanden ved at skubbe en 5 mm stykke silasticslange (0,040 tommer indre diameter) over det område, hvor stålrør og PE-20 mødes.
    5. Bøj stålrør til en ~ 120 ° vinkel og separate hvert rør med ~ 45 °.
    6. Placer afsluttet rig i en klat af medicinsk silikone lim, således at PE-20 slanger er lodret og enderne af rustfrie stålrør rækker ud over den selvklæbende (Figur 1C). Tillad denne til at indstille til 24 timer.

    2. Kirurgisk kateterisation

    1. Forud for kirurgi, sterilisere katetre med 70% ethanol, fylde dem med hepariniseret saltvand (200 U heparin / ml saltvand) og indsæt rustfrit stål stik.
    2. Bedøver mus, helst ved hjælp af en metode, der kontinuerligt leverer narkosemiddel (f.eks inhalerede isofluran).
    3. Ved hjælp af steril teknik, hår fjernes fra den incision websteder ved hjælp af klippere og / eller et hårfjerningsmiddel, og desinficer huden med alkohol efterfulgt af en betadine krat. For kateteret, skal du fjerne hår påregion, der strækker fra underkæben til toppen af ​​brystkassen og mellem kraveben. For eksternalisering af katetre bag hovedet, fjerne hår i området mellem bunden af ​​kraniet og interscapular regionen og desinficer huden med alkohol efterfulgt af en betadine krat.
    4. Læg musen på ryggen på en opvarmning overflade og under visning område af en kirurgisk mikroskop. Sikker halen og ekstremiteter med kirurgisk tape. Sikker hovedet i næse kegle leverer anæstesi.
    5. Lav en lille lodret midtlinie incision 5 mm cephalic til brystbenet. Brug pincet, stumpt dissekere vævet til at afsløre venstre sternocleidomastoideus muskel. Afspejler denne muskel til at udsætte venstre halspulsåren. Forsigtigt drille off bindevæv fra arterie. Det er vigtigt på dette punkt for at isolere vagus nerve fra arterie uden at beskadige enten arterie eller nerve.
    6. Isoler arterie og ligate de cephalic ende med silke sutur. Løst knude andenstykke af sutur på den caudale ende af den udsatte fartøjet.
    7. Klemme fartøj med en mikro-serrefine klemme på caudale ende og snit tæt under ligated ende med fjeder saks. Sæt forsigtigt kateter for så vidt angår klemme. Forsigtigt frigøre mikro-serrefine klemme og fremme kateter til silastic-PE krydset.
    8. Tie både ligaturer sikkert til kateteret og bekræfte, at kateteret prøver ved at forbinde den frie ende af kateteret til en prøveudtagning sprøjte.
    9. Lav en anden incision 5 mm til højre for midterlinjen og ca 2 mm caudale til det første snit. Brug pincet, stumpt dissekere det væv, afsløre og isolere de rigtige halsfedt.
    10. Forsigtigt ligate de cephalic ende med silke sutur og løst binde et andet stykke af sutur ved caudale ende.
    11. Skær lige under cephalic ligatur med fjeder saks og indsætte katetret op til fastholdelses perle. Bind en sutur bag perle og bekræfte, at kateteret prøver.
    12. Turn musen over og gøre et lille snit mellem skulderbladene.
    13. Tunnel en 14-gauge kanyle under huden fra den incision for arteriel kateter, på forsiden af ​​musen, til den interscapular incision på bagsiden. Før arteriekateter gennem nålen for at exteriorize det på bagsiden af ​​musen. Gentag dette for halsfedt kateteret ved tunneling den 14-gauge kanyle under huden på højre side af musen fra incisionssted på forsiden til interscapular incision på bagsiden.
    14. Spænd arteriekateter med en mikro-serrefine klemme på incisionssted mellem skulderbladene. Skær kateteret ~ 1 cm over denne klemme. Placer MASA tm med rustfrit stål stikkene vender mod hovedet af musen. Slut arteriekateter til rustfrit stål stikket peger mod venstre side af musen. Vær omhyggelig med at sikre, at der ingen huller eller knæk på kateteret. Gentag for venekateter,at tilslutte den til rustfrit stål stikket peger mod højre side af musen.
    15. Sæt MASA tm ind i indsnittet mellem skulderbladene. PE-20 slange, der svarer til halsfedt kateteret skal være til højre side af musen og PE-20 slange, der svarer til arteriekateter skal til venstre.
    16. Luk ventrale og dorsale incisioner med nylon sutur. For den dorsale lukning, kan sutur køres gennem hærdet silikone af MASA tm for at sikre det på plads. Bekræft åbenheden af ​​katetre ved hjælp af en rødmen opløsning med hepariniseret saltvand og et antibiotikum for at minimere risikoen for infektion. Placer musen i den varme, rent bur til umiddelbar bedring. Figur 2 viser det færdige produkt.
    17. Lad musen til at komme i mindst 5 dage. Monitor vægt og generelle sundhed. Udnyt den relevante postoperative smertestillende regime som er godkendt af institutionens Animal Care ogBrug udvalget.

