单侧颈脊髓损伤的挫伤模型,利用无限的地平线冲击

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Summary

描述一个可靠和可重复的方式来生产使用无限的地平线撞击宫颈单方面脊髓损伤。该方法采用自定义设计的框架的优势和取缔,以稳定脊柱。标准化的程序和损伤生物力学参数足够和持续的伤害结果。

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Lee, J. H., Streijger, F., Tigchelaar, S., Maloon, M., Liu, J., Tetzlaff, W., Kwon, B. K. A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor. J. Vis. Exp. (65), e3313, doi:10.3791/3313 (2012).

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Abstract

虽然大多数人的脊髓损伤,脊髓型颈椎病的发生,实验室研究的绝大多数员工在胸段脊髓受伤的脊髓损伤(SCI)的动物模型。此外,因为大多数人的脊髓损伤发生钝,非穿透性创伤(如机动车事故,运动伤害),脊髓被猛烈袭击流离失所的骨或软组织的结果,多数脊髓损伤的研究人员认为临床最相关的损伤模型是那些在脊髓迅速被撞伤。因此,在他们的方式对人类翻译的新疗法的临床前评价的重要的一步是评估其疗效挫伤脊髓损伤模型内脊髓型颈椎病。在这里,我们描述的技术方面和解剖和行为产生的单方面颈椎脊髓挫伤模型的成果,它采用了无限的地平线脊髓损伤撞击。

在C5 SD大鼠行单侧椎板左片面。以优化生物力学,功能和组织损伤模型结果的重复性,我们挫伤脊髓使用150 kdyn,影响力,22.5°(22.5°旋转的动物)的影响轨迹,影响位置关闭1.4毫米的中线。功能恢复使用缸饲养试验,阶梯测试水平,疏导长达6周的试验和改良蒙托亚的楼梯测试评估后,其中的脊髓进行了评估组织为白色和灰色的事情备用。

这里的损伤模型赋予一致的和可再生的生物力学部队到脊髓,任何实验性脊髓损伤模型的一个重要特征。在离散组织损伤脊髓侧半这结果主要包含到T他同侧伤害。伤害动物的耐受性良好,但在前肢的功能是在损伤后的周显著和持续的赤字。颈椎单方面损伤模型,这里可能是那些希望评估具有潜力的治疗之前,人类翻译研究的资源。

Protocol

1。成立控股动物和夹具设计的框架

  1. 框架和钳举行动物是定制设计,以容纳无限的地平线(IH)脊髓损伤冲击。
  2. 框架的基础是切成以下尺寸(30.2厘米×20.3厘米×1.3厘米),以适应来中转设备( 图1A)标准表指南支架的铝制平台。
  3. 四Flexaframe支持脚踏板(费希尔科学,多伦多,ON)连接平台和八个Flexaframe支持棒(尔科技,多伦多,30.5厘米)8 Flexaframe支持连接器( 图1B)组装使用。
  4. 另外两个Flexaframe支持连接器,连接到中间两棒,内部定制持有钳( 图1B)。
  5. 动物的脊髓是垂直旋转的角度,建立由keeping一年的水平杆的地方和不同高度的其他横向杆( 图2)。
  6. 钳是35.6毫米长,25.4毫米和7.6毫米颚硬性抢横突下方持有从C4至C6( 图1C)。钳位设计上的更多细节已秋 ,2009。

2。手术

  1. 雄性SD大鼠(查尔斯河实验室),体重300-350克异氟醚麻醉(归纳为4%和2%的维修),氧气(1升/分钟)。
  2. 一旦麻醉平面下的动物,动物被放置在一个立体框架(Kopf,图洪加,CA)的。
  3. 在手术过程0.4毫升的利多卡因(20毫克/毫升; Bimeda - MTC动物保健公司,剑桥大学,加拿大安大略省),以尽量减少出血肾上腺素肌肉注射周围手术部位在手背升颈部区域。
  4. 一个4-5厘米的背正中切口用无菌手术刀(15号),从颅底和延伸尾端。
  5. 使用无菌Adson钳直言不讳地剖析,以达到通过背部肌肉的脊椎,无菌ALM拉钩(精细的科学工具,北温哥华)被插入,以保持肌肉分开。
  6. 用15号手术刀,C4〜C7椎板肌肉覆盖刮掉,在中线开始,席卷他们的横向。
  7. 切口用无菌手术刀(15号),以适应钳下方的C4至C6横突附着在脊柱两侧横突的肌肉。
  8. 用无菌罚款放倒弗里德曼皮尔逊咬骨钳(精细的科学工具,北温哥华),左侧C5椎板小心被删除,以可视化的硬脊膜和脊髓。
  9. 与一个直径为1.5毫米的棒下武器下滑托动物,从而提高了脊柱略和促进钳插入。
  10. 到C6 C4的上侧横向流程的无菌钳颚安装并拧紧螺丝。
  11. 删除的ALM拉钩。

3。脊髓损伤

  1. 夹钳后,安装在动物,动物被移到中转冲击。
  2. 钳插入帧的中间两棒角为22.5°的水平( 图2)已抵押的金属支架。
  3. 剪式千斤顶,提供稳定的高度调整,(厂商VWR,米西索加)提出,直到动物奠定了平坦的。
  4. 确保钳钳上放置一个小缸水平和拧紧螺丝的水平。重要的是,所有螺丝都拧紧集是刚性没有任何运动。
  5. 程序的其余部分进行下MICR的Oscope(MZ8徕卡)。
  6. 降低和中转冲击垂直调节旋钮和两个水平调整旋钮,直到撞击尖端中心以上的5233棘突顶点徘徊,瞄准冲击小费(四舍五入的边缘,直径15毫米)。
  7. 一旦撞击尖为中心,把Y轴调节旋钮和两个第五圈(1.4毫米)的尖端移动左侧和x轴水平调整旋钮横向移动撞击尖C5的中心。
  8. 降低一角,直到它上面硬脑膜验证撞击尖瞄准灰质外侧半。
  9. 转动两圈提高尖端毫米4硬脑膜以上的垂直调节旋钮。
  10. 确保受影响的区域是用棉签或棍子干。
  11. 设置150 kdyn程序所需的力,然后按一下“开始实验”引发的冲击。
  12. 受伤后,伤口在Laye的封闭RS与5-0 vicryl缝线。丁丙诺啡(0.03毫克/千克SC,Temgesic; Kenilworth的先灵葆雅公司,新泽西州)和生理盐水(10毫升)皮下注射,每日两次手术后两天。动物密切监测,每天两次为2周,伤后6周每周。

4。代表结果

受伤在150 kdyn的力设置二十九个雄性SD大鼠(查尔斯河实验室),体重300-350克。旨在撞击尖到中线1.4 mm处,在22.5°垂直角度。平均实际力量是155.55±0.73 kdyn。平均排量为1512.72±27.86μm和速度是120.24±0.52毫米/秒( 图3)。

行为成果措施

水平的阶梯测试,饲养试验缸,梳洗测试,评估使用功能恢复,修改的蒙托亚楼梯测试1。动物受伤前的培训,并在伤后2,4和6周的评估。有显着前肢在整个实验期内持续的障碍。

受伤前的水平梯试验。,动物只有4.75±0.73%同侧前肢错误而穿越整个间隔不规则的横梯。受伤之后,动物的证明标记在前肢错误的百分比增加。同侧前肢%误差分别为26.97±2.92%,26.23±2.84%和22.06±2.05%2,伤后4周和6周,分别为( 图4A)。重要的是,本次测试的前肢减值持续6周。

缸饲养试验。同侧前肢的百分比(左+都)在勘探过程中使用SCI后显着下降。受伤前,动物用同侧前肢75.12±2.25%。受伤后,动物用同侧前肢8.59±1.80%2周,14.25±2.65%,4周和11.76±2.66%,在6个星期( 图4B)。

修改蒙托亚楼梯测试。同侧前肢检索的颗粒数量急剧下降后的损伤。受伤之前,收集的动物食物奖励84.85±2.88%。然而,在伤后2,4和6周,检索的动物只有30.91±4.03%,28.94±4.38%和25.86±3.09%的颗粒( 图4C)。

美容测试。在受伤后的仪容分数有大幅度降低。脊髓损伤后,同侧疏导分数分别为2周:2.00±0.17,4周:1.83±0.17和6周:1.79±0.11(Figu重新4D)。

病理结果

白质和灰质备用。例如在了150 kdyn的力量,角度为22.5°和1.4毫米的横向目标的脊髓损伤是在图5。损伤造成实质性损害同侧灰质和白质。皮质和红核脊髓束都受伤,23出29只动物有同侧内的实质损害。纵向的白色和灰色的事情损害程度是2400 rostrally和2400尾端( 图6)。当加入的部分提供了总值估计“累积蔓延”(2000微米的喙和尾震中)的白色和灰色的物质备用,同侧白色幸免问题只有51.8%和39.7%灰质剩余相比,对侧( 图6)。

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图1。无穷水平脊髓损伤的冲击。答:无限的地平线冲击和整体设置。 B.帧设置。 C.特写图像颈椎横突钳。 D.规格(单位:英寸)的钳。建议公差<0.002(秋等人 ,2009年)。 点击这里查看大图

图2
图2。插图和相应的帧设置要达到1.4毫米的横向目的脊髓旋转0°(中性)或B。22.5°。

图3
图3。代表力量和位移图的无限地平线冲击。我箭头ndicates撞击尖已达20 kdyn启动时记录位移点的时间。力随时间变化曲线的峰值读取实际的力量和相应的位移计算。下面的图表描绘一个典型的150 kdyn挫伤,A.位移随时间变化图,B.力与时间的关系图。这些图表表明,取得的实际力量是152 kdyn,和冲击位移到线测量是1287微米。 点击这里查看大图

图4
图4。力150 kdyn,冲击角为22.5°和1.4毫米的目的的行为评估留下的中线。水平梯试验。 B.缸饲养试验。 C.修改的蒙托亚楼梯测试。四美容测试。同侧前肢导致重大和sustai的NED障碍较对侧前肢。

图5
图5。受伤的脊髓延髓1600微米至尾鳍1600微米的代表图像。

图6
图6。组织学评估。 %的白人和灰质幸免。重要损害震中微米,大约是2000年在很大程度上幸免。 B.累积白色和灰质损害震中在2000微米幸免。同侧明显少幸免白色和灰色的事情相比,对侧。 点击这里查看大图

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Discussion

在本文中,我们描述了颈椎的单方面挫伤模型,使用在150 kdyn,关闭垂直角为22.5°,和一个1.4毫米的中线外侧目的的力量无限的地平线(IH)的冲击。通过这些设置,我们能够产生持续的行为,在所载主要同侧的实质破坏,同侧前肢的赤字,它出现相当大的损害发生地区的红核脊髓,网状,前庭和皮质脊髓束将有望运行。这种模式的发展发生了一系列的三个实验确定最佳的伤害力,影响中线的位置,旋转度。首先,我们发现损伤低于150 kdyn的部队没有产生足够的和持续的功能障碍。此外,与醒目的垂直线(即无旋转)的尖端冲击,我们经常观察到的F尖峰奥尔塞随时间变化的曲线,表明撞击尖击中腹侧椎管骨。许多动物也没有严重或持续的功能赤字。与此相一致,发现这些动物的组织学分析,突然发力尖峰的损害,实质损害,是温和,非常横向脊髓内放置。因此,我们旋转等冲击的轨迹是22.5°,垂直中线的动物。有更多的垂直脊髓撞击尖来,我们解决问题的打击椎管腹侧地板的一角,但我们观察到对侧脊髓相当实质损害。最后,我们的目的是在三个不同距离的中线,1.0,1.2和1.4毫米的冲击,使用150 kdyn力量和角度22.5°。我们注意到,有1.0,1.2和1.4毫米本身没有行为上的差异配件中用,但横向移动为目标的影响,这是更有可能的是总值的实质损害,可同侧上载。因此,我们在我们目前的22.5°垂直撞击尖,交付150 kdyn的损伤单方面挫伤设置抵达目的1.4毫米至中线左侧。

使颈椎损伤模型,为脊髓损伤的治疗试验提供的理由是明确的:大多数个人患有颈椎脊髓损伤,上肢功能是极为重要的这些人,和新颖的神经或neuroregenerative干预的临床试验越来越重视颈椎脊髓损伤患者,以作为测量结果使用节段性运动功能恢复。发生颈髓损伤可以通过裂伤,压缩,或挫伤。这些损伤模型当中,最好挫伤和压缩损伤的病理生理过程OB送达人的脊髓损伤。1,2,3据SCI研究界的一个最近的一项调查,72%的324受访者同意,挫伤脊髓损伤模型最临床相关1。

雷金纳德·艾伦的描述的第一实验重量的下降产生的实验室设置4脊柱脊髓损伤的设备以来,挫伤设备已在以优化的重复性和到一般模拟人体损伤的病理3中的新纽约大学撞击使用机电元件,测量损伤体重下降的位移和速度在5,6这里,损伤程度取决于从体重下降高度。相比之下,在美国俄亥俄州立大学(OSU)的冲击和multimechanism损伤系统 Choo的设计。 (2009年),确定脊髓的最大位移,力impar泰德电源线,然后测量。 IH的冲击是明显,在用户决定施加的力和位移测量。虽然这些系统(体重下降与位移控制与力控制)每个人都有其理论优势,​​相对容易使用,商业可用性和可用性中转冲击制造商的技术支持已经越来越受欢迎近年来。

从技术角度来说,我们应该注意,在夹紧的动物和保护他们的影响( 图1)之前的方法取得了显着的修改。来改善我们受伤的一致性,以适应独特的颈椎解剖,我们定制的夹紧系统,牢牢把握颈椎横突与稳定的动物,由于提供的夹子希冲击打算举行的SPI在胸椎常识的过程,我们认为,他们没有得到很好的适合颈椎的棘突小得多。框架和夹紧系统拥有非常严格的动物中的影响,几乎没有钳和脊椎之间的“打滑”。7夹紧装置是比较容易使用,并适用于脊柱。一些学员和技术人员在实验室中利用它一贯成功。为了掌握横突但是需要额外的横向关闭颈椎背侧软组织剥离,并可以遇到这样的出血。止血通常是通过简单的手术海绵小块申请温和的压力。此外,钳是专门为动物在300-350克重范围,需要修改,​​以适应小动物(虽然这也很可能提出betwee垫片列印钳的两条胳膊)。

与预定目标的伤害,我们的目的是伤害皮质(CST)和红核脊髓(RST),仅在同侧大片,因为这些都发挥着作用,在啮齿类动物前肢功能。在我们的研究,功能赤字水平梯试验,饲养试验缸进行了评估,仪容测试和蒙托亚楼梯测试。水平梯试验和缸饲养是有价值的评估后,颈椎损伤模型。8,9,10,11迫使动物使用他们的受伤和健侧前肢整个阶梯水平梯测试,因此,试验措施前肢的补偿和自适应功能。在受伤前的培训,动物通常会“抢”或置于他们的数字与他们的前爪上的酒吧,而过路的阶梯。严重或中度的宫颈单方面挫伤后,这个运动功能大部分是ABolished,动物不再能够始终如一地放置或掌握的梯级。2,12缸饲养试验研究,分析自愿前肢使用自然恢复。通常情况下,大大减少损伤后受伤的前肢,同时探索使用。这些功能的丧失可能与轴索中断双方的组合,以消除运动神经元病变的震中,支配三角肌,二头肌,伸腕桡侧长肌和伸肌桡侧腕短肌等肌肉13。美容测试,如缸饲养试验,检查动物的自然行为总值。修改后的蒙托亚楼梯评估的数字功能,或前肢精细控制。至今令人惊讶的是,那里只有一个研究,利用改良蒙托亚的颈椎脊髓损伤的楼梯测试14。总之,这些测试评估整体及罚款总额的组成部分前肢功能。

其他研究也描述颈椎挫伤模型,通常都被预先存在的胸部挫伤设备的一些修改制定的。2,12,15,16,17邓纳姆 。 (2011年),波波维奇 。 (2010年)和Sandrow 。 (2008)利用中转的冲击。邓纳姆等人 。 (2011年)的特点损伤模型,通过评估缸饲养试验,时装表演步态分析,粉条处理测试和水平梯形测试使用100,200,和300 kdyn的。波波维奇等人 。 (2010年)在了175 kdyn力量颈髓受伤,观察斜面测试,缸饲养试验和BBB级测试使用的功能性结果。 sandrow 等人 。 (2008年)的200 kdyn和由此产生的位移1.6至1.8毫米的力量,然后强迫运动测试,前肢开放领域的运动,握力测试和电网沃尔玛评估行为结果ķ测试。从我们实验室以前的工作中使用了1.5毫米的位移,俄亥俄州立大学的撞击测试单方面的颈椎挫伤(与了200 kdyn的最大峰值力)18 Gensel 等。(2006)使用MASCIS /纽约大学的冲击,用10g在6.5毫米和12.5毫米的高度和整理试验,水平阶梯测试,缸饲养试验和半自动化的的行人道测试(时装表演步态分析)评估行为的结果。 soblosky 等人 。 (2001)伤害动物使用一个改良Allen的体重下降装置(10.5克),5.00,2.50或1.25毫米高度25.0°角,并评估水平梯试验和缸饲养试验,以评估行为恢复。这是很难比较我们的损伤模型研究由Sandrow 。 (2008年),重叠与我们目前的研究,因为没有任何功能测试。当我们比较功能的其他研究成果,我们的电流IH损伤模型一般不太严重的300邓纳姆 kdyn组。 (2011年),但相比更为严重其他颈椎单方面挫伤报告。在我们的损伤模型动物伤后两周才能够执行的功能测试,而其他损伤模型展开伤后1周开始的功能测试。为水平梯试验,Soblosky 。 (2001)报道没有步骤的总数的卡瓦总数。在6周后,损伤同侧%的错误,对我们当前的模型是25%左右,相比Lee 等人研究。 (2010年)和Gensel 。 (2006年),报告误差范围在10 - 15%,与邓纳姆 。 (2011)报道40%的的300 kdyn组和20%,为100和200 kdyn组的错误。为气缸饲养试验,波波维奇 。 (2010)报道的饲养时间。我们同侧前肢用法为22.5°角的15-20%,相当于5。0毫米体重下降12。比较,从纽约大学的冲击中,Gensel 行为导致赤字。 (2006年)报告为12.5毫米的高度同侧前爪使用的完整废止。邓纳姆等人 。 (2011)报道约5年,10和20%,为100,200和300 kdyn动物同侧前肢使用。为疏导的测试,我们的动物得分少于由Gensel 报道的损伤组。 (2006年)。

病理损伤模型一般引起更大的作为相比,其他颈椎hemicontusion损伤模型的实质损害,但小于波波维奇等人 (2010)报道,损害。我们受伤的喙和尾椎延伸为4.8毫米,8.0毫米波波维奇相比,Lee 等人在4.0毫米。和3.6毫米在Gensel 。使用IH的冲击,俄勒冈州立大学的冲击和纽约大学的冲击,分别2,18病变震中的研究,我们发现约20%灰质损伤模型,Lee 等人相比,不遗余力。 (2010)在10%中,Gensel 。 (2006年),在20-50%,并Soblosky 。 (2001年),在31-99%。脑白质备用,损伤模型,在这里留下了余下的约20%的组织在震中相比,Lee 等人 ,30%(2010年),5 - 10%,在Gensel (2006)18 - 62 %在Soblosky 。(2001年)在病变震中。在这项研究中,Lee 等人 ,(2010)红核脊髓束遭受重大损伤,但皮质脊髓束经常出现完整。波波维奇等人 。 (2010)报道的两个大片的彻底废除。 gensel 等人 。 (2006)报道局部损坏的皮质脊髓束和红核脊髓束的高度设置为彻底销毁。 soblosky 等人 。 (2001)报告的红核脊髓束的局部损坏,但没有伤到皮质脊髓束。这些报告进一步执行 19受伤都降大片,以产生足够的功能障碍的重要性。这也是值得大家注意,在波波维奇 。 (2010年),Gensel 。 (2006年)和Soblosky 。 (2001年),受伤也扩展到对侧。这个扩展问题的重要性在我们的模型对面是有争议的,因为有受伤之间没有行为上的差异,目的是1.0,1.2,和1.4毫米的中线(未发表资料),但它会是可取的包含同侧的伤害,因为我们作为“无恙”控制对侧。虽然有一些动物,有的对侧parenchmyal损害的交叉,这是微不足道的。比较时,无论是作为同侧和对侧双方之间的比率白色和灰质损伤的代表性,或作为绝对的损害程度,几乎没有任何区别(未发表资料)。

e_content“>总之,我们的报告的单方面挫伤发展,并希望能提供足够的细节,它的发展和技术。其他希望学习临床脊髓损伤的治疗,可能采用这种模式,使用冲击是广泛使用的设备(无限的地平线冲击)。我们目前正在利用模型来评估神经保护干预,希望人力翻译之前具体的治疗提供了重要的临床证据支持。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Infinite Horizon Impactor Precision Systems and Instrumentation IH-0400
Aluminum metal sheet Metalsupermarlets.com APT6061/500
Flexaframe support foot plates Fishers Scientific 1466625Q
Flexaframe support rods Fishers Scientific 1466610GQ
Flexaframe Support Connectors Fishers Scientific 1466620Q
Clamp1 Custom made Choo et al., 2009
Metal holders Custom made See above
Impactor tip Custom made Diameter: 1.15 mm
Stereotaxic frame David Kopf Instruments Model 900
Cylinder Level YIJIA TOOLS YJ-SL0620
Microscope Leica Model #: MZ8
Laboratory scissor jack VWR 12620-902

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References

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