Хронический Сужение седалищного нерва и боль Гиперчувствительность тестирования у крыс

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Благодаря простоте операции и надежный поведенческий результат, хроническая сжатия седалищного нерва является одним из самых выдающихся животных моделях нейропатической боли. В течение 24 часов после операции, боль гиперчувствительности установлена ​​и может быть количественно измерена с помощью фон Фрей aesthesiometer (механических испытаний) и подошвенные метр обезболивания (тепловых испытаний).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Austin, P. J., Wu, A., Moalem-Taylor, G. Chronic Constriction of the Sciatic Nerve and Pain Hypersensitivity Testing in Rats. J. Vis. Exp. (61), e3393, doi:10.3791/3393 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Седалищного нерва Хронический Сужение

Асептические методы должны быть использованы для хирургического вмешательства. Лечить хирургического рабочую поверхность на 70% этанола и заранее подготовить стерильные инструменты (например, штраф ножницы, щипцы, и втягивающим), сетки, скобы и тампоны в автоклаве. Для нескольких операций, очистки и resterilise инструментов с 70% этанола или сухой шарик стерилизатор между крысами. Хирургические маски, волосы капот и стерильные перчатки.

Для сжатия нерва, подготовка шва хромовой кишечника, сокращая его на мелкие кусочки около 3 см в длину погружения в стерильный физиологический раствор, чтобы предотвратить высыхание. Для закрытия раны, использовать имеющиеся в стерильных нитей шелка.

  1. Обезболить крысы в индукционной камере с использованием 5% изофлуран в O 2, затем доставить на 2% в ИФ O 2 по заказу маску, и следить за anesthetised животных во время процедуры. Общие анестетики альтернатива в виде ингаляций галотан или внутрибрюшинного пентобарбитала натрия. Кетамин, как N-метил-D-аспартата (NMDA) рецепторов, следует избегать, так как эти рецепторы играют важную роль в развитии нейропатической боли.
  2. Бритье левую заднюю ногу крысы. Затем поместите животное на термо-регулируемым нагревательного мата при 37 ° С и применяют мазь смазочных офтальмологических для глаз.
  3. Стерилизовать побрился области три альтернативных приложений на 70% изопропиловый спирт и раствор йода.
  4. С крыса лежала на его груди / грудной клетки, поднять левую заднюю ногу и удерживайте позицию femor под углом 90 ° к позвоночнику использованием клейкой ленты на ноги.
  5. Сделайте надрез в коже параллельно, но 3-4 мм ниже femor и свободной кожи с мышцами вокруг разреза на проходящем через соединительную ткань.
  6. Использование тупые ножницы, разрезать соединительной ткани между ягодичной superficialis и бицепсыбедра мышцы.
  7. Используйте втягивающего к увеличению разрыва между двумя мышцами, что позволяет четкой визуализации седалищного нерва.
  8. Использование изогнутых тупым наконечником щипцы и микро-ножницы, аккуратно бесплатно около 10 мм седалищного нерва (проксимальнее седалищного трифуркации) из окружающей соединительной ткани.
  9. Под микроскопом и хороший источник света, связать четыре лигатуры (хромовой кишки 4.0, Ethicon, США) с двойным узлом, 1 мм друг от друга, проксимальнее трифуркации седалищного нерва. Для каждого лигатуры, начните с одного свободную петлю, затем схватить двух концах близко к петле и затяните до петли едва уютно и лигатуры не скользит вдоль нерва. Для проведения цикла в правильном положении, поместите вторую петлю на верхней части первой завершить узел. Наконец, обрежьте свободные концы лигатуры около 1 мм. Сжатие нерва должно быть минимальным, и немедленно остановлена, если кратко наблюдается подергивание, чтобы избежать ареста в гоэлектронной эпиневральный кровотока. При перетяжке лигатуры приводит к axotomy и деление (членовредительство), как нежелательные побочные эффекты, которые исключают успешного тестирования чувствительности боли.
  10. Используйте швов (Mersilk 5.0, Ethicon), чтобы закрыть слоем мышц и скобы (Autoclip, 9 мм) для крепления кожи. Затем, используя раствор йода (Riodine) для стерилизации ран.
  11. Обратите внимание на крыс тесно в период восстановления анестезии, и позволить ему восстановить в отдельную клетку с плоским постельные принадлежности бумаги (не стандартные кровати животноводство), для того, чтобы предотвратить бессознательное животное задыхается.
    Прежде чем дать любую послеоперационного обезболивания следователи должны учитывать тот факт, что может мешать боль тестирования чувствительности. В самом деле, есть доказательства того, что местное применение анестетиков, лидокаин, во время травмы могут изменить развитие нейропатической боли и уменьшает степень гипералгезии в предыдущей недели 7. Для дальнейшего обсуждения этого мatter см. обзор Беннет и др. 8.

2. Измерения боль Поведение

  1. Ежедневное обращение с крысами в течение нескольких дней перед началом эксперимента рекомендуется для того, чтобы приучить их к крысам обработчик, уменьшить стресс и риск укусов.
  2. До поведенческого тестирования, крысы должны быть приучены к процедуре тестирования и животных корпуса. Среда тестирования должна быть спокойной и хорошо контролируется, с постоянной температурой и уровнем влажности, а также осуществляется на том же время каждый день тестирования сессии.
  3. Боль тестирования чувствительности должна быть выполнена несколько раз, прежде ТПП (базовый уровень) и в различные моменты времени после того, как ТПП, как хотелось бы.

3. Механическое снятие порога

  1. В день тестирования, место крыс в повышенных сетки этажном клетке тестирования за 15-30 минут до измерения снятие порогов, что позволяет клетке разведки и ГруМин прекратить деятельность и крыс, чтобы стать расслабленным и неподвижным.
  2. Использование динамического подошвенной фон Фрей aesthesiometer (Ugo Basile, Италия), положение сенсорного стимулятора блок с нитью непосредственно под срединно-подошвенной поверхности hindpaw, избегая металлической сеткой, а затем нажмите клавишу пуска. Это поднимает нити механически стимулировать подошвенной поверхности hindpaw с нарастающей силой.

Руководство фон Фрей волосы серии увеличением диаметра нити, калиброванный, чтобы вызвать определенный силы при нанесении на кожу. Они могут использоваться как альтернатива электронным динамический подошвенной фон Фрей aesthesiometer для измерения лапу снятие порога, как описано выше 4. Есть также несколько альтернативных производителей электронных фон Фрей aesthesiometers (например, СИТИ, США и Somedic, Швеция).

  1. Запись механического порога выхода из обоих раненых и неповрежденной hindpaWS, в уравновешенной порядке. Это устройство оказывает давление на лапу и на выход реакции системы автоматически записывает и отображает максимальное усилие, приложенное (в граммах). Если неоднозначный отклик происходит (например, в случае ходьбе или уход), повторять стимул и записывать порог снова. Лизание или сотрясение стимуляции следующий hindpaw является признаком поведения, связанного с болью.
  2. Повторите механической стимуляции в 3 раза с интервалом около 5 минут между стимулами, запись порогов, а затем вычислить среднее порогов лапу вывод.

4. Тепловая задержка вывода

Инфракрасный (ИК) тепла интенсивность подошвенной инструмент тест должны быть скорректированы до начала эксперимента. В нашей лаборатории мы регулируем ИК интенсивности, чтобы дать среднее время ожидания вывода лапы около 10 секунд в наивной крысы, и мы отсечения задержкой в ​​20 секунд, чтобы избежать ткани плотинывозраста в случае неудачи удалить лапу.

  1. В день тестирования, место крыс в стеклянную клетку этажном тестирования за 15-30 минут до измерения латентности, что позволяет клетке разведки и уход прекратить деятельность и крыс, чтобы стать расслабленным и неподвижным.
  2. Использование тепловой подошвенной инструмент обезболивания (Ugo Basile, Италия), положение инфракрасный источник непосредственно под срединно-подошвенной поверхности hindpaw и нажмите клавишу пуска. Это подвергает подошвенной поверхности hindpaw к балке лучистого тепла через прозрачную поверхность стекла. Существуют также альтернативные производители тепловой подошвенной инструментов обезболивания (например СИТИ, США и Stoelting, США).
  3. Запишите вывод задержка с обоих раненых и неповрежденной hindpaws, в уравновешенной порядке. Это устройство автоматически фиксирует время (в секундах) от начала тепловой стимул для вывода лапы от источника тепла. Если неоднозначный отклик происходит (например, в случае ambulaТион или уход), повторять стимул и записать задержки снова. Лизание или сотрясение стимуляции следующий hindpaw является признаком поведения, связанного с болью.
  4. Повторите тепло стимуляции по крайней мере 3 раза с интервалом в 5 минут между стимулами, записать задержки, а затем вычислить среднее задержки вывода лапу.

4. Представитель Результаты

Примером механической порог вывода и тепловой задержки вывода в ипсилатеральной (раненых) и контралатеральной (неповрежденную) лапы крыс Вистар показано ранее (базовый) и 2-12 дней после ТПП в 3А, 3Б и рис. Из этих цифр видно, что Торгово-промышленная палата приводит к значительному сокращению как механические пороги вывода и тепловой задержки вывода ипсилатерального hindpaw, указывающие на наличие механической и термической чувствительности боли, как признаки хронической нейропатической боли .

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема иллюстрирующая расположение лигатуры в модели ТПП. Это животное модель нейропатической боли включает в себя размещение четырех свободных хромовой кишки лигатуры на седалищный нерв, в середине бедра уровне. Это приводит к ранены только часть афферентов собирается стопы и последующей боли гиперчувствительности hindpaw.

Рисунок 2
Рисунок 2. Схема hindpaw площадь, используемая для болью тестирования. В середине подошвенной поверхности только на задние сапоги, о чем свидетельствует красная пунктирная окружность, используется для тестирования боль. Эта область иннервируется основном конечные ветви седалищного нерва. Пятки и подушечек лап следует избегать из-за дифференциальной чувствительности кожи.

3.jpg "/>
Рисунок 3. Боль гиперчувствительности после хронического сжатия седалищного нерва у крыс. После того, как Торгово-промышленная палата, есть значительное снижение лапу порог вывода на механические раздражители (A) и подушечки вывод задержки тепловых раздражителей (B) в поврежденном (ипсилатерального) hindpaw по сравнению с неповрежденной (контралатеральной) hindpaw (P <0,01 повторных измерений 2 -дисперсионного анализа). Данные показывают среднее ± SEM, п = 7 крыс Вистар.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Торгово-промышленная палата является широко используемой модели периферического нерва хронической нейропатической боли. Это относительно простая для выполнения, а также производит надежные и стабильные боль гиперчувствительности, по крайней мере одного месяца после травмы. После ТПП, крысы обладают ненормальное положение потерпевшего hindpaw (пальцы удерживаются вместе и согнуты подошвенные, и лапа выворачивается), а также повторные встряхивания, охраны и лизать потерпевшего hindpaw предположить наличие спонтанной боли 9. В дополнение к сенсорной дисфункции, некоторые исследователи показали, что ТПП вызывает поведенческие ограниченными возможностями, такими как нарушается социальное взаимодействие, нарушение сна, депрессивные, как и тревога, как поведение, 10-13, однако это, в отличие от неспособности найти такие поведенческие инвалидов другими 14,15. Торгово-промышленная палата поэтому обычно используется для исследования и патофизиологии и потенциальных терапевтических агентов для лечения нейропатической боли.

Мы описание экспозицийМБП одностороннее сужение левого седалищного нерва, однако следует отметить, что многие экспериментаторы провели ТПП справа седалищного нерва, с аналогичными боли и поведения. Некоторые исследователи, возможно, будет легче выполнять операции на конкретную сторону из-за беспристрастности, в то время как другие перешли на другую сторону в течение эксперимента, чтобы исключить любые ошибки. Стоит отметить, что несколько вариаций на оригинальной методике были зарегистрированы в том числе используя только 2 лигатуры вокруг нервных 16,17 и использования шовного материала, кроме хромовой кишечника, такие как простой кишечника и полиглактин (Викрил) 18,19 крыс. Кроме того, модель ТПП также был изменен для использования на мышах, в котором процедура идентична, за исключением использования 2-3 лигатуры с различными материалами, в том числе шовного хромовой кишки, нейлон, и проленовой 15,20,21.

Один из недостатков этой модели является степень изменчивости среди крыс, подвергнутых ТПП, в связи с variabiliти в герметичности перетяжек производится путем привязки узлов с швам. Это можно частично преодолеть с помощью опытного исследователя выполнения операции на постоянной основе. Кроме того, тип шовного материала, используемого для лигирования нерва может также внести вклад в изменчивость, и считается, что химические вещества из кишечника хромовой посредником некоторые поведенческие и нейрохимические эффекты, наблюдаемые в этой модели 19,22. Особое внимание следует уделить выбору крысы пол (мужчины против женщин) 23 лет (молодежь против старых) 24,25, 26 и диеты штамм 27, которые могут существенно повлиять на развитие боли гиперчувствительности после ТПП.

Боль чувствительности испытаний, с использованием электронных фон Фрей aesthesiometer или ручной фон Фрей волос для механического порога вывода и подошвенной обезболивания (Hargreaves) метр тепловой задержки вывода, хорошо известны и повторноответственность количественные показатели чувствительности боли в мелких животных. Их использование в сочетании с моделями невропатической боли, широко распространены и позволяют прямое сравнение лапы чувствительность к механическим и термическим стимулам различных вариантов лечения, а также между различными штаммами крыс. Следует отметить, что другие поведенческие тесты, такие как тест контактный укол и холодной аллодиния, также используется для тестирования ТПП вызванные болью гиперчувствительности 8.

Хотя использование рефлексивного выхода из механических или тепловых раздражителей является основной мерой нейропатической боли в этой модели и другие, в последнее время подвергался критике за низкую корреляцию с человека симптомы и участия значительного смещения экспериментатор 28. Таким образом, использование дополнительных парадигмы, такие как оперантное меры боли 29 и спонтанно испущенных поведения 30 было бы полезно.

Тем не менее, де-Пите эти ограничения, модель ТПП и лапы вывод тестов для измерения чувствительности боли являются ключевыми для понимания механизмов невропатической боли и определение новых целей анальгетик. В нашей лаборатории мы обычно выполняет Торгово-промышленная палата и измерения механических лап снятие порогов и тепловой задержки вывода лапу, чтобы понять, как нейро-иммунных взаимодействий способствовать нейропатической боли 31 и оценить потенциальные модуляции иммунной системы, чтобы уменьшить боль гиперчувствительности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Эксперименты на животных были утверждены уход животных и Комитет по этике из Университета Нового Южного Уэльса, Австралия, и в соответствии с руководящими выданный Международной ассоциации по изучению боли.

Acknowledgements

Авторы хотели бы отметить оригинальное описание модели ТПП Беннетта и Се (1988).

Эта работа была частично поддержана грантами от национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (ID # 568637) и Управлением по науке Нового Южного Уэльса и медицинских исследований по Гринвичу.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chromic gut Ethicon Inc. G-211 4-0 thickness
Isoflurane Delvet Pty. Ltd., Seven Hills, NSW n/a
Mersilk Ethicon Inc. W-580 5-0 thickness
Autoclip BD Biosciences 427631 9 mm stainless steel
Riodine Orion R1000802F 1% w/v iodine
Thermal plantar analgesia instrument Ugo Basile 37370
Dynamic plantar aesthesiometer Ugo Basile 37400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bouhassira, D., Lanteri-Minet, M., Attal, N., Laurent, B., Touboul, C. Prevalence of chronic pain with neuropathic characteristics in the general population. Pain. 136, 380-387 (2008).
  2. Toth, C., Lander, J., Wiebe, S. The prevalence and impact of chronic pain with neuropathic pain symptoms in the general population. Pain Med. 10, 918-929 (2009).
  3. Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33, 87-107 (1988).
  4. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J. Neurosci. Methods. 53, 55-63 (1994).
  5. Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32, 77-88 (1988).
  6. Yeomans, D. C., Proudfit, H. K. Characterization of the foot withdrawal response to noxious radiant heat in the rat. Pain. 59, 85-94 (1994).
  7. Dougherty, P. M., Garrison, C. J., Carlton, S. M. Differential influence of local anesthetic upon two models of experimentally induced peripheral mononeuropathy in the rat. Brain Research. 570, 109-115 (1992).
  8. Bennett, G. J., Chung, J. M., Honore, M., Seltzer, Z. Models of neuropathic pain in the rat. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9, (2003).
  9. Attal, N., Jazat, F., Kayser, V., Guilbaud, G. Further evidence for 'pain-related' behaviours in a model of unilateral peripheral mononeuropathy. Pain. 41, 235-251 (1990).
  10. Hu, B., Doods, H., Treede, R. -D., Ceci, A. Depression-like behaviour in rats with mononeuropathy is reduced by the CB2-selective agonist GW405833. Pain. 143, 206-212 (2009).
  11. Jesse, C., Wilhelm, E., Nogueira, C. Depression-like behavior and mechanical allodynia are reduced by bis selenide treatment in mice with chronic constriction injury: a comparison with fluoxetine, amitriptyline, and bupropion. Psychopharmacology. 212, 513-522 (2010).
  12. Monassi, C. R., Bandler, R., Keay, K. A. A subpopulation of rats show social and sleep-waking changes typical of chronic neuropathic pain following peripheral nerve injury. Eur. J. Neurosci. 17, 1907-1920 (2003).
  13. Roeska, K., Doods, H., Arndt, K., Treede, R. D., Ceci, A. Anxiety-like behaviour in rats with mononeuropathy is reduced by the analgesic drugs morphine and gabapentin. Pain. 139, 349-357 (2008).
  14. Kontinen, V. K., Kauppila, T., Paananen, S., Pertovaara, A., Kalso, E. Behavioural measures of depression and anxiety in rats with spinal nerve ligation-induced neuropathy. Pain. 80, 341-346 (1999).
  15. Urban, R., Scherrer, G., Goulding, E. H., Tecott, L. H., Basbaum, A. I. Behavioral indices of ongoing pain are largely unchanged in male mice with tissue or nerve injury-induced mechanical hypersensitivity. Pain. 152, 990-1000 (2011).
  16. Myers, R. R., Yamamoto, T., Yaksh, T. L., Powell, H. C. The role of focal nerve ischemia and Wallerian degeneration in peripheral nerve injury producing hyperesthesia. Anesthesiology. 78, 308-316 (1993).
  17. Grace, P. M., Hutchinson, M. R., Manavis, J., Somogyi, A. A., Rolan, P. E. A novel animal model of graded neuropathic pain: utility to investigate mechanisms of population heterogeneity. J. Neurosci. Methods. 193, 47-53 (2010).
  18. Kajander, K. C., Pollock, C. H., Berg, H. Evaluation of hindpaw position in rats during chronic constriction injury (CCI) produced with different suture materials. Somatosens Mot. Res. 13, 95-101 (1996).
  19. Xu, J., Pollock, C. H., Kajander, K. C. Chromic gut suture reduces calcitonin-gene-related peptide and substance P levels in the spinal cord following chronic constriction injury in the rat. Pain. 64, 503-509 (1996).
  20. Sommer, C., Schafers, M. Painful mononeuropathy in C57BL/Wld mice with delayed wallerian degeneration: differential effects of cytokine production and nerve regeneration on thermal and mechanical hypersensitivity. Brain. Res. 784, 154-162 (1998).
  21. Walczak, J. S., Beaulieu, P. Comparison of three models of neuropathic pain in mice using a new method to assess cold allodynia: the double plate technique. Neurosci. Lett. 399, 240-244 (2006).
  22. Maves, T. J., Pechman, P. S., Gebhart, G. F., Meller, S. T. Possible chemical contribution from chromic gut sutures produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 54, 57-69 (1993).
  23. Tall, J. M., Stuesse, S. L., Cruce, W. L., Crisp, T. Gender and the behavioral manifestations of neuropathic pain. Pharmacol Biochem. Behav. 68, 99-104 (2001).
  24. Chung, J. M., Choi, Y., Yoon, Y. W., Na, H. S. Effects of age on behavioral signs of neuropathic pain in an experimental rat model. Neurosci. Lett. 183, 54-57 (1995).
  25. Tanck, E. N., Kroin, J. S., McCarthy, R. J., Penn, R. D., Ivankovich, A. D. Effects of age and size on development of allodynia in a chronic pain model produced by sciatic nerve ligation in rats. Pain. 51, 313-316 (1992).
  26. Shir, Y., Sheth, R., Campbell, J. N., Raja, S. N., Seltzer, Z. Soy-containing diet suppresses chronic neuropathic sensory disorders in rats. Anesth. Analg. 92, 1029-1034 (2001).
  27. Yoon, Y. W., Lee, D. H., Lee, B. H., Chung, K., Chung, J. M. Different strains and substrains of rats show different levels of neuropathic pain behaviors. Experimental Brain Research. 129, 167-171 (1999).
  28. Mogil, J. S., Davis, K. D., Derbyshire, S. W. The necessity of animal models in pain research. Pain. 151, 12-17 (2010).
  29. Mogil, J. S. Animal models of pain: progress and challenges. Nat. Rev. Neurosci. 10, 283-294 (2009).
  30. Langford, D. J. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat. Methods. 7, 447-449 (2010).
  31. Austin, P. J., Moalem-Taylor, G. The neuro-immune balance in neuropathic pain: involvement of inflammatory immune cells, immune-like glial cells and cytokines. J. Neuroimmunol. 229, 26-50 (2010).

Comments

7 Comments

  1. hello sir.

    Sir/Madam,

    I am Deepika Saini from chandigarh, and i m pursuing my Masters in Pharmacy (Pharmacology) from chandigarh college of pharmacy,landran,mohali,punjab (India). As my ²nd year research project i got a topic COMBINED EFFECTS OF NSAIDs AND PKC INHIBITORS IN TREATMENT OF SCIATIC NERVE LIGATION INDUCED NEUROPATHIC PAIN , so i need the procedure for sciatic nerve ligation. Please help me regarding this , i will be really very thankful to you.

    Yours Sincerely,
    Deepika Saini

    Reply
    Posted by: Deepika S.
    June 22, 2012 - 5:34 AM
  2. Dear Deepika,
    The detailed procedure is described in the PDF of the article.
    Gila

    Reply
    Posted by: Gila M.
    June 22, 2012 - 5:28 PM
  3. Hello Gila,

    Can you please email me the full text of the article by Bennett and Xie, 1988, i.e. "A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man." I need it for my thesis work. My email id is deepi.8dec@gmail.com. I shall be highly obliged.

    Deepika Saini.

    Reply
    Posted by: Deepika S.
    January 22, 2013 - 10:55 AM
  4. Hello Paul, Ann and Gila,
    I am writing to you from the University of Sydney Library, I am hoping you might be able to supply me a copy of your article? Many thanks,
    Michele

    Reply
    Posted by: Michele P.
    February 25, 2013 - 4:39 PM
  5. Dear Deepika,

    The detailed procedure is described in the video

    Reply
    Posted by: kang hoon k.
    March 27, 2013 - 2:21 AM
  6. respected sir,
    pls provide me the link for observing Chronic Constriction of the Sciatic Nerve and Pain Hypersensitivity Testing in Rats to my email prashanthkomirishetti@gmail.com

    Reply
    Posted by: prashanth k.
    April 8, 2013 - 6:43 AM
  7. Dear sir,
    I want to research the neuropathic pain in CCI model about MWT and PWL,so I want you can provide me the video to study the details of the research process.my email 244823865@qq.com. Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Gao j.
    December 31, 2013 - 12:48 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics