Isolamento dei fibroblasti Portal ratto

Biology
 

Summary

Una tecnica per isolare fibroblasti portale dal fegato di ratto è descritto. I fegati sono perfusi e digerito

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Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion. J. Vis. Exp. (64), e3669, doi:10.3791/3669 (2012).

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Abstract

Fibrosi epatica è definita dalla eccessiva deposizione di matrice extracellulare da miofibroblasti attivati. Ci sono precursori multipli di miofibroblasti epatici, tra cui le cellule stellate epatiche, fibroblasti del portale e del midollo osseo fibroblasti derivati ​​1. Cellule stellate epatiche sono stati i più studiati, ma fibroblasti portali sono sempre più riconosciute come fattori importanti per la piscina miofibroblasti, in particolare nella fibrosi biliare 2. Portale subiscono la proliferazione dei fibroblasti in risposta alla lesione epiteliale biliare, potenzialmente giocare un ruolo chiave nelle fasi iniziali della biliare cicatrici 3-5. Un metodo per isolare fibroblasti portale consentirebbe studio in vitro di questa popolazione di cellule e portare ad una maggiore comprensione del ruolo fibroblasti portale svolgere nella fibrosi biliare.

Fibroblasti portale sono stati isolati utilizzando varie tecniche tra cui escrescenza 6, 7 e liperfusione ver con la digestione enzimatica seguita dalla selezione del formato 8. Il vantaggio della digestione e selezione tecnica dimensioni rispetto alla tecnica escrescenza è che le cellule possono essere studiate senza la necessità di passaggio in coltura. Qui, si descrive una versione modificata della tecnica originale descritta da Kruglov e Dranoff 8 per l'isolamento di fibroblasti portale da fegato di ratto che si traduce in una popolazione relativamente pura di cellule primarie.

Protocol

L'intera procedura viene eseguita a temperatura ambiente a meno che diversamente specificato.

1. Preparazione di soluzioni enzimatiche

  1. Preparare soluzioni enzimatiche secondo la Tabella 1 e filtro sterile utilizzando un filtro di 0,22 micron. Mantenere soluzione 1 e 2 della soluzione a temperatura ambiente e la soluzione 3 a 4 ° C fino al momento dell'utilizzo. Tutte le soluzioni e le attrezzature che entrano in contatto con le cellule isolate deve essere sterile.

2. Preparazione delle apparecchiature di perfusione

  1. Prime il sistema di perfusione con HBSS meno di Ca 2 + / Mg 2 +, che è stato riscaldato a 37 ° C. Nota: Per assicurare che il perfusato è 37 ° C quando arriva al fegato, HBSS è scaldata in un bagno d'acqua impostata a 37 ° C. Dopo che passa attraverso la pompa di perfusione, passa attraverso un condensatore vetro incamiciato che è collegato ad una serie circolatore acqua a 40 ° C (Fig. 1).
  2. Sterilizzare chirurgicaols in un bicchiere con il 70% di etanolo.

3. Perfusione del Fegato

  1. Anestetizzare un adulto maschio Sprague-Dawley ratto mediante iniezione intraperitoneale di Nembutal (50-100 mg / kg di peso corporeo come necessario per ottenere un'adeguata anestesia).
  2. Mettete l'animale in posizione supina su un vassoio di plastica e fissare gli arti al vassoio con del nastro adesivo.
  3. Pulire l'addome con il 70% EtOH.
  4. Fai una piccola incisione nella pelle dell'addome sulla linea mediana. Dissect la pelle dalla fascia apportando U taglio sull'addome. Tagliare il muscolo addominale con forbici che segue la stessa forma per esporre la cavità peritoneale.
  5. Esporre la vena portale utilizzando 2 tamponi di cotone per spostare delicatamente il visceri addominali sul lato destro.
  6. Passare due punti di sutura sterili in seta 2.0 sotto la vena porta e legare liberamente.
  7. Incannulare la vena portale con un catetere di calibro 16-18 IV e fissare il catetere in posizione stringendo la liberamente tiEd suture dal passaggio precedente (Fig. 2).
  8. Iniettare eparina diluita attraverso il catetere IV (1 ml di eparina 5000 unità USP / ml diluito con 4 ml di HBSS meno Ca 2 + / Mg 2 +). Il fegato deve sbollentare.
  9. Collegare il catetere IV al sistema di perfusione. Perfondere con HBSS meno di Ca 2 + / Mg 2 + ad una velocità di 20 ml / min per 10 minuti. Transetto della IVC inferiore al fegato per permettere il drenaggio del sangue e perfusato. Aspirare il sangue pool dalla cavità addominale.
  10. Cambiare il liquido di perfusione di una soluzione di collagenasi allo 0,3% (150 mg collagenasi di tipo 2 in 500 ml di HBSS più Ca 2 + / Mg 2 +) e profumato per 25 minuti. Mantenere umido il fegato coprendolo con il lembo precedentemente sezionato addominale. Coprire capsula Petri sul lembo addominale e la posizione di una lampada di calore sulla superficie di mantenere l'intra-addominale temperatura a circa 37 ° C.

4. Preparazione del the delle vie biliari

  1. Rimuovere il fegato sollevandola dalla cavità addominale con una pinza e mettetelo in un piatto sterile coltura di tessuti pieni di freddo Leibovitz L-15 media.
  2. Lavorare nel cofano coltura tissutale, rimuovere la capsula epatica e delicatamente stuzzicare il parenchima epatico a parte con una pinza. Spostare il fegato attraverso diversi piatti pieni di Liebovitz L-15 mezzi, pur continuando a prendere in giro via il parenchima, finché ha lasciato con l'albero biliare isolato. Il parenchima epatico è di colore marrone, mentre l'albero biliare rimanente è bianca.
  3. Posizionare l'albero biliare isolato in un tubo Falcon da 50 ml riempito con 10 ml di penicillina / streptomicina (10.000 UI / ml di penicillina e 10.000 pg / ml streptomicina); lasciare su ghiaccio per 15 minuti.

5. L'isolamento della Frazione Fibroblast Portal

  1. Posizionare l'albero biliare in una sterile tubo da 50 ml Falcon e tritare con le forbici sterili.
  2. Aggiungere una piccola quantità di enzima soldistribuzione pesi # 1 nel tubo (circa 5 ml) e continuare a tritare dell'albero biliare fino a raggiungere la consistenza di un impasto.
  3. Versare l'impasto in una bottiglia di vetro sterile. Lavare tubo falcon con la soluzione rimanente # 1, poi versare nella bottiglia di vetro. Incubare a 37 ° C con agitazione a 100 rpm per 30 minuti.
  4. Filtrare la sospensione attraverso un becher coperto con un singolo strato di rete di nylon (30-micron dimensione dei pori).
  5. Trasferire qualsiasi tessuto rimanente sulla parte superiore della maglia di una bottiglia di vetro sterile lavando la rete con soluzione enzimatica # 2. Inizia versando mezzo (25 ml) della soluzione in una capsula Petri 15 centimetri sterile. Rimuovere delicatamente la maglia dal bicchiere tenendo i bordi della maglia senza contaminare l'area centrale, quindi invertendo la maglia e immersione nella soluzione nella capsula Petri per rimuovere tutto il tessuto restante sulla mesh. Gettare la maglia. Trasferire la soluzione nella capsula Petri in una bottiglia di vetro sterile. Sciacquare la piastra di Petri con la Remaesaminando la 25 ml di soluzione # 2 e trasferirlo alla bottiglia di vetro stesso. Incubare a 37 ° C con agitazione a 100 rpm per 30 minuti.
  6. Nel frattempo, prendete il filtrato nel bicchiere e versare in una provetta da 50 ml Falcon. Centrifugare a 1600 rpm (460 x g) per 5 minuti a temperatura ambiente.
  7. Aspirare media e risospendere il pellet in 25 ml di soluzione # 3.
  8. Prendere la soluzione dal punto 5.5 e filtrare in un bicchiere secondo sterile coperto con maglie di 30 micron.
  9. Gettare la maglia. Centrifugare il filtrato a 1600 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare e risospendere il pellet con 25 ml di soluzione # 3 come è stato fatto nella fase 5.7.
  10. Unire le 2 frazioni di passi 5.7 e 5.9 e centrifugare nuovamente a 1600 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente.
  11. Aspirare media e risospendere il pellet in 10 ml di mezzo di coltura di fibroblasti portale (DMEM/F12 supplementato con 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina, gentamicina 0,3%, e 0,2% fungizone).
  12. Contare le cellule per la vitalità e la piastra in piastre di coltura dei tessuti. A seconda dell'applicazione desiderata, da 0,5 a 5 x 10 6 cellule per piastra da 10 cm di coltura tissutale sono appropriati. Da un adulto Sprague-Dawley di ratto, si ottiene di solito da 2 a 10 milioni di cellule vitali.
  13. Sostituire i terreni di coltura il giorno successivo per rimuovere i detriti non aderenti. Successivamente, sostituire terreni di coltura ogni 2 giorni.

6. Risultati rappresentativi

Fibroblasti primari portale isolati da fegato di ratto adulto sono mostrati a 1, 3 e 7 giorni dopo l'isolamento (Fig. 3). Si noti che le cellule sono allungati, con morfologia tipica di fibroblasti. Le celle possono essere colorati con anticorpi anti-elastina (CL55041AP, Cedarlane Labs, Burlington, NC) per confermare la purezza. Portale fibroblasti subiscono differenziazione miofibroblastico nella cultura. Questo può essere dimostrato mediante immunocolorazione per la α-actina del muscolo liscio (α-SMA, A2547, Sigma, St. Louis, MO).

Collagenasi soluzione 0,3% Tipo 2 collagenasi 150 mg HBSS con Ca 2 + / Mg 2 + 500 ml Soluzione # 1 (Pronasi) Albumina di siero bovino 50 mg Collagenasi di tipo 2 25 mg Pronasi 18 mg DNasi 3 mg DMEM/F12 47,5 ml Pen / Strep 1 ml Siero fetale bovino 1,5 ml Soluzione # 2 Albumina di siero bovino 50 mg (Ialuronidasi) Collagenasi di tipo 2 25 mg Ialuronidasi 22 mg DNasi 3 mg DMEM/F12 47,5 ml Pen / Strep 1 ml Siero fetale bovino 1,5 ml Soluzione # 3 DNasi 3 mg RPMI media 1640 50 ml

Tabella 1. Soluzioni enzimatiche.

Figura 1
Figura 1. Perfusione istituito. A. Circolatore acqua per il riscaldamento della colonna. Colonna B. contenenti supporti di perfusione. C. Rubinetto di controllo della pompa di efflusso. D. Pump afflusso. E. a velocità variabile pompa peristaltica. F. fiasco vuoto con Bio-Clean detergente. G. calore della lampada. Acqua H. bagno per i media di perfusione riscaldamento.

Figura 2
Figure 2. In perfusione situ. A. IV catetere inserito nella vena porta, fissato con sutura e collegata alla tubazione perfusione via rubinetto. B. pipetta di vetro collegato ad beuta da vuoto e di aspirazione a parete per rimuovere il liquido di perfusione drenaggio sezionato IVC. I. intestini. L. Fegato.

Figura 3
Figura 3. Contrasto di fase e immunofluorescenza macchia di fibroblasti di ratto portale della cultura. Portale fibroblasti in coltura per 1, 3, e 7 giorni dopo l'isolamento sono state fissate e colorate per elastina, α-SMA e DAPI.

Discussion

Portale fibroblasti svolgono un ruolo importante nella fibrosi biliare. Qui descriviamo una modifica del protocollo originale pubblicato da Kruglov e Dranoff 8 per isolare fibroblasti portale da fegato di ratto, fornendo un modo semplice per studiare questa popolazione di cellule in vitro.

Questo approccio utilizza digestione proteasica e basato sulle dimensioni filtrazione. Il principale vantaggio del metodo è che una popolazione di cellule relativamente pura può essere ottenuta senza passaggio in coltura, consentendo lo studio dell'espressione genica o comportamento cellulare funzionale diversi giorni dopo l'isolamento. Questa tecnica offre anche la possibilità di isolare cellule di fegato sani e malati.

Una delle fasi più critiche di questo protocollo è la digestione enzimatica del parenchima epatico. Per garantire la digestione successo, è importante per confermare che il sangue è completamente scarica dal fegato durante la prima perfusionesione facendo in modo che non vi è ancora scottatura del fegato. Per facilitare ciò, è possibile utilizzare un batuffolo di cotone per massaggiare con delicatezza il fegato mentre perfusione. Più-digestione dei risultati parenchima del fegato in una bassa resa di cellule vitali, mentre sotto-digestione renderà difficile separare il parenchima epatico dal dell'albero biliare. Dal momento che le preparazioni di pronasi hanno variabilità dell'attività enzimatica tra lotti differenti, l'ottimizzazione della quantità utilizzata potrebbe essere necessario quando c'è bassa resa di cellule vitali.

Questo protocollo può essere modificato per isolare i fibroblasti portale da fegato di topo o fegato di ratto giovane utilizzando un catetere piccolo calibro IV per incannulare la vena porta, diminuendo il volume di soluzioni di perfusione in proporzione al peso degli animali, e diminuendo la velocità di perfusione del fegato a circa 10 ml / min.

Portal fibroblasti in coltura subiscono differenziazione miofibroblastico in 10-14 giorni, come evidenziato da α-SMA expressione 9. Marcatori sono stati utilizzati vari per distinguere fibroblasti portale da cellule stellate epatiche, incluse fibulin-2, IL-6, elastina, nucleoside trifosfato diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofilina-1 e proteine ​​neuronali quali sinaptofisina 2, 6, 10, 11 . Abbiamo scoperto che l'elastina è un buon marcatore per i fibroblasti del portale, anche dopo la differenziazione miofibroblastico, mentre NTPDase2 si perde dopo fibroblasti portale sono stati sottoposti a coltura dopo diversi giorni 9. Pertanto, di solito confermano l'isolamento di fibroblasti portale mediante colorazione per immunofluorescenza elastina.

Il limite di questa tecnica è che, immediatamente dopo l'isolamento portale fibroblasti, vi è una piccola frazione di cellule contaminanti comprese cellule di Kupffer e le cellule biliari. Fibroblasti Portal sarà troppo grande per queste cellule contaminanti nel giro di 2-3 giorni, tuttavia, producendo una popolazione relativamente puro (> 98%) 9.

Since portale fibroblasti in coltura subiscono differenziazione miofibroblastico su plastica di coltura di tessuti, di solito studiano queste cellule entro 7 giorni di isolamento. Le cellule vengono mantenute in mezzi di coltura di fibroblasti portale contenenti 10% di siero fetale bovino, come descritto nella sezione Metodi. Tuttavia, queste cellule sopravviveranno in terreni di coltura contenente 2% di siero fetale bovino per diversi giorni. Noi di solito non usano mezzi a basso siero fino ad almeno 24 ore dopo l'isolamento. Una volta fibroblasti portale subiscono differenziazione miofibroblastico, possono essere diversi passaggi più volte e conservato come stock congelati di miofibroblasti.

Disclosures

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dal NIH R01 DK05823 (a RGW), F32 DK083213 (a JWW), F30 DK081265 (a ALO), e da una borsa di studio del Fred e Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (a RGW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Type 2 Collagenase Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) LS004177
Pronase Roche (Indianapolis, IN) 70290120
Hyaluronidase Sigma (St. Louis, MO) H3506
Deoxyribonuclease Sigma D4527
DMEM/F12 Invitrogen (Carlsbad, CA) 11320
HBSS without Ca2+/Mg2+ Mediatech (Manassas, VA) 21-021-CM
HBSS with Ca2+/Mg2+ Mediatech 21-020-CM
Leibovitz's L-15 Invitrogen 11415
RPMI Medium 1640 Invitrogen 11875
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
Fetal Bovine Serum Gemini Bio (West Sacramento, CA) 900-108
Nitex Nylon Mesh 30 μm Genesee Scientific (San Diego, CA) 57-105

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References

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