CYP2D6 동물 모델 : 마우스에 면역 간염을 유발하는 방법

Medicine
 

Summary

주요 인간 autoantigen을 표현 아데노 바이러스와 생쥐의 감염은 CYP2D6의 광범 간염, 섬유증 및 생성을 특징으로 면역 - 매개 간 질환의 영구적인 형태로 제 2 형자가 면역 간염 결과에서 고통받는 환자 세라 인정 P450 2D6 (hCYP2D6)를 시토크롬 특정 면역 반응.

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Hintermann, E., Ehser, J., Christen, U. The CYP2D6 Animal Model: How to Induce Autoimmune Hepatitis in Mice. J. Vis. Exp. (60), e3644, doi:10.3791/3644 (2012).

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Abstract

자가 면역 간염은 알 수없는 병인 1,2의 간을 드물지만 생명에 지장 면역 질환이다. 과거 수많은 시도에서 인간의 질병 3-5의 특성을 반영 동물 모델을 생성되었습니다. 그러나 다양한 모델로 질병의 유도 오히려 복잡했고 종종 간염 3-5에만 일시적했습니다. 따라서 트리거 6으로 제 2 형자가 면역 간염 (AIH-2), 즉 hCYP2D6에서 주요 인간 autoantigen를 사용하여 간단한 마우스 모델을 개발했습니다. hCYP2D6을 인식 1 형 간 - 신장 microsomal 항체 (LKM-1) 항체는 AIH-2 7,8의 특징입니다. wildtype FVB 또는 C57BL / 6 마​​우스에 hCYP2D6 게재가 간으로 트리거링 항원의 직접적인 전달을 보장합니다 아데노 바이러스 구조 (AD-2D6)에 의해했습니다. 따라서, 다음의 지역 염증이 autoimmunity의 후속 개발을위한 비옥한 분야 9를 생성합니다. C광고-2D6의 정맥 주사와 intraperitoneal 주사의 ombination은 간장에 대한 지속적인 면역 손상 (섹션 1) 유도하기위한 가장 효과적인 경로이다. 여기 간 질환은 CYP2D6 모델에서 유도되는 방법과 간 손상의 다양한 측면을 평가하는 방법을자가 면역 질환에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 첫째, hepatocyte 같은 aminotransferases 등의 파괴,뿐만 아니라 hCYP2D6 항체의 titers을 나타내는 마커의 혈청 수준은 혈액 retroorbitaly (섹션 2) 샘플링에 의해 결정됩니다. 둘째, hCYP2D6 특정 T 세포 반응은 비장과 간장에서 lymphocytes를 수집하는이 특징입니다. 순수 간 lymphocytes를 얻기 위해, 간은는 콜라겐으로 소화와 Percoll 기울기 (섹션 4) 위에 정화 포털 정맥 (섹션 3)를 통해 PBS에 의해 perfused됩니다. hCYP2D6 특정 T 세포의 빈도는 hCYP2D6 펩티드 및 유동세포계측법 의한 IFNγ 생산 세포 (섹션 5)의 식별과 자극에 의​​해 분석됩니다. 셋째,세포 침투와 섬유증은 간암 섹션 (섹션 6) immunohistochemistry에 의해 결정됩니다. 이러한 분석 섭생이 모델의 만성적인 성격을 증명하기 위해서는 질병의 개시 이후에 여러 번 실시되어야한다. 주파수와 활동 hCYP2D6 특정 T 및 / 또는 B 세포 및 간 손상과 섬유증의 정도 특징으로 면역 반응의 정도는 예방 지연이나 autodestructive을 폐기하기위한 가능한 치료의 후속 평가를 위해 평가되어야 간장의 과정입니다.