    3. Hyperinsulinemic-euglycemic klemme

    1. Hurtig musen for 5-6h. Som reference, refererer tiden t = 0 min til slutningen af ​​den hurtige og begyndelsen af ​​insulin og glukose infusion (dvs. den klemme periode).
    2. Opsætningen og tid linje for et typisk eksperiment er vist i Figur 3. Brug Micro-Renathane eller tilsvarende slanger til infusion og prøveudtagning linjer. Suspendere en dual-channel dreje over musen. Dette fungerer som en hub mellem musen og infusion / prøvetagning sprøjter. Under eksperimentet stadig mus i et hjem bur eller lignende container og er bundet til den dreje.
    3. Inden etablering af musen, skal du udfylde den arterielle prøveudtagningsledningen med hepariniseret saltvand (10 U heparin / ml saltvand) og placere en rustfri stål-stik i den nederste ende af linjen. Efterlad en sprøjte med hepariniseret saltvand (clearing sprøjte) tilsluttet til toppen af ​​prøvetagningsledningen. Dette vil blive brugt til at udarbejde blod SAMPles.
    4. Fyld venøs infusion linje med ikke-hepariniseret saltvand fra infusionen port swivel (Segment A i figur 3A) hele vejen til bunden af linjen. Sæt den øverste ende af linjen og placere en rustfri stål-stik (eller et Y-stik, hvis en bolus skal administreres) i den nedre ende af linjen. Hvis en isotopisk glukose tracer (fx [3 - 3 H] glukose) er ved at blive infunderet, sikre en 1 ml sprøjte indeholder sporstof til en infusion sprøjte. Fyld venøs infusion linje med sporstof i stedet for saltvand (figur 3B).
    5. Tre timer i den hurtige, vejer musen og tilslut PE-20 for halsfedt og arterielle katetre til infusion og prøveudtagning linjer, hhv.
    6. Hvis administration [3 - 3 H] glukose tracer, begynder en primet-kontinuerlig tracer infusion ved t = -90 min (figur 3C). En typisk grunding dosis er 1 μCi. Forbered en 0,05 μCi / mikroliter [3 - 3 H] glukose Solution i ikke-hepariniseret saltvand. Læg løsningen i en 1 ml sprøjte og sikre sprøjten i en infusionspumpe. Administrer den grunding dosis ved at tilføre 20 μl / min i 1 min. Følg med en kontinuerlig infusion på 0,05 μCi / min (1 ml / min) for et 90 min ligevægt periode.
    7. Forbered infusates af insulin og glucose. Insulin er udarbejdet i ikke-hepariniseret saltvand indeholder 3% plasma som en transportør (en passende koncentration af BSA kan også bruges). Glucose infusates er kommercielt tilgængelige i en række af fusioner (5, 20 og 50%).
    8. Forbered saltvand-vasket erythorocyte infusate ved at indhente fuldblod fra en donor mus, helst af den samme stamme baggrund som de eksperimentelle musen. Typisk 1 ml fuldblod er nødvendige pr studere mus. Centrifugér blodet til at adskille erytrocytter. Vask erythrocytter med 10 U / ml hepariniseret saltvand og centrifuger til at skille sig af med saltvand. Bestem mængden af ​​erytrocytter og resuspender i en tilsvarende mængde på 10 U / ml hepariseret saltvand.
    9. Tegn hver infusate i en 1 ml sprøjte og sikkert hver sprøjte til en person infusionspumpe. Tilslut hver sprøjte til en 4-vejs multistik (Figur 3).
    10. Ved t = -15 min tage en blodprøve ved langsomt at udarbejde 50-100 μl af blod ind i clearing sprøjten. Spænd arterielle prøvetagningsledningen og fjern clearing sprøjten. Ved hjælp af en håndholdt blodsukkerapparat, en blodsukkerværdi tage ved at fjerne klemme på arteriel prøvetagningsledningen og tillade blodet at strømme ind i blodsukkerapparat strimmel.
    11. Når glukose måling er taget, klemme den arterielle prøvetagningsledningen og indsætte en stump-kanylesprøjten (prøveudtagning sprøjte) i den arterielle prøveudtagsledning. Fjern klemmen og tegne en mængde blod (se note) i sampling sprøjten. Spænd arterielle prøvetagningsledningen og fjern prøveudtagning sprøjten. Sæt clearing sprøjten tilbage i den arterielle prøveudtagsledning. Træk op i stemplet for at fjerne eventuelle luftbobler og re-tilføre50-100 μl af blod, der oprindelig blev udarbejdet.

    Bemærk: Mængden af udtagne blod beror på en analyse, der udføres. For eksempel, en analyse af [3 - 3 H] kræver glukosekoncentrationen 10 μl af plasma, så 50 μl af blod er tegnet. Dette giver 20-30 μl af plasma, hvilket er tilstrækkeligt for analysen plus ekstra plasma hvis det er nødvendigt. Målinger af hormoner og andre metabolitter (fx insulin, frie fedtsyrer) kræver prøvetagning af ekstra blod.

    1. Dispenser blodet i prøveudtagningen sprøjten i et EDTA-belagt mikrorør. Centrifuger og indsamle plasma. Hold plasma på is indtil slutningen af ​​studiet eller umiddelbart opbevares ved -20 ° C.
    2. Gentag trin 3,10 ved 3,12 ved t = -5 min. Indhente yderligere blod (50 μl) til måling af basal plasma insulin niveauer. Mål baseline hæmatokrit ved at trække blod ind i en heparin-eller EDTA-behandlede kapillarrør. Målingerne indhentes frabout plasmaprøver ved t = -15 og -5 min repræsenterer baseline (dvs. fastende) værdier.
    3. Efter at prøven ved t = -5 min fylde infusionsslanger for glucose, insulin og saltholdige-vasket erytrocytter op til 4-vejs stik. Tilslut 4-vejs stik til slangen fastgjort til dreje infusion port (eller slange forbundet til Y-stik, hvis infusion [3 - 3 H] glukose) som vist i figur 3.
    4. Begynd infusion af den saltholdige-vaskede erytrocytter først. Indstil infusionshastigheden til at erstatte den samlede mængde af blod blive opsamlet gennem hele undersøgelsen (fx hvis et alt 500 μl af blod er opsamlet gennem 120 min af studiet, skal du angive infusionshastigheden til 4,2 μl / min). I modsætning til de andre infusates er erytrocyt løsningen røde. Infusion af denne løsning først giver mulighed for enhver potentiel modstand eller forhindringer i infusionen strækninger, der skal identificeres og korrigeres.
    5. Når erythrocyt infusate når musen, begynder insulin ogglukose infusioner. Dette er nu t = 0 min. Insulin er infunderes med en konstant, forud fastsat sats. En insulin infusionshastighed af 4 mU • kg -1 • min -1 typisk vil undertrykke endogene glukoseproduktion ved 80-100% og stimulerer glukose forsvinden med 2-3 gange. Den indledende glukose infusionshastighed (GIR) er estimeret baseret på baseline blodsukkerniveau og tidligere erfaringer.
    6. Hvis infusion [3 - 3 H] glukose, kan man vælge at øge tracer infusionshastigheden til at matche den anslåede stigning i glukose omsætningen (typisk en 2-3 gange stigning).
    7. I betragtning af den høje glukose omsætning i musen, skal blodprøverne tages fra den arterielle linje ikke mindre end hver 10 minutter til måling af glukose koncentrationen gennem hele forsøget. Juster GIR at opnå og fastholde målet euglycemia (figur 3C). Dette mål kan variere afhængigt af model eller formålet med undersøgelsen. Et godt mål glucose koncentration er 150 mg • dL-1, da dette er et typisk 6h fastede glukose niveau i en Chow-fodret C57Bl/6J mus.
    8. Målet er at opnå euglycemia hurtigt, helst inden for de første 40-50 min, og at have glukose og GIR stabil i begyndelsen af ​​steady state perioden (t = 80 min).
    9. Hvis infusion [3 - 3 H] glukose, få yderligere blod ved t = 80, 90, 100, 110 og 120 minutter til måling af plasma-[3 - 3 H] glukose specifikke aktivitet.
    10. Indsamle yderligere blod ved t = 100 og 120 min til måling af plasma insulin og andre hormon (r) eller metabolit (ter). Ved t = 110 min, trække blod ind i en heparin-eller EDTA-behandlede kapillarrør for måling af klemme hæmatokrit.
    11. Efter at prøven ved t = 120 min er taget, 2 [14 C] deoxyglucose kan gives til måling af vævsspecifikke glukoseoptagelse. Administrere en 12 μCi bolus i bolus linje tilsluttet jugularis prøveudtagsledning (figur 3B
    12. Opnå blodprøver (50 μl) fra arterielle prøveudtagningsledningen ved t = 2, 15, 25 og 35 min efter indgift af bolus til måling af plasma-2 [14 C] deoxyglucose niveauer.
    13. Efter den sidste prøve, bedøver musen med en infusion af pentobarbital gives direkte i arterielle linje. Hurtigt dissekere alle væv er nødvendige for vurderingen af ​​glukose optagelse (f.eks skeletmuskulatur af forskellige typer, fedtvæv, hjerte, hjerne) og andre væv (fx lever, milt, nyrer). Snap fryse væv i flydende kvælstof og opbevares ved -80 ° C indtil analyse. Tissue glukose er analyseret ved at måle ophobningen af fosforyleret 2 [14 C] deoxyglucose i den frosne væv og forsvinden af 2 [14 C] deoxyglucose fra plasma.

    4. Repræsentative resultater

    Et eksempel på resultater fra et insulin clamp forsøget, vises i Figur 4.Dette eksempel viser muligheden for en højt fedtindhold kost til udfældning insulinresistens hos mus. Alle præsentationer af insulin clamp Resultaterne skal omfatte de følgende for at være fortolkelige: en tid løbet af blodsukkerniveauet, en tid løbet af GIR og plasma insulin-niveau (baseline og klemme). Som vist her, fastende glukose (figur 4A) og insulin (figur 4C) er højere hos mus fodret med et højt fedtindhold kost, tegn på insulinresistens. At præsentere en tid løbet af blodsukkerniveauet i hele klemme studiet (Figur 4A) gør det muligt for læseren at vurdere, hvor godt euglycemia blev opretholdt, hvilket er tegn på kvaliteten af klemmen. Tilsvarende, en tid løbet af GIR (Figur 4B) gør det muligt for læseren at afgøre, hvor hurtigt en steady state blev opnået. Viser disse data som tidsforløbet er betydeligt mere informativ end den konventionelle praksis i musen insulin clamp litteratur for at præsentere en 2-timers eksperimentsom en enkelt datum point svarende til gennemsnitlige værdier fra en udefineret "klemme" periode (4-13). I det aktuelle eksempel var blodsukkerniveauet lige mellem kontrol og høj fedt-fodret grupper, men GIR var signifikant lavere i den høje fedt-fed gruppe (figur 4B). Dette er tegn på en svækkelse i hele kroppen insulin handling. Clamp insulin niveauet var også højere i den høje fedt-fed gruppe (figur 4C), yderligere støtte til tilstedeværelsen af en insulin resistente fænotype i disse mus. Brugen af ​​isotopiske sporstof infusioner giver mulighed for vurdering af insulin indsats i specifikke væv. [3 - 3 H] glukose bruges til at estimere hastigheden af endogene glukose udseende (endoRa), som er et indeks af hepatisk glukoseproduktion (HGP), og satsen for hele kroppen glukose forsvinden (RD). Ud fra følgende betragtninger insulin helt undertrykker HGP i kontrol mus, er dette nedsat hos mus fodret med et højt fedtindhold kost (Figur 4D). Tilsvarende evne til isulin at stimulere Rd i kontrol mus er kompromitteret hos mus fodret med et højt fedtindhold kost (Figur 4E). 2 [14 C] deoxyglucose bruges til at vurdere glukose metaboliske indeks (Rg), et mål for vævsspecifikke glukoseoptagelse. Som det ses i dette eksempel, er insulin-stimuleret glukoseoptagelse i skeletmuskulaturen nedsat hos mus fodret med et højt fedtindhold kost (Figur 4F).

    Figur 1
    Figur 1: Forberedelse af arteriel (A) og (B) venøse katetre og (C) MASA tm. Arterielle katetre er udarbejdet ved at indsætte en 1,3 cm stykke af PE-10 ca 3 mm ind i en 6 cm stykke på 0,012 "ID silastic. PE-10 tip er facetslebne sådan, at længden fra facet til silastic er 0,9 cm. Venøs katetre er lavet ved at skubbe et lille stykke af 0,020 "ID silastic 1,1 cm fra det afskårne slutningen af ​​en 6 cm stykke på 0,012" ID silastic. The 0,020 "ID silastic stykke fungerer som en fastholdende perle at se helbrede kateter til halsfedt. Til samling af MASA tm, hver af to 1,3 cm 25-gauge stik er sat i hver af to 3 cm stykker PE-20. Disse er holdt sammen af ​​et lille stykke af 0,040 "ID silastic. Stikkene er bøjet til en 120 ° vinkel og adskilt i en 45 ° vinkel. Hele samlingen er nedsænket i medicinsk silikone klæber.

    Figur 2
    Figur 2: Catheterized mus. Katetre er indopereret i venstre halspulsåren og højre halsfedt. De frie ender af katetre er eksternaliseres bag hovedet og forbundet til en MASA tm. Den MASA tm indsættes subkutant mellem skulderbladene. Dette giver mulighed for vaskulær adgang under insulin clamp eksperimenter uden det er nødvendigt at begrænse, håndtere eller bedøver musen.

    jpg "/>
    Figur 3: skildring af setup og tid linje for et insulin clamp eksperiment. Musen er bundet til en dual-channel drejelig, der fungerer som et knudepunkt for infusion og prøveudtagning sprøjter. Typiske opsætninger for forsøg, der ikke bruger sporstof infusioner (A) og ved hjælp af både [3 - 3 H] glukose og 2 [14 C] deoxyglucose (B) er vist. En tidslinje af procedurerne for oprettelse og udføre insulin clamp (C) er også vist. I løbet af klemmen, blodprøver ( blod ) Er taget hver 10 min til at måle blodsukker. Det GIR er justeret i overensstemmelse hermed for at opretholde euglycemia. Prøver til baseline blodsukker, plasma insulin, og plasma [3 - 3 H] glukose er taget ved t = -15 og -5 min. Prøver til klemme plasma-[3 - 3 H] glukose er taget ved t = 80, 90, 100, 110 og 120 og til klemme insulin ved t = 100 og 120 min. 2 [14 C] deoxyglucose administreres efter prøven ved t = 120 min, og blood er indsamlet ved t = 2, 15, 25 og 35 min efter. Væv er truffet, efter at t = 35 min prøve.

    Figur 4
    Figur 4: Resultater fra et insulin clamp eksperiment sammenlignede mus på en kontrol kost (Chow) til mus på et højt fedtindhold kost (HFD). Tidsforløbet for arteriel glukose (A) og GIR (B), baseline og klemme insulin (C), EndoRa (D), og Rd (E) og skeletmuskulatur (gastrocnemius og vastus lateralis) Rg (F) er vist. Alle resultater viser effekten af ​​højt fedtindhold fodringen til at inducere insulinresistens.

    Discussion

    Den hyperinsulinemic-euglycemic klemme, eller insulin clamp, er almindeligt anset for den "gyldne standard" metode til vurdering af insulin handling in vivo. Denne teknik er blevet anvendt på flere arter, herunder mennesket, hunde, rotter og mus. I betragtning af det voksende antal af transgene musemodeller for stofskiftesygdomme, har miniaturisering af teknikken til brug i musen ydet betydelig forskud til metabolisk forskning.

    Mens begreberne bag insulin clamp er ligetil, men i praksis er der forskellige tilgange til at udføre insulin clamp eksperimenter. Dette er ikke et trivielt punkt, da den måde, hvorpå forsøget er udført påvirker resultater 1. Her præsenterer vi den protokol, der bruges af Vanderbilt MMPC. Den afgørende forskel mellem vores protokollen, og at andres er, at vi bruger en arteriel kateter for at få blodprøver. Dette står i kontrast til den mere udbredte tilgang OBTaining blodprøver ved at bryde spidsen af halen 4, 7, 11, 12, 14-17. Fordelen ved prøvetagning fra en arteriel kateter er, at forsøget er udført i en bevidst og uhæmmet mus. Prøveudtagning fra halen ofte kræver tilbageholdenhed og øger indekser af stress, når store blodprøver er anskaffet 1. Stress hormoner stimulerer endogene glukose produktion og forringe deponering af glukose 18, 19, potentielt giver indtryk af en insulin resistent fænotype. Prøveudtagning fra de afhuggede halen kan kræve særlige institutionelle Animal Care og Brug sin godkendelse på grund af sin belastende karakter. Den arterielle kateterisation procedure blev udviklet for at undgå stress til musen i overskæring halen.

    Et centralt aspekt ved udførelse af insulin klemmer er evnen til at fastholde euglycemia. Der er ingen algoritmer, der kan rigtigt forudsige hvordan GIR skal justeres på baggrund af blodsukkermålinger. Ligesom kirurgi,personale, der giver insulin clamp forsøg vil blive dygtige i at opretholde en rimelig euglycemia kun gennem erfaring. Det er vigtigt at bemærke, at på grund af deres højere stofskifte oplysningerne fra muse-studier vil være potentielt støjende. Dette gør den samlede præsentation af data, herunder tidsforløbet af glukose og GIR og absolutte værdier for plasma insulin, endoRa, Rd og Rg afgørende for evnen til enhver læser at fortolke resultaterne. Den høje glukose flux satser i musen (ca. 5 gange højere end den kurs hos mennesker), berettiger en høj frekvens af glukose prøveudtagning. Mens blodvolumen af ​​musen er begrænset, et minimum sampling-frekvens på én gang hver 10 minutter er nødvendigt at være sikker på, at en tilstrækkelig klemme er opnået.

    Som vist i figur 4, kan klemme insulin niveauer være forskellig mellem grupperne. Faktorer som kost interventioner, transgene manipulationer eller forskelle i baggrunden stammer kan påvirke fasTing insulin niveauer, hvilket efterfølgende kan påvirke klemme insulin niveauer. Fortolkning af resultater, når klemme insulin niveauer er forskellige, kan være problematisk. Dette kan eksperimentelt løses gennem pilotforsøg for at vælge insulininfusion satser, som medfører tilsvarende klemme insulin niveauer mellem grupperne. Alternativt kan somatostatin bruges til at hæmme bugspytkirtlen hormon sekretion, og insulin og glukagon kan udskiftes på eksperimentelt kontrollerede priser. Sidstnævnte fremgangsmåde er mere almindeligt gjort i insulin klemmer på rotter end mus. Hvis disse eksperimentelle metoder ikke er truffet, kan steady-state GIR være normaliseret til klemme insulin-niveau, eller en insulinfølsomhed indeks (S I) kan afledes fra klemme data, som S I = GIR / (G • ΔI), hvor G er den steady state-glukose koncentration og ΔI er forskellen mellem faste og klemme insulin koncentrationer. En antagelse med enten tilgang er, at klemmen insulin opnåede niveau erinden for det område, hvor følsomheden for insulin er lineært relateret til insulin niveau ifølge gruppen bliver undersøgt. Sidstnævnte antagelse gælder muligvis ikke, når man sammenligner insulin resistente og insulin følsomme grupper. Ideelt set bør en insulin-dosis-respons kurve blive genereret for at vælge den rigtige insulin infusion. Men på grund af kravet om yderligere eksperimenter, er det sjældent gjort.

    Den alsidighed, som arteriel kateterisation strækker sig til eksperimentelle tilgange end euglycemic klemmer. For eksempel kan hyperglycemic klemmer, hvor glukose er infunderes med en variabel rente til at opretholde hyperglykæmi i forhold til fastende glukose, der anvendes til at vurdere endogen pancreasfunktionen in vivo 2, 20, 21. Målingen af ​​første fase insulinsekretion under denne test kræver hyppig erhvervelse af blodprøver (dvs. hver 2-5 min), som ikke er mulig, når at få prøver fra spidsen af ​​halen. Desuden erforhøjede katekolaminer som følge af halen udtagning kan forringe insulinsekretion og forbedrer glucagon sekretion 22. Den insulin clamp-protokollen kan også ændres for at tillade for glucose niveauer til at falde til i forhold hypoglykæmi at vurdere modreguleret svar 2, 23, 24. Arteriel kateterisation kan også bruges til at vurdere dynamikken i glukosemetabolismen under træning 25-30. Dette er væsentligt fordelagtigt i forhold til konventionelle metoder udført på en enkelt tidspunkter før og efter motion eller i isolerede muskler ex vivo. De teknikker, der præsenteres her kan også bruges til at vurdere ikke blot glucose, men også fedtsyre stofskiftet 31.

    Disclosures

    Ingen interessekonflikter erklæret.

    Acknowledgements

    Dette arbejde blev støttet af Grant 5-U24-DK059637-10 til Vanderbilt Mouse metaboliske Fænotype Center.

    References

    1. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
    2. Berglund, E. D., Li, C. Y., Poffenberger, G., Ayala, J. E., Fueger, P. T., Willis, S. E., Jewell, M. M., Powers, A. C., Wasserman, D. H. Glucose metabolism in vivo in four commonly used inbred mouse strains. Diabetes. 57, 1790-1799 (2008).
    3. Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism. J. Biol. Chem. 272, 22570-22575 (1997).
    4. Kim, H. J., Higashimori, T., Park, S. Y., Choi, H., Dong, J., Kim, Y. J., Noh, H. L., Cho, Y. R., Cline, G., Kim, Y. B., Kim, J. K. Differential effects of interleukin-6 and -10 on skeletal muscle and liver insulin action in vivo. Diabetes. 53, 1060-1067 (2004).
    5. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Chen, Y., Yu, C., Moore, I. K., Pypaert, M., Lutz, E. P., Kako, Y., Velez-Carrasco, W., Goldberg, I. J., Breslow, J. L., Shulman, G. I. Tissue-specific overexpression of lipoprotein lipase causes tissue-specific insulin resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 7522-7527 (2001).
    6. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Gavrilova, O., Chao, L., Higashimori, T., Choi, H., Kim, H. J., Yu, C., Chen, Y., Qu, X., Haluzik, M., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Differential effects of rosiglitazone on skeletal muscle and liver insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. Diabetes. 52, 1311-1318 (2003).
    7. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Sunshine, M. J., Albrecht, B., Higashimori, T., Kim, D. W., Liu, Z. X., Soos, T. J., Cline, G. W., O'Brien, W. R., Littman, D. R., Shulman, G. I. PKC-theta knockout mice are protected from fat-induced insulin resistance. J. Clin. Invest. 114, 823-827 (2004).
    8. Kim, J. K., Gavrilova, O., Chen, Y., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Mechanism of insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. J. Biol. Chem. 275, 8456-8460 (2000).
    9. Kim, J. K., Gimeno, R. E., Higashimori, T., Kim, H. J., Choi, H., Punreddy, S., Mozell, R. L., Tan, G., Stricker-Krongrad, A., Hirsch, Inactivation of fatty acid transport protein 1 prevents fat-induced insulin resistance in skeletal muscle. J. Clin. Invest. 113, 756-763 (2004).
    10. Kim, J. K., Kim, H. J., Park, S. Y., Cederberg, A., Westergren, R., Nilsson, D., Higashimori, T., Cho, Y. R., Liu, Z. X., Dong, J., Cline, G. W., Enerback, S., Shulman, G. I. Adipocyte-specific overexpression of FOXC2 prevents diet-induced increases in intramuscular fatty acyl CoA and insulin resistance. Diabetes. 54, 1657-1663 (2005).
    11. Kim, J. K., Kim, Y. J., Fillmore, J. J., Chen, Y., Moore, I., Lee, J., Yuan, M., Li, Z. W., Karin, M., Perret, P., Shoelson, S. E., Shulman, G. I. Prevention of fat-induced insulin resistance by salicylate. J. Clin. Invest. 108, 437-446 (2001).
    12. Kim, J. K., Michael, P. revis, Peroni, S. F., Mauvais-Jarvis, O. D., Neschen, F., Kahn, S., Kahn, B. B., R, C., Shulman, G. I. Redistribution of substrates to adipose tissue promotes obesity in mice with selective insulin resistance in muscle. J. Clin. Invest. 105, 1791-1797 (2000).
    13. Kim, J. K., Zisman, A., Fillmore, J. J., Peroni, O. D., Kotani, K., Perret, P., Zong, H., Dong, J., Kahn, C. R., Kahn, B. B., Shulman, G. I. Glucose toxicity and the development of diabetes in mice with muscle-specific inactivation of GLUT4. J. Clin. Invest. 108, 153-160 (2001).
    14. Haluzik, M., Gavrilova, O., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha deficiency does not alter insulin sensitivity in mice maintained on regular or high-fat diet: hyperinsulinemic-euglycemic clamp studies. Endocrinology. 145, 1662-1667 (2004).
    15. Haluzik, M., Yakar, S., Gavrilova, O., Setser, J., Boisclair, Y., LeRoith, D. Insulin resistance in the liver-specific IGF-1 gene-deleted mouse is abrogated by deletion of the acid-labile subunit of the IGF-binding protein-3 complex: relative roles of growth hormone and IGF-1 in insulin resistance. Diabetes. 52, 2483-2489 (2003).
    16. Haluzik, M. M., Lacinova, Z., Dolinkova, M., Haluzikova, D., Housa, D., Horinek, A., Vernerova, Z., Kumstyrova, T., Haluzik, M. Improvement of insulin sensitivity after peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment is accompanied by paradoxical increase of circulating resistin levels. Endocrinology. 147, 4517-4524 (2006).
    17. Kim, H., Haluzik, M., Asghar, Z., Yau, D., Joseph, J. W., Fernandez, A. M., Reitman, M. L., Yakar, S., Stannard, B., Heron-Milhavet, L., Wheeler, M. B., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment in a transgenic model of type 2 diabetes reverses the lipotoxic state and improves glucose homeostasis. Diabetes. 52, 1770-1778 (2003).
    18. Deibert, D. C., DeFronzo, R. A. Epinephrine-induced insulin resistance in man. J. Clin. Invest. 65, 717-721 (1980).
    19. Rizza, R. A., Cryer, P. E., Haymond, M. W., Gerich, J. E. Adrenergic mechanisms for the effects of epinephrine on glucose production and clearance in man. J. Clin. Invest. 65, 682-689 (1980).
    20. Nunemaker, C. S., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Sweet, I. R., Teague, J. C., Satin, L. S. Insulin secretion in the conscious mouse is biphasic and pulsatile. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 523-529 (2006).
    21. Nunemaker, C. S., Zhang, M., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Powers, A. C., Bertram, R., Sherman, A., Satin, L. S. Individual mice can be distinguished by the period of their islet calcium oscillations: is there an intrinsic islet period that is imprinted in vivo. Diabetes. 54, 3517-3522 (2005).
    22. Halter, J. B., Beard, J. C., Jr, P. orte, D, Islet function and stress hyperglycemia: plasma glucose and epinephrine interaction. Am. J. Physiol. 247, 47-52 (1984).
    23. Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 678-684 (2006).
    24. Jacobson, L., Ansari, T., Potts, J., McGuinness, O. P. Glucocorticoid-deficient corticotropin-releasing hormone knockout mice maintain glucose requirements but not autonomic responses during repeated hypoglycemia. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291, 15-22 (2006).
    25. Ayala, J. E., Bracy, D. P., James, F. D., Julien, B. M., Wasserman, D. H., Drucker, D. J. The glucagon-like peptide-1 receptor regulates endogenous glucose production and muscle glucose uptake independent of its incretin action. Endocrinology. 150, 1155-1164 (2009).
    26. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Granner, D. K., Wasserman, D. H. Hexokinase II overexpression improves exercise-stimulated but not insulin-stimulated muscle glucose uptake in high-fat-fed C57BL/6J mice. Diabetes. 53, 306-314 (2004).
    27. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Wasserman, D. H. Distributed control of glucose uptake by working muscles of conscious mice: roles of transport and phosphorylation. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 286, 77-84 (2004).
    28. Fueger, P. T., Heikkinen, S., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Laakso, M., Wasserman, D. H. Hexokinase II partial knockout impairs exercise-stimulated glucose uptake in oxidative muscles of mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285, 958-963 (2003).
    29. Fueger, P. T., Hess, H. S., Posey, K. A., Bracy, D. P., Pencek, R. R., Charron, M. J., Wasserman, D. H. Control of exercise-stimulated muscle glucose uptake by GLUT4 is dependent on glucose phosphorylation capacity in the conscious mouse. J. Biol. Chem. (2004).
    30. Fueger, P. T., Li, C. Y., Ayala, J. E., Shearer, J., Bracy, D. P., Charron, M. J., Rottman, J. N., Wasserman, D. H. Glucose kinetics and exercise tolerance in mice lacking the GLUT4 glucose transporter. J. Physiol. 582, 801-812 (2007).
    31. Shearer, J., Coenen, K. R., Pencek, R. R., Swift, L. L., Wasserman, D. H., Rottman, J. N. Long chain fatty acid uptake in vivo: comparison of [125I]-BMIPP and [3H]-bromopalmitate. Lipids. 43, 703-711 (2008).

    Comments

    21 Comments

    Dear auther
    I would like to know if the disc accomodating the arterial and venus cathters tunneled under the skin and allowing the catheter antenas to protude is a commercial item and if not how do you produce it ?
    Thank you Rona
    Reply

    Posted by: Rona S.November 29, 2012, 8:09 AM

    Dear Rona,
    If you are referring to the MASA, please refer to section 1 of this article - "Preparation of catheters and the Mouse Antenna for Sampling Access". This section describes how to make the disc. Bend two 1.3 cm pieces of ²5 gauge steel tubing to about 1²0 degrees. Insert a 3 cm piece of PE-²0 into each steel tube. Secure both pieces of steel tubing to each other with a 5mm piece of silastic tubing. Dip the steel tubes into a drop of medical grade silicone adhesive such that the PE-²0 is vertical and the free steel tube ends come out of the bottom of the drop at about a 45 degree angle separation. Let the adhesive become solid overnight. I hope this helps.
    Best regards,
    Julio Ayala
    Reply

    Posted by: Julio A.November 29, 2012, 8:46 AM

    Dear Julio
    Yes this was my question
    Thank you for the explenation
    All the best Rona
    Reply

    Posted by: Rona S.November 29, 2012, 9:39 AM

    Hello Julio, I wonder how you maintain catheters. Should I flush them with heparinized saline everyday? Even if flushing everyday, catheters are clogged easily. Do I need higher heparin than 200 U/ml for flushing? Give me some advice, please? Thank you,
    Reply

    Posted by: Teayoun K.March 26, 2014, 1:17 PM

    Hello Teayoun,
    This may depend on the material that you use for the tubing that is attached to the MASA. Originally, we used microrenathane tubing and would flush the lines daily with 200 U/ml hep saline. We have since started using PE-20 instead of microrenathane and find that we do not need to flush the lines (sometimes we will flush the lines 3 days after surgery just for good measure). With either approach, you will inevitably have some catheters clog, but this should not occur often. If you are flushing your lines daily and most of your catheters are still clogging, then there is likely another issue (perhaps the placement of the catheter is not correct?). Is this the arterial or the venous catheter? If it is the arterial catheter, is it sampling on the day of the surgery? How long until it clogs?

    Julio
    Reply

    Posted by: Julio A.March 26, 2014, 2:06 PM

    Julio,

    Thank you for quick response. Yes, I use microrenathane to make venous catheter body, but the tip of catheter is PE-20. If the material itself is problem, I will try PE-20 to make the body part of catheter. The catheter was working well (infusion was easy and smooth as a confirmation after implantation surgery done). Arterial catheter is a commercial one from Alzet (designed for mouse jugular vein, but works well for mouse carotid artery). I've heard some comments from others. heparin causes lipolysis and changing body metabolism and streptokinase may be a problem due to microbial material causing immune response. I'm still not 100% comfortable on catheter maintenance. Metal plug was used, but it's same. I don't know exact reason yet. I wish I could figure it out soon. Thank you,
    Reply

    Posted by: Teayoun K.March 28, 2014, 12:20 PM

    Teayoun,
    I would not recommend using PE or microrenathane for the catheter body (either vein or artery). PE is too rigid and microrenathane is too porous and prone to react (clot). It is my understanding that the Alzet catheters are made with polyurethane which, like the microrenathane, is too porous. I woudl recommend making the catheters as shown in this article (silastic for the vein and silastic with a PE-10 tip for the artery). Heparin will have an effect on lipolysis, but the amounts and frequency with which you flush should not have significant effects on metabolism. Also, when checking the catheters after the surgery, make sure that you can draw blood, not just infuse smoothly. Sometimes you can infuse very smoothly but cannot draw blood, which means that the catheter is not in place.
    Reply

    Posted by: Julio A.March 28, 2014, 3:42 PM

    Dear author,
    Can you please provide a product number and purchasing source for the "medical silicone adhesive" used for MASA construction?
    thank you
    Joe C.
    Reply

    Posted by: Joseph C.April 8, 2014, 5:11 PM

    Hi Joe C.

    You can get it from Fisher:

    FACTOR II INC MEDICAL ADHESIVE SIL TYPE A Catalog No.: NC9938868 Medical Adhesive, Type A

    Good luck!
    Julio
    Reply

    Posted by: Julio A.April 11, 2014, 4:15 PM

    Dear Dr.Ayala,

    We performed surgery following your protocol, 5 days later, animals gain body weight back and both catheters stay open.We try to clamp the blood glucose level around 150mg/dl, The insulin dose is 4mU/kg.min. The fasting glucose level of our mice is around 120, During the H3 tracer infusion phase, the blood glucose level normally dropped to around 100, but will not fluctuate a lot. However when we stared insulin and glucose infusion, the blood glucose can be stable for 40 mins then suddenly drop to below 100. Then we increased GIR, the blood glucose will come back to 150s but will not stay there, after 30 mins to 40 mins it will dip again.
    We dissect the mice after surgery, to make sure there was no leakage.
    We paid attention to small blood sample size,donor blood,and we controlled temperature, we kept environment quiet. We fast mice 3hrs before clamp. Could you please give us some suggestions for trouble shooting? Thanks a lot.
    Reply

    Posted by: Kai M.April 15, 2014, 11:17 AM

    Hello,
    Without seeing our data, particularly the time course of your glucose infusion and glucose levels, I really cannot tell you whether your experience is unusual. When you say that "it dips again", does it dip below 100 mg/dL? Does it dip by 5, 10 mg/dL? How much are you changing the glucose infusion rate? Are these wild-type mice or a transgenic line? You can contact me directly at jayala@sanfordburnham.org if you want to discuss further.
    Reply

    Posted by: Julio A.April 16, 2014, 10:32 AM

    Dear Dr.Ayala,

    I used to use micro-renathane tubing to make venous catheter tip, however Micro-renathane is rigid, half of my catheter penetrate the venous wall, I end up with all my infusate leaked into chest cavity. Then I start to follow your instruction to make venous catheter with silastic tubing. However, I found quite a few my surgery failed because my ligation on the catheter will leak after 3,4 days. No matter how tight I made the ties, or add 1 or two more sutures, it didn't improve. I always found a big lump of infusate formed after clamp subcutaneously near the neck. I am using 6-o silk suture now. Can you please give me some hint to improve the procedure?

    Thanks
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 12:32 PM

    Hello Kai. I am Carlo and the hands doing the surgical procedure parts of the video are attached to my body :-). Kidding aside, do the opposite. Try tying over the vessel/catheter with the least possible pressure. The guide is: once you see that the suture knot is deforming the silastic tubing, you are tying too tight! You only need the suture to be snug and it should hold in the vessel without affecting the patency or causing it to leak. Let me know if this tip works.
    Reply

    Posted by: Carlo M.October 2, 2014, 1:29 PM

    Thanks. I will try it!

    Kai
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 4:11 PM

    Dear Kai,
    Are you making the silastic "collar" using 0.020" ID silastic as shown in Fig. 1B? If you tie your suture behind this collar, it should secure the catheter in the vessel.
    Reply

    Posted by: Julio A.October 2, 2014, 1:05 PM

    Dr.Ayala, Thanks for your reply, Yes I do, the leakage always happens around the ties before the docking beads. The ties can secure the catheter for about 4days. I doubt if my 7-o suture is too sharp, ( I typo a 6-O suture in the previous comment).so the it damage the wall of blood vessel . Can you tell me what size do you use? Another concern is if the silastic tubing is too soft. The leakage rarely happens when I use Micro-renathane tubing. Thanks.
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 1:25 PM

    Also, just out of curiosity, are you making your venous catheter as a single 6cm long piece of silastic? I ask because in your original comment, you referred to the "venous catheter tip". I was just wondering if you were trying to make it the same as the arterial catheter. It should just be a single piece of silastic with the collar slipped over it. I just saw that Carlo Malabanan posted a reply as well. He is an expert at this surgery.
    Reply

    Posted by: Julio A.October 2, 2014, 1:38 PM

    We use 7-0 sutures and silastic tubing and have not had leaking problems with the silastic. I will confer with my colleagues at Vanderbilt to see if they have seen this before.
    Reply

    Posted by: Julio A.October 2, 2014, 1:31 PM

    Dear Malabanan

    Could you kindly explain why 7-o is better than 6?

    Thanks
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 2:56 PM

    Dr.Ayala,

    I called the part in fornt of docking beads the "tip" , yes I used a whole piece of silastic tubing as my catheter.Thanks.
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 1:47 PM

    Dr.Ayala and Dr.Malabanan
    I figured out the reason for venous leakage is didn't insert the catheter deep enough, since I worry about the tip of venous catheter penetrating the venous wall, I only use 9mm long tip. Which cause a dead space in the vein where blood will stay and form clot, once the clot block the vein, the pressure will build up and eventually burst the venous wall when I start to infuse.Now as you suggested I am using 11mm long tip, which will stay close enough to the heart, and no clot will form before the opening of catheter. Thanks For your help.
    Reply

    Posted by: Kai M.November 4, 2014, 1:04 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter