Un Based Chitosan, Laser adhésif activé Thin Film chirurgicaux, «SurgiLux ': Préparation et démonstration

Bioengineering

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Summary

La fabrication d'un roman, adhésif flexible à couche mince chirurgicale à partir d'ingrédients approuvés par la FDA, le chitosane et le vert d'indocyanine est décrite. Collage de cette colle à tissu collagène à travers un processus d'activation simple avec une faible puissance laser infrarouge est démontrée.

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Foster, L. J., Karsten, E. A Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Surgical Adhesive, 'SurgiLux': Preparation and Demonstration. J. Vis. Exp. (68), e3527, doi:10.3791/3527 (2012).

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Abstract

Les sutures sont une technologie vieille 4.000 années qui restent le «gold standard» pour la fermeture des plaies, en vertu de leur force réparation (~ 100 kPa). Cependant, les sutures peuvent agir comme un foyer d'infection et dans de nombreuses procédures sont pas en mesure d'effectuer la réparation des blessures ou interférer avec la régénération des tissus fonctionnels. 1 colles et adhésifs chirurgicaux, tels que ceux à base de fibrine et de cyanoacrylates, ont été développées comme alternatives aux sutures pour la réparation de telles plaies. Cependant, le courant adhésifs commerciaux ont aussi des inconvénients importants, allant de transfert viral et de prion et un manque de force réparation comme avec les colles de fibrine, à la toxicité tissulaire et un manque de biocompatibilité pour les adhésifs à base de cyanoacrylate. De plus, actuellement disponibles adhésifs chirurgicaux ont tendance à être à base de gel et peuvent avoir des temps de durcissement prolongé qui limitent leur application. 2 De même, l'utilisation de lasers UV pour faciliter réticulation mécanismes à base de protéines ou d'albumine «solDER »peut conduire à endommager l'ADN pendant le soudage des tissus laser (LTW) prédispose dommages thermiques aux tissus. 3 Malgré leurs inconvénients, les adhésifs et les LTW ont capturé environ 30% du marché fermeture de la plaie rapporté à plus de 5 milliards de dollars par an, un témoignage significatif de la nécessité de la technologie sans suture 4.

Dans la poursuite de la technologie sans suture, nous avons utilisé le chitosane comme biomatériau pour le développement d'un film souple et mince, laser activé adhésif chirurgical appelé «SurgiLux». Ce roman bioadhésif utilise une combinaison unique de biomatériaux et de la photonique qui sont approuvés par la FDA et utilisé avec succès dans une variété d'applications biomédicales et des produits. SurgiLux surmonte tous les inconvénients associés aux sutures et adhésifs chirurgicaux actuels (voir le tableau 1).

Dans cette présentation, nous présentons le protocole relativement simple pour la fabrication de SurgiLux et de démontrerson activation laser et de la force de soudure de tissu. SurgiLux films adhérer au tissu collagénique sans modification chimique tel que la réticulation par irradiation et à l'aide d'une relativement faible puissance (120 mW) laser infrarouge au lieu d'une lumière UV. Films de chitosane ont une attirance naturelle mais faible adhésif au collagène (~ 3 kPa), l'activation du laser à base de chitosan films SurgiLux souligne la force de cette adhésion par des interactions de la chaîne polymère comme une conséquence de la dilatation thermique transitoire. 5 Sans cette "activation" processus de , les films SurgiLux sont facilement éliminés. 6-9 SurgiLux a été testé à la fois in vitro et in vivo sur une variété de tissus y compris le nerf, l'intestin, la dure-mère et de la cornée. Dans tous les cas, il a démontré une bonne biocompatibilité et négligeable des dommages thermiques à la suite de l'irradiation. 6-10

Protocol

1. Préparation de la solution SurgiLux

  1. Préparer un 2% (v / v) d'acide acétique avec de l'eau désionisée dans un récipient en verre propre, utiliser une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination.
  2. Peser 0,02% (p / v) du chromophore, le vert d'indocyanine, ICG, dans un tube Eppendorf stérile, en sorte que le tube est enroulé dans une feuille d'argent à empêcher toute pénétration de la lumière.
  3. Avec un chiffon propre, pipette jetable, transférer environ 1 ml de la solution d'acide acétique dilué dans le tube pour dissoudre le colorant, agiter doucement et garder enveloppé dans du papier.
  4. Transférer le GIC solubilisés dans le bol et ajouter 2% (p / v) de poudre de chitosane avant l'ajout d'un agitateur magnétique stérile.
  5. Couvrir le bécher avec du Parafilm, puis les envelopper dans du papier d'argent, avant de mélanger le contenu à environ 125 tours par minute pendant 72 heures à température ambiante dans une hotte à flux laminaire.
  6. Transférer le contenu dans des tubes à centrifuger et centrifuger propres à 15.000 xg pendant 15 min à 4 ° C pour éliminer toute particulate question.
  7. Transférer délicatement la solution SurgiLux verte dans un récipient en verre propre, couvrir avec du Parafilm, puis les envelopper dans du papier d'argent, avant de les ranger au réfrigérateur pendant 12 heures pour augmenter la viscosité de la solution.

2. Fonderie de SurgiLux Films

  1. Utiliser une seringue stérile, passer 8 ml de la solution SurgiLux froid dans un endroit propre, boîte de Pétri de 95 mm de diamètre, et inclinez légèrement la plaque pour assurer une couverture complète de la solution. Faire varier le rapport du volume de solution de zone de coulée permet un contrôle de l'épaisseur du film, voir figure 1.
  2. Retirer les bulles visibles dans la solution à l'aide de la pointe d'une aiguille stérile. Couvrir le plat de papier d'aluminium et placer au réfrigérateur pour enlever les résidus de taille micronique bulles.
  3. Après 20 minutes, retirer délicatement la boîte de Pétri du réfrigérateur, placer dans une hotte à flux laminaire, couvrir de papier d'argent et de laisser la solution s'évaporer pendant 3 semaines.
  4. Après avoir complete évaporation, le score des bords extérieurs du film SurgiLux vert clair dans la boîte de Pétri et doucement «peaux» le film de la surface de plat.
  5. Le film SurgiLux doit être souple et facile à manipuler sans se déchirer ou se rompre.
  6. Stocker les films SurgiLux circulaires dans la boîte de Pétri enveloppées dans du papier d'argent dans des conditions sèches avant d'être prêt à l'emploi.

3. L'activation laser de films adhésifs SurgiLux

  1. Pour démontrer le processus d'activation au laser, nous allons utiliser un morceau de tissu bovin comme le steak coupé à une taille de 15 mm de large et 20 mm de longueur. Disséquer le tissu, en ligne droite à l'aide d'une lame chirurgicale Numéro 10, pour produire des morceaux de 2 15 par 10 mm.
  2. Rapprochant les deux pièces de tissu de telle sorte que leurs bords se touchent mais ne se chevauchent pas, et en utilisant un tampon de coton ou de gaze, doucement absorber tout liquide en excès.
  3. Ensuite, découpez un morceau de film SurgiLux 7 x 9 mm et placer soigneusement les sens de la longueur du film à travers le coupé en deux pIECE de tissu, puis appuyez doucement avec un coton-tige sec.
  4. Films SurgiLux sont activés à l'aide d'une diode laser infrarouge à un réglage de 120 mW. Comme il s'agit d'un laser de classe IIIB, les mesures de sécurité appropriées doivent être prises, y compris l'utilisation de lunettes de sécurité appropriées pour l'ensemble du personnel.
  5. Commençant dans le coin, irradier la SurgiLux avec un laser infra-rouge fixé à 120 mW et une taille de spot de faisceau de 1 mm de diamètre. Passez le spot du faisceau sur le film vert à un taux d'environ 1 mm par seconde. Répétez le processus d'irradiation deux fois plus.

4. Force de la réparation

  1. Soigneusement fixer les extrémités du tissu dans les mâchoires d'un appareil d'essai de traction. Nous utilisons un système Instron Mini55 avec une cellule de charge de 50 Newton. La charge maximale, résistance à la traction et allongement à la rupture ont été calculées à l'aide du logiciel Bluehill ordinateur (États-Unis). Moyen d'au moins 10 échantillons ont été déterminés (n = 10).
  2. Relevez le «flottement»et ensuite séparer les morceaux de tissu à une vitesse de 1 mm par seconde, jusqu'à ce que les deux morceaux de tissu maintenus ensemble par la bande SurgiLux séparé complètement.

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Representative Results

Centrifugation conduit à une solution transparente verte, ce qui augmente la viscosité après stockage à 4-6 ° C. Après un repos de 3 semaines, la solution verte est transformée en un film SurgiLux vert transparent d'environ 20 microns d'épaisseur et, comme démontré dans la vidéo, est facilement flexible.

Lors de l'irradiation avec le laser, les liaisons de film SurgiLux au tissu. Cela peut être observé sur les bords du film, où le tissu semble se contracter que le faisceau laser passe au-dessus de la feuille (figure 2). Pas de carbonisation ou l'ablation du tissu et le film devrait être observé. La force de liaison de SurgiLux au tissu doit être suffisante pour soulever les morceaux de tissu bissectés, et lorsque la résistance à la traction est mesurée devrait être d'environ 15 kPa pour le test rapportés ici.

Tableau 1
Tableau 1. </ Strong> Comparaison des propriétés pour SurgiLux système proposé et de la fibrine disponible dans le commerce à base de cyanoacrylate et les adhésifs chirurgicaux.

Figure 1
La figure 1 illustre schématiquement la fabrication SurgiLux couche mince d'adhésif et d'activation;.. Correspondant au texte du protocole Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
La figure 2 de la photographie (x20) montre le film mince après son activation SurgiLux laser collée au tissu intestin bovin et «contractant» dans l'incision du tissu (T A, T B:. Pièces séparées otissus f, I: incision, S: SurgiLux film).

Figure 3
Figure 3 Graphique montrant les points d'adhérence de tissus pour divers adhésifs:. Chitosan et films SurgiLux appliqués sur les tissus, Tisseel (fibrine) et des gels Histoacryl (cyanoacrylate) appliqués sur le tissu.

Figure 4
Figure 4 microscope électronique à balayage (SEMS) illustrant cellules attachées à films; SurgiLux. Lignées cellulaires humaines (a) des cellules olfactives engainantes [x1.5k], (b) les fibroblastes du stroma [x500], et (c) des muscles squelettiques dérivées des cellules souches satellites [x1.7k]. Cliquez ici pour agrandir la figure .


Figure 5. Graphique montrant l'évolution de l'épaisseur du film avec l'augmentation de volume de la solution coulée SurgiLux (ml) et une zone de coulée constante (7,09 x 10 3 mm 2).

Figure 6
Figure 6. Microscope électronique à balayage (MEB) d'un film montrant la présence de «mamelons» (SN) dépassant de la surface (S).

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Discussion

Le chitosane peut être obtenue dans une variété de poids moléculaires et avec différents degrés de deactylation (PDD). Les variations de la pureté chitosane peut conduire à la présence de particules dans la solution SurgiLux; centrifugation est utilisée pour éliminer ceux-ci et devrait aboutir à une solution transparente verte. Cependant, la filtration peut également être utilisé comme étape de fabrication supplémentaire ou de remplacement. Comme pour tout traitement de matériaux, variations, tels que le chitosane DDA et le poids moléculaire, ont des implications pour les physico-chimiques, des propriétés biologiques et matérielles des films SurgiLux résultant, y compris la force de sa liaison aux tissus.

Le procédé de fabrication de SurgiLux autorise des variations considérables. Par exemple, les changements de rapport du volume de la solution à la surface de coulée (ml: mm 2) peut être utilisé pour ajuster l'épaisseur de film de la figure 5 montre une augmentation linéaire de l'épaisseur de films SurgiLux finales du volume.de la solution versée dans la boîte de Pétri a été augmenté. De même, des modifications de la surface de coulée peut être utilisé pour modifier la morphologie de surface du film. La figure 6 montre la présence de l'ordre du micromètre «mamelons» sur la surface du film SurgiLux. Ces techniques de création de modèles peuvent être utilisés pour produire des surfaces différentes pour améliorer l'adhérence des tissus, de prévenir la fixation des cellules microbiennes et favoriser la réinsertion des tissus. 11 En outre, divers agents biologiquement actifs peuvent être incorporés dans le processus de fabrication afin de produire un film adhésif pour l'administration de médicaments régionale 10.

Le tableau 1 résume les avantages de ce système SurgiLux couche mince d'adhésif par rapport à la fibrine conventionnelle et colles cyanoacrylates. Bien que la force de la réparation tissulaire est inférieure à sutures, SurgiLux évite les nombreux inconvénients de cette technique traditionnelle fermeture de la plaie ainsi que les courants commerciaux privilégiés adhésifs chirurgicaux.

La capacité de SurgiLux à diverses obligations tissus collagènes associés à sa flexibilité matériau suggèrent son potentiel en laparoscopie, tandis que la polyvalence du procédé de fabrication favorise la poursuite de son développement pour des applications en génie tissulaire et la médecine régénérative.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

Les auteurs reconnaissent une subvention de la Santé nationale et du Conseil de recherches médicales de l'Australie (NHMRC # 1000674) à LJR Foster.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chitosan Sigma-Aldrich 448877
Indocyanine Green Sigma-Aldrich I2633 Also known as Cardiogreen
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099
Infra-red diode laser with fiber delivery. (808 nm, 120 mW, Beam core 200 μm) CNI Lasers Fc-808 Variable system up to 5 W power
Laser safety glasses CNI Lasers LS-G
Tensile testing apparatus Instron Pty Ltd 5542 50 N load cell

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References

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