Protocol

1. 안과 부비동에 광고-2D6의 정맥 주사

  1. 멸균 조건에서 5 농도로 AD-2D6 바이러스 주식 솔루션을 희석 X 10 9 pfu / RPMI에서 ML 얼음에 광고-2D6 바이러스 솔루션을 유지. 5 X 10 8 pfu (정맥 주사 및 intraperitoneal)의 두 복용의 주사 FVB 변형의 마우스의 면역 간염의 가장 신뢰성있는 결과를 초래할 입증했다.
  2. 마취 챔버에서 isoflurane 4퍼센트와 마우스를 마취. 동물 anesthetized인지 확인하기 위해 뒷다리 다리를 꼬집어.
  3. 목 뒤쪽으로 마우스를 잡고 엄지와 가운데 손가락으로 머리가 느슨한 피부를 조입니다. 이처럼, 눈은 눈에 인접한 피부에 견인에 의해 약간 protrudes.
  4. 중간 안각 (동물의 코에 가장 가까운 눈꺼풀의 교차점)에 수직으로 바늘을 놓고 천천히 100 μl AD-2D6 바이러스 솔루션을 주입. 그것은 너무 많은 압력을 적용하지 않는 것이 중요합니다,에혈관과 호흡 관의 손상을 방지.
  5. 천천히 spillage을 피하고 눈꺼풀을 닫으 바늘을 철회.
  6. 바이러스 솔루션은 코를 여물을 누설하지 않으며 눈이 초기 위치로 다시 미끄러져면 분사가 잘 일했습니다.
  7. 즉시 정맥 주사에​​ 따라, 광고-2D6 바이러스 솔루션의 두 번째 100 μl의 표준 intraperitoneal 주사를 수행합니다.

또는 정맥 주사는 꼬리 정맥을 통해 실행될 수 있습니다. 그러나 안과 부비동 통해 주입 수행하는 훨씬 더 쉽습니다 및 바이러스 솔루션의 손실을 최소화합니다. 그것은이 두 기술이 상호 교환하고 두 노선이 10 동등하게 효과적이다 그것 사용할 수 입증되었습니다.

감염된 생쥐는 악영향 등 식욕 상실, 체중 손실, 이동성의 손실, 신랑 장애, 거친 털 코트와 같은 고통과 고통의 명백한 징후를위한 모니터 hunched있다외관뿐만 아니라, 긁힘이나 특정 영역 (주사기 즉 사이트)를 흔들어 물어뜯고 핥아. 쥐가 CYP2D6 모델 간장에 강력한 피해를 표시할 수 있지만, 생쥐는 건강한 것과 고통, 통증이나 스트레스의 징후를 보여 없습니다. 그럼에도 불구하고, 같은 혈청 aminotransferases 등 심각한 간 장애의 지표는 정기적으로 결정하거나 수행한 실험의 일부입니다. > 1,000 U / L의 혈청 아미노 전이 효소 수치는 바이러스 감염의 직접적인 결과로 나타나지만 만성한다. 혈청 아미노 전이 효소 수치가 1,000 이상 만성의 경우 U / L은 (심각도 제한) 생쥐가 희생된다.

2. 마우스 안구 출혈

  1. 마취 챔버에서 isoflurane 4퍼센트와 마우스를 마취. 동물 anesthetized인지 확인하기 위해 뒷다리 다리를 꼬집어.
  2. 목 뒤쪽으로 마우스를 잡고 엄지와 가운데 손가락으로 머리가 느슨한 피부를 조입니다. 이처럼, 눈에 의해 약간 protrudes안구에 인접한 피부에 견인.
  3. 부드럽게 눈 및 하단 또는 내부 모서리에있는 모세관 튜브의 끝을를 삽입하지만, 굳게 안과 정맥 부비동에 안구 함께 미끄러졌습니다. 정맥 모세관 파열하고 그 결과 출혈이 궤도 구멍을 채웁니다.
  4. 약간 누적된 피로가 튜브에 그려진 있도록 팁을 해방하는 모세관 튜브를 철회.
  5. 충분한 혈액이 수집되면 튜브를 철회하고 눈꺼풀이 닫힙니다. 출혈 튜브 및 정맥 복합시 정상적인 안구 압력 회복의 철회에 따라 중지됩니다.
  6. 모세관 튜브에 혈액이 Microtainer 튜브로 전송하고 얼음에 30 분 동안 incubated합니다.
  7. Microtainer 관은 4 ° C.에서 2 분 7,500 XG에 centrifuged합니다
  8. 뜨는은 신선한 튜브로 전송하고 -80에 저장되는 혈청 ° C.에 해당
  9. 세럼은 엘리사에 의해 항체 titer를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. Indica이러한 로슈 진단에서 따라 테스트 스트립 (만하임, 독일)와 Reflotron 플러스 분석기 (를 사용하여 아미노 전이 효소 아미노 전이 효소 알라닌 (ALT / GPT)와 aspartate가 (대서양 표준시 / 쓸만하) 평가 수 간장 효소의 혈청 수준과 같은 간 손상의 tors 로슈 진단, 만하임, 독일).

또는 혈액 샘플링은 꼬리 정맥을 통해 또는 외면 시간적 정맥 11를 통해 수행할 수 있습니다.

3. 마우스 간 재관류

비고 :이 단계는 혈액 lymphocytes에 의한 절연 간 lymphocytes의 오염을 방지하는 것이 중요하다

  1. 경추 전위 뒤에 CO 2의 치명적인 복용으로 마우스를 안락사.
  2. 스티로폼 보드의 뒤쪽에 누워 동물을 탑재합니다. 사지을 달아 ~ 23 G의 바늘을 사용합니다.
  3. 보습과 70% EtOH로 마우스를 소독
  4. 멀리 뒷다리로부터 1cm 소개를 통해 절개를 할피부와 근육 층. 피임기구까지 일하는 동물의 양쪽에 절단.
  5. 격막에 도달하면 피부가 거꾸로 뒤집힌 수 있습니다.
  6. 멀리 입술에서 격막을 잘라내기하면 다음 대정 맥을 했네요.
  7. 포털 정맥을 노출, 오프쪽으로 위장과 창자를 이동합니다.
  8. 차가운 PBS로 가득한 5 ML의 주사기에 연결된 27 G 바늘 삽입 포털 정맥합니다. PBS 천천히 간 혈액을 씻어 보자.
  9. 피임기구에 잡는와 신체에서 떨어져 피임기구를 절단하여 간을 해부.
  10. 배양 접시에 간장을 전송하고 횡경막을 제거, 담낭 및 기타 조직은 여전히​​ 간장에 연결
  11. 얼음에 50 ML 관에서 10 ML PBS로 간을 전송 또는 10월 화합물에 포함.

4. 간 lymphocytes의 분리

  1. 다음 주식 솔루션을 준비 :
    • Collagenase IV 주식 (100 밀리그램 / ML) IN PBS. (-20 ° C에서 작은 aliquots 및 저장소를 확인합니다.)
    • PBS의 DNase 주식 (25 밀리그램 / ML). (-20 ° C에서 작은 aliquots 및 저장소를 확인합니다.)
    • Collagenase 버퍼 : PBS 0.2 밀리그램 / ML collagenase IV, 0.02 밀리그램 / ML DNase 5 % FCS를 포함, 1 간 이식은 9.5 ML 얼음처럼 차가운 PBS, 20 μl collagenase IV (100 밀리그램 / ML 주식), 8 μl DNase를 (혼합 25 MG / ML 주식), 500 μl 열 inactivated FCS.
    • 35 % Percoll, 믹스 175 ML Percoll, 20 ML 10 × PBS 주식, 305 ML PBS.
    • RPMI 완료 = RPMI 10 % 열 inactivated FCS, 100 μ / ML 페니실린, 100 μg / ML의 스트렙토 마이신, 2 개의 MM L-글루타민을 포함.
  2. 얼음 배양 접시에 신선한 PBS의 10 ML에 perfused 간장 (3 항 참조) 전송과 가위를 사용하여 작은 조각으로 잘라.
  3. 유리 유봉 또는 2 ML의 주사기에서 유봉과를 통해 70 μm의 셀 스트레이너 및 짜내 간 junks로 전송합니다. 조심스럽게 10 ML 차가운 collagenase 버퍼와 추가스트레이너를 통해 누르십시오. 스트레이너를 통한 서스펜션 및 필터로 두 번 더를 수집합니다.
  4. 얼음에 신선한 50 ML 관에 정지를 전송합니다. 다음에 간장을 처리합니다.
  5. 60 분 동안 37 ° C에서 간 세포 현탁액을 품어, 매 15 분 가볍게 섞는다.
  6. 4 ° C.에서 3 분 30 XG에 원심 분리기
  7. 펠렛 위에 5mm 오일을 떠나, 새로운 튜브에 뜨는 전송
  8. 4 ° C. 10 분 650 XG에 원심 분리기
  9. 펠렛 위의 3mm두고, 뜨는 취소
  10. 20 ML Percoll 버퍼에 Resuspend 펠릿
  11. 4 ° C.에 20 분 600 XG에 원심 분리기
  12. 튜브를 flicking으로 뜨는 및 resuspend 펠릿 폐기하십시오.
  13. PBS로 펠렛 1 X 씻으십시오.
  14. 전체 RPMI와 펠릿 1 X 씻으십시오
  15. 3 ML RPMI에서 Resuspend 펠렛은 완료하고 1시 10분 희석에서 셀을 계산합니다.
  16. RPMI에서 ~ 10 7 셀 / ML에서 Resuspend 전지는 완료하고 얼음으로 튜브를 전송할 수 있습니다.
  17. 5. 세포내 시토킨 염색법 (ICCS)

    5.1 자극 :

    1. 설명된대로 완전한 RPMI 년 ~ 10 7 셀 / ML에 간 lymphocytes를 준비합니다. 플레이트 100 μl (10 6 셀) / 잘 조직 문화 처리되지 플랫 96 - 웰 플레이트에.
    2. 추가 50μl RPMI가 2μg/ml Brefeldin을 포함한 완료 후 추가 50μl RPMI CYP2D6 펩타이드를 자극 2 μg / ML을 포함하는 완전한 (즉 immunodominant CD4 에피토프 CYP2D6 41-60 PGLGNLLHVD FQNTPYCFDQ 12 immunodominant CD8 에피토프 CYP2D6 193-212 RRFEYDDPRF LRLLDLAQEG 12). pipetting하여 섞는다.
    3. 37에서 5 시간 동안 품어 ° C (최적의 자극 시간이지만 하룻밤 배양도 잘 작동합니다).

    5.2. 염색법 :

    1. 다음 주식 솔루션을 준비 :
      • FACS 버퍼 : PBS가 1 % 소태아 s를 포함하는erum (FCS).
      • 고정 / Permeabilization 버퍼 : 0.1 %의 사포닌과 4 % paraformaldehyde를 포함하는 FACS 버퍼
      • FACS / 사포닌 세척 버퍼 : 0.1 %의 사포닌이 들어있는 FACS 버퍼
      • FACS / PFA 버퍼 : FACS 버퍼가 1 % paraformaldehyde (PFA)를 포함하는
    2. V-바닥 microtiter 플레이트 (96 - 음)로 셀을 전송과 4에서 3 분 460 XG에 스핀 ° C. 미디엄과 와동 플레이트는 폐기
    3. 4에서 3 분위한 460 XG 150 μl FACS 버퍼와 원심 분리기를 추가 ° C. 미디엄과 와동 플레이트는 폐기하십시오. 단계를 씻어 반복합니다.
    4. 15 4 ° C에서 최소 150 μl 염색법 버퍼 : 2 x를 씻고 (에서 2 분 460 XG위한 FACS 버퍼 1 μg / ML αCD16/32 칵테일 (FcR 블록)와 블록 표면 FcR 필요한 경우 (이차 항체 사용시) 4 ° C).
    5. 표면 분자위한 청바지 : 예 안티 CD8a-FITC mAb 10 μg / 4시 30 분 ° 어둠 속에서 C 50 μl FACS 버퍼에 ML.
    6. 100 μl FACS 추가4 ° C.에서 3 분 460 XG에서 버퍼와 스핀
    7. 150 μl FACS 버퍼 (; 3 분, 4 ° C에서 460 XG)와 세포에게 2 x를 씻으십시오. 와동 플레이트.
    8. RT에서 10 분, 100 μl 고정 / permeabilization 버퍼와 세포를 permeabilize / 수정합니다.
    9. 4 ° C.에서 7 분을위한 460 XG에 스핀 그것이 고정 / permeabilzation 단계는 세포의 전반적인 밀도를 변경 이후, 7 분 원심 분리 시간을 연장하는 것이 중요합니다. 와동 플레이트.
    10. 150 μl FACS / 사포닌 세척 완충액 (; 7 분, 4 ° C에서 460 XG) : 2 x를 씻으십시오. 와동 플레이트.
    11. 세포내 분자위한 청바지 : 예 안티 IFNγ-PE mAb 4에 30 분 50 μl FACS / 사포닌 세척 완충액에서 10 μg / ML ° C.
    12. 4에서 7 분을위한 460 XG 100 μl FACS / 사포닌 세척 버퍼와 스핀을 추가 ° C.
    13. 150 μl FACS / 사포닌 세척 완충액 (; 7 분, 4 ° C에서 460 XG)와 세포에게 2 x를 씻으십시오. 와동 플레이트.
    14. 세포에게 FACS 버퍼 1 개 x를 (; 7 분, 4 ° C에서 460 XG) 씻는다. 와동 플레이트. 200 μl FACS / 4에서 PFA 버퍼 튜브로 전송 및 저장 ° 어둠 속에서 C에서 Resuspend 세포 유동세포계측법에 의한 데이터 수집까지. 우리는 일반적으로 FACSCanto II 또는 FACSCalibur (BD Biosciences, 하이 델베르크, 독일)을 사용합니다.

    6. Immunohistochemistry

    6.1. 일반적으로 간 병리의 평가를위한 H & E 염색법 :

    1. 추수 간, 드라이 아이스에 일회용베이스 금형 및 급속 냉동의 피부 조직 - 테크 10월에서 잠그다.
    2. -17에서 설정 Leica 그라 이오 스탯을 사용하여 7 μm의 간 조직이 섹션을 잘라서 ° C와 Superfrost 플러스 현미경 슬라이드에 조직 섹션을 탑재합니다. -20에서 매장 슬라이드 ° C 이상 사용까지.
    3. -20 ° C.에 15 분 동안 예비 냉각 EtOH에서 cryosections 고쳐 10 분 동안 건조하자.
    4. 상온에서 2 분 (- 6.1.13, 상온에서 수행되는 다음 단계, 6.1.5)을 증류수 2에서 x를 씻으십시오.
    5. 에 대한 메이어의 Hematoxylin 용액에 얼룩8 분.
    6. 따뜻한으로 씻는다 (30 ° C) 수돗물을 10 분 동안. 물로 여러 번 변경합니다.
    7. 증류수로 씻어.
    8. 20 초 동안 95 % EtOH로 씻어.
    9. 40 초 동안 Eosin G / Y 용액에 Counterstain.
    10. 인큐베이션 당 5 분에 대한 95 % EtOH 2에서 x를 탈수.
    11. 인큐베이션 당 5 분에 대한 100 % EtOH 2에서 x를 탈수.
    12. 개간 당 5 분 동안 크실렌이 X에서 해제합니다.
    13. Roti-Histokitt에 탑재합니다.

    6.2. 콜라겐 나는 증착을위한 Immunohistochemistry :

    1. 추수 간은, 조직 - 테크 10월에 젖어. 드라이 아이스에 일회용베이스 금형 및 급속 냉동 인치
    2. -17에서 설정 Leica 그라 이오 스탯을 사용하여 7 μm의 간 조직이 섹션을 잘라서 ° C와 Superfrost 플러스 현미경 슬라이드에 조직 섹션을 탑재합니다. -20에서 매장 슬라이드 ° C 이상 사용까지.
    3. -20 ° C.에 15 분 동안 추위 EtOH에 cryosections 고쳐 10 분 동안 건조하자.
    4. 상온에서 2 분 동안 PBS 2에서 x를 씻으십시오.
    5. <리> 품어은 PBS에 0.3 % H 2 O 2 실온에서 10 분에 대해 0.1 % 나-azide를 포함.
    6. 상온에서 2 분 동안 PBS 2에서 x를 씻으십시오.
    7. 제조 업체의 지침에 따라 아비딘 - 비오틴 차단 키트 차단합니다.
    8. 상온에서 30 분 동안 PBS (FCS / PBS)에서 10 % FCS와 함께 차단합니다.
    9. 일차 항체는 10 % FCS / PBS에 1:200 희석되는 토끼 항 마우스 콜라겐 I 항체이다. 상온에서 2 시간에 대한 일차 항체로 섹션을 품어.
    10. 상온에서 4 분 동안 부분에게 PBS에서 3 x를 씻으십시오.
    11. 1:500으로 biotinylated 안티 토끼 항체를 희석하고 실온에서 1.5 시간에 해당하는 섹션으로 품어.
    12. 상온에서 4 분 동안 부분에게 PBS에서 3 x를 씻으십시오.
    13. 색상 반응은 아비딘 - 퍼옥시데이즈의 켤레축와 제조 업체의 지침에 따라 diaminobenzidine-과산화수소와 연속 배양에 의해 얻어진다.
    14. 메이어 년대 Counterstain 그5 분 대한 matoxylin 솔루션은 실온에서 2 분 동안 PBS 2에서 x를 씻고 Aquatex에 탑재합니다.

    7. 대표 결과

    간 손상의 광고-2D6 유발 별개의 두 단계로 쥐를 감염. 감염 후 첫 일 동안 간장의 바이러스 감염이 혈청 아미노 전이 효소 수준의 급성 증가, hepatocyte 사망 6 표시기가 발생합니다. 첫 번째, 급성 단계 hCYP2D6의 표현의 독립적 발생하며 빈 제어 바이러스 (광고 제어) 또는 녹색 형광 단백질을 (AD-GFP) 표현 바이러스 감염 후 볼 수 있습니다. 반대로, 두번째 단계는 면역 - 중재 및 트리거링 분자 hCYP2D6의 표현에 따라 달라집니다. 이것은 면역 단계 2~4주 사후 감염 내에서 발생하고 몇 개월 6 지속.

    그림 1

    <P 클래스 = "jove_content"> 그림 1. CYP2D6 모델입니다. Wildtype FVB 또는 C57BL / 6 마우스는 광고-2D6의 두 복용 (정맥 주사 및 intraperitoneal)로 주입된다. 관심있는 동시에 간과 혈청을 채취하고 있으며 간 손상과 hCYP2D6 특정 항체 및 T 세포의 형성을위한 평가.

    다음과 같은 기능이 wildtype FVB 또는 C57BL / CYP2D6 모델 6 생쥐의 AD-2D6 - 감염 후 개발 영구 면역 간염에 대한 특성이 있습니다 : 먼저, 간은 aberrantly 변경된 형태를 보여줍니다. 특히, 간 엽 (叶)이 융합되어 hyperplasic nodules은 전체 간, 대규모 capsular의 섬유증은 (그림 2) 표시 흩어져 나타납니다.

    그림 2

    그림 2. 간 형태. 전형적인 AD-2D6 유도된 간 손상은 주 4 이후의 감염에 감지. 개인 간 엽 (叶)이 (화살촉) 융합되어 있습니다. Hyperplasic nodules은 전체 간장 (화살표)를 통해 흩어져 나타납니다. hCYP2D6을 표현하지 컨트롤 아데노 바이러스로 감염이 간 형태에 아무런 영향을 미치지 않습니다.

    , 둘째 광범위하고 지속적인 세포 infiltrations는 광고 제어에 감염된 AD-2D6에 감염된 아니지만 생쥐 (그림 3A)의 간을의 사망 시에 포털 parenchymal 지역에서 나타납니다. 섬유증은 주로 실질 조직 (그림 3B)에 튀어나온 일부 콜라겐 번들로 subcapsular 지역에서 개발하고 있습니다.

    그림 3


    그림 3. 간 조직학 :. 주 4 이후의 감염에 광고 컨트롤이나 광고-2D6 중 하나에 감염된 FVB 생쥐의 간 조직 섹션의 H & E 염색법. mononuclear 세포의 상당 infiltrations가 (AD-2D6 감염된 생쥐에서만 존재합니다단일 화살표). 트리플 화살표 인접 포털 책자 사이에 브리지 간 실질 조직의 큰 세포 infiltrations를 나타냅니다. B : AD-2D6 또는 광고 - 제어 감염 후 주 4에 간 섬유증의 Immunohistochemical 표현. 간 부분은 안티 - 콜라겐 I 항체를 사용하는 콜라겐에 대해 묻다되었습니다. 실질 조직 (단일 화살표)와 침투 세포 (화살촉)의 대규모 클러스터의 존재로 튀어나온 일부 번들로 간 캡슐 (트리플 화살표)에서 콜라겐 처분의 여러 계층을합니다. 두 대표 간 섹션은 각 조건에 대해 표시됩니다. 크기 막대 : 100μm.

    세 번째 기능은 인간 LKM-1 항체 6,13 유사한 에피토프의 특이성을 가지고 안티 CYP2D6 항체의 높은 titers의 세대입니다. 마지막으로, hCYP2D6 특정 CD4와 CD8 T 세포는 간을 집에 그 주로 생성됩니다. 이러한 hCYP2D6 특정 T 세포는 immunodomi과 자극에 의​​해 감지 수 있습니다nant hCYP2D6 펩티드와 세포내 시토킨 염색법 (ICCS) (그림 4)에 의해 IFNγ 표현의 후속 측정. hCYP2D6 특정 CD8 T 세포가 생체내 12 AD-2D6에 감염된 표적 세포를 죽일.

    그림 4

    4 그림. hCYP2D6 특정 T 세포. hCYP2D6 특정 T 세포의 흐름 cytometric 분석. 간 lymphocytes는 AD-2D6 - 감염 후 주 4에 고립되었으며 immunodominant CD4 또는 CD8 하룻밤 hCYP2D6 에피토프 자중 자극했다. IFNγ의 생성은 세포 내 시토킨 염색법에 의해 감지하고 FACS 캔토 II (BD Biosciences, 하이 델베르크, 독일)를 사용 유동세포계측법에 의해 분석되었다. hCYP2D6 특정 CD4와 CD8 세포의 비율이 표시됩니다.

Discussion

이전 연구에서 실험 형 간염은 주로자가 면역 질환 간 질환에 대해서만 일시적 많은 현재의 모델은 다소 복잡한 질병 유도 프로토콜 (서평 3,5 참조)에 따라 달라집니다 것으로 보도되었다. 예를 들어, 몇몇 모델은 특정 대상 항원을 표현 형질 전환 생쥐를 사용하고 adoptively 표적 항원에 특정한, 대부분 TcR - 유전자 변형, T 세포 14,15을 양도. 종종 livertropic 바이러스, 박테리아 또는 기생충과 추가 감염 질병 16-18를 유도해야합니다. 또는 CYP2D6 19를 포함하여 대상 항원, 인코딩을 plasmids과 DNA-접종이 간염을 유발하는 데 사용됩니다. 그러나 이러한 IL-12과 같은 프로 염증성 크린 시토킨, 인코딩을 plasmids있는 추가 접종은 20 필요합니다. 불행하게도, 몇 가지 예외 15-20 형 간염은 일시적입니다.

CYP2D6 모델 6,21는 직접적인 방법 t를 사용단순히 hCYP2D6, AIH-2 7,8의 주요 autoantigen을 표현 아데노 바이러스와 쥐를 감염에 의해 면역 간염을 유발 O. 아데노 바이러스 구조에 의한 CYP2D6의 배달 간의 직접 타겟팅을뿐만 아니라 관용의 분해를 촉진 지역 염증을 모두 보장합니다. 그것은 바이러스 titer뿐만 아니라 행정의 노선이 모두이 모델의 중요한는 것을주의하는 것이 중요합니다. 한편, 광고-2D6은, 따라서, 복제 결함 바이러스 바이러스의 충분한 높은 titer는 간장 내에서 항원의 중요한 금액을 생성하기 위해 필요합니다. 한편, 너무 높은 titer는 치명적인 급성 간경화가 발생할 수 있습니다. 또한, 그것은 아데노 바이러스의 높은 titers에 의한 생쥐의 감염이 면역 반응 22 기능적인 피로로 연결되는 이전에 입증되었습니다. 우리의 모델에서, 우리는 둘 다 만성 세포 침투뿐만 아니라 내선 번호를 얻기 위해서는 정맥 주사와 intraperitoneal 감염의 조합을 사용ensive 섬유증. 우리는 혼자 정맥 주사 감염이 여전히 심한 세포 침윤을 초래하지만, intraperitoneal 주사로 인해 해당 복막 염증을 나타내는 subcapsular 지역에 대한 섬유증은, 콜라겐의 지속적인 subcapsular 축적 (Hintermann & 카누, 준비 원고)에 관여하지 있기 관찰했습니다. 그러나 우리가 광고-GFP 또는 광고 제어 23 평등 바이러스 titers으로 감염 후 간장 별 모양의 세포와 콜라겐 증착의 활성화를 검색하지 않았으므로 관찰된 간장 섬유증은 항원에 특정한된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

CYP2D6 모델과 같은 영구적인 세포 침윤과 간 섬유증 6 특징으로 만성 간염과 같은 인간의 AIH의 1,2의 여러 ​​측면을 반영합니다. 또한, 유사한 에피토프의 특이성과 AIH-2 환자에서 발견 LKM-1 항체에 13 확산과 높은 titer 안티 CYP2D6 항체의 존재는 사전을 나타냅니다일반적인 만성자가 면역 반응의 sence. CYP2D6는 AIH-2의 주요 항원 있지만 더 자주 1 형 AIH 진단을 환자가 인식되지 않습니다. 또한, 그러한 기본 담즙 간경변 (PBC) 또는 기본 sclerosing cholangitis (PSC)와 같은 면역 병인 다른 간 질환에서 고통받는 환자가 특징의 autoantibodies을 생성하는 고유한 간 autoantigens과 그들의 간을 대한 특이성과 소형을 중심으로 서로 다른 병리 학적 특징 (PBC을 보여 ) 또는 대형 (PSC) 담즙 관. 그럼에도 불구하고, CYP2D6 모델 hepatocytes의 면역 파괴를 운전하고 질병을 치료할 수 치료 개입을 평가하는 핵심 선수를 식별할 수 있도록,자가 면역 질환 간 질환 중에 발생으로 만성 간장 염증 과정에 관여 immunopathogenic 메커니즘을 분석할 수있는 기회를 제공합니다.

Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

이 작품은 괴테 대학 병원 프랑 크푸르트와 UC에 대한 독일 연구 재단의 교부금에 의해 지원됩니다

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23G needle BD Biosciences 300800
27½G needle VWR international 612-0151
30½ G needle BD Biosciences 304000
Alanine aminotransferase test strips (GPT/ALT) Roche Group 10 745 138 202
Aspartate aminotransferase test strips (GOT/AST) Roche Group 10 745 120 202
Anaesthesia Unit Univentor 400 AgnTho’s
Base molds, disposable 37x24x10 mm VWR international 720-0208
Cell strainer 70mm VWR international 734-0003
Cryostat Leica Microsystems CM1850 UV
Heparinized capillary tubes Fisher Scientific 3123987
Microscope slides Superfrost Plus Menzel-Glaser J1800AMNZ
Microtainer SST tubes BD Biosciences 365951
Microtiter plates, V-bottom VWR international 391-1924
Reflotron Plus Roche Group Determiniation of serum AST / ALT
Rabbit anti-mouse anti-Collagen type I IgG, Chemicon International AB765P
Biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector Laboratories VC-BA-1000-MC15
FITC-conjugated anti mouse CD8a antibody SouthernBiotech 1550-02
PE-conjugated anti mouse IFNγ antibody BD Biosciences 554412
PE-conjugated anti-mouse CD16/CD32 antibody (FcR block) BD Biosciences 553141
Aquatex VWR international 1.08562.0050
Avidin/Biotin Blocking kit Vector Laboratories VC-SP-2001-KI01
Brefeldin A Sigma-Aldrich B6542
Collagenase IV Sigma-Aldrich C5138-100MG
DAB substrate kit 3’3’diaminobenzidine Vector Laboratories VC-SK-4100-KI01
DNase Sigma-Aldrich DN-25
Elite ABC Reagent Vector Laboratories VC-PK-7100-L050
Eosin G/Y solution Carl Roth Gmbh X883.1
Fetal calf serum (FCS) Biochrom AG S 0115
Isofluran Forene B506
Meyer’s Hematoxylin solution AppliChem A4840,1000
OCT Compound Sakura Finetek 4583
PBS-buffered formaldehyde 10% Carl Roth Gmbh A146.3
Percoll Amersham 17-0891-01
Roti-Histokit Carl Roth Gmbh 6638.1
RPMI Invitrogen 61870
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S7900

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