유동세포계측법 및 자동화된 마그네틱 활성화 셀 정렬 (AutoMACS)를 사용 나이브 및 췌장 종양 베어링 마우스에서 골수양 파생 억제 세포 (MDSC)의 작성

Medicine

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Summary

이것은 골수양 유래 억제 세포 (MDSC)를 immunophenotyping 및 GR-1 풍요로운의 신속하고 포괄적인 방법입니다

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Nelson, N., Szekeres, K., Cooper, D., Ghansah, T. Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS). J. Vis. Exp. (64), e3875, doi:10.3791/3875 (2012).

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Abstract

MDSC이지나 macrophages, 돌기 세포 및 기생충 감염, 염증, 외상 스트레스, 그라 프트 - 대 - 숙주 질환, 당뇨병 및 암 1-7 포함한 병리 학적 조건에서 림프 장기에 축적 granulocytes의 이기종 인구입니다. 생쥐에서 MDSC 특급 맥-1 (CD11b)과 GR-1 (Ly6G 및 Ly6C) 표면 항원 7. 그것은 MDSC 잘 그들이 크게 확장되는 다양한 종양 베어링 호스트에서 공부하고 있습니다 그리고 7-10 순진 대응에 비해 안티 종양 면역 반응을 억제하는 것이 중요합니다. 그러나 병적인 상태에 따라 억제 11,12의 독특한 메커니즘과 목표가있는 MDSC의 다른 subpopulations가 없습니다. 따라서 가능한 MDSC 인구를 분리하는 효과적인 방법은 시험 관내 및 생체내의 억제 그들의 서로 다른 분자 메커니즘을 elucidating에 중요하다.

최근에는 Ghansah 그룹은 murine 췌장암 모델에서 MDSC의 확장을 보도했다. 우리의 종양 - 베어링 MDSC은 항상성의 손실을 표시하고 순진 MDSC 13에 비해 진압 기능을 향상시켰습니다. MDSC 비율은 순진 대 종양 베어링 생쥐의 림프 구획에 훨씬 적습니다. 이것은 종종 이러한 MDSC의 정확한 비교 분석을 방해 주요 경고입니다. 따라서 사전에 형광 활성 세포 정렬 (FACS)으로 순진 생쥐에서 GR-1 + leukocytes을 풍부하게하는 것은 순결, 생존을 향상하고 크게 정렬 시간을 줄여줍니다. 이들은 정렬 빠른 FACS에 대한 풍부한있다 그러나 종양 베어링 생쥐에서 GR-1 + leukocytes의 농축은 선택 사항입니다. 따라서이 프로토콜에서는, 우리는 MDSC을 immunophenotyping하고 적시에 MDSC 정렬을위한 나이브 생쥐의 spleens에서 GR-1 + leukocytes을 풍요로운의 매우 효율적인 방법을 설명합니다. 면역 적격 C57BL / 6 마​​우스는 murine Panc02 CE로 주사하고재편은 subcutaneously 순진 마우스 1XPBS을받을 반면. 약 30 일 접종을 게시할 spleens는 세포 분열 체를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 수확과 처리됩니다. Splenocytes 그러면 적혈구 (RBC)은 lysed되며 이러한 leukocytes의 나누어지는은 유동세포계측법을 사용 immunophenotype MDSC 비율에 맥-1과 GR-1에 대해 fluorochrome - 복합 항체를 사용하여 묻은 게있다. 병렬 실험에서, 순진 생쥐에서 전체 leukocytes는 자동 마그네틱 활성화 셀 정렬 (autoMACS) 프로 구분 기호를 사용하여 PE-MicroBeads 함께 incubated하고 긍정적으로 선택된 형광등-복합 GR-1 항체, 물들일 수 있습니다. 다음으로, GR-1 + leukocytes의 나누어지는은 유동세포계측법를 사용 MDSC 비율의 증가를 식별하는 맥-1 항체 물들일 수 있습니다. 이제 이러한 Gr1 + 농축 leukocytes는 생체내 및 시험 관내의에서 (순진 대 종양 베어링) 비교 분석에 사용되는 MDSC의 분류 FACS 준비

Protocol

이전 시작하기 전 다음과 같은 솔루션을 준비할 :

3퍼센트 염색법 미디어 (SM) :

1X 인산 버퍼 염분의 -3 % 태아 소 혈청 (FBS) (PBS)

맥에서 버퍼 (MB) :

- 1XPBS에서 소 혈청 (BSA)에서 0.5 % 알부민

1. 마우스에서 수확 Spleens

  1. (; TB 종양 베어링) Subcutaneously 1.5 X Panc02 10 5 murine 세포를 100 μl 1X PBS에서 정지로 연령 C57BL 6-8 주 / 6 마우스 (할란)을 주입. 컨트롤 마우스는 (순진) 100 μl 1XPBS를 받게됩니다.
  2. 약 사주 포스트 분사, 이산화탄소 질식사로 쥐를 안락사시켜야.
  3. 집게와 가위를 사용 무딘 절개로 생쥐에서 수확 spleens 그런 다음 균형을 사용해 무게. 별도의 장소 spleens는 1 X PBS를 포함하는 50 ML 원뿔 튜브를 분류.

2. 단일 셀 Suspensio 생성Spleens에서 Leukocytes의 N

모든 절차는 생물 안전 후드와 얼음에 보관 세포와 항체 하에서 무균 환경에서 수행되어야합니다.

  1. 하단쪽으로 컵의 개통으로 메쉬 스크린을 삽입하여 세포 분리 체를 조립. 그런 다음 홈 붙이 측면과 함께 스레드 영역으로 유지 링을 삽입하기 때문에 장소에서 화면을 잡고 유지 링을 강화하기 위해 고리 키를 사용합니다. 10 ML 1 X PBS가 들어있는 배양 접시에있는 조립 체를 놓습니다.
  2. 풀 spleens 및 사용 유리 유봉은 세포 분열 체의 메쉬 스크린 반대하고 페트리 접시에 spleens를 갈아서합니다. 생쥐의 각 치료 그룹에 대해 반복합니다.
  3. 70 μm의 셀 스트레이너와 5 ML serological 피펫을 사용하여 50 ML 원뿔 튜브로 필터 세포 현탁액. 5 분 동안 12,000 RPM (250-300 XG)에서 원심 분리기.
  4. 비장 당 5 ML 1 X RBC의 용해 버퍼에 뜨는 및 resuspend 펠릿 제거. Pipet 위아래로 풍성히. 5 분 동안 상온에서 품어. 1 X PBS의 20 ML을 추가하여 반응을 중지합니다. Pipet 위아래로 풍성히. 5 분 동안 12,000 RPM (250-300 XG)에서 원심 분리기.
  5. 20 ML 멸균 1 X PBS에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 제거합니다. Pipet 위아래로 풍성히.
  6. 50 μl가 5x10 5-1x10 6 전지 (- 2x10 7 셀 / ML 1x10 7 세포 / ml) 쇼핑하는 것과 같습니다 있도록 trypan 파랑, 3 % SM에서 원하는 농도에서 hemacytometer과 resuspend를 사용하여 세포를 세어보세요.

3. 유동세포계측법를 사용 MDSC의 세포 - 표면 염색법 / Immunophenotyping

  1. (; 맥-1-FITC, GR-1-APC 및 DAPI 얼룩 없음, NS) 제어 및 보정 컨트롤에 대한 실험 시료와 단일 얼룩을위한 96 - 웰 V 바닥 플레이트의 우물을 레이블.
  2. 96도 V-맨 아래 판에서 / 잘 각각의 우물에 splenocytes 50 μl에 상응 5x10 5-1x10 6 셀을 추가합니다. 원심 분리기5 분 용 12,000 RPM (250-300 XG)에서 판.
  3. 얼음 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 3 % SM에서 희석 마우스 BD FC 블럭 (쥐 안티 마우스 CD16/32 단클론 항체)의 "마스터 믹스"(MM)를 준비합니다. 출발점으로서, 당 음 50 μl의 최종 볼륨의 3 % SM 1 μg FC 블록을 사용합니다.
  4. 조심스럽게 세포 펠렛의 중단없이 폐기물 컨테이너 또는 싱크대에 다시 걸쳐 빠르게 반전 판으로 96도 V-맨 아래 접시의 각 우물에서 뜨는을 제거합니다.
  5. 와동, 짧게 5 초 동안 FC 블록 MM을 원심 분리기와 96도 V-맨 아래 판의 모든 산탄 50 μl를 추가합니다. 부드럽게 자신의 우물에 샘플을두고, 아래로 pipetting 및하여 잘 섞는다. 얼음 어둠 속에서 15 분 동안 접시를 품어. 5 분 동안 12,000 RPM (250-300 XG)에서 접시를 원심 분리기.
  6. 샘플 FC 블록으로 품어 동안 얼음 1.5ml microcentrifuge 튜브의 3 % SM에서 희석 fluorochrome-복합 항체의 "마스터 믹스"(MM)를 준비합니다. 항체가 titrated해야절차를 더럽히는 것을위한 최적의 dilutions를 확인하십시오. 출발점으로서, 이런 샘플 당 50 μl의 최종 볼륨의 3 % SM에서 1시 25분 맥-1-FITC의 희석 및 GR-1-APC의 1시 20분 희석을 결합.
  7. 이전에 설명한대로 조심스럽게 96도 V-하단에 각 우물에서 뜨는 제거합니다.
  8. 와동은 짧게 5 초 동안 형광등-복합 염색법의 항체의 MM을 원심 분리기 및 제어 및 실험 쥐똥 50 μl를 추가합니다. 부드럽게 최대 pipetting 및 아래쪽으로 잘 섞는다. 단일 얼룩 보상 내용 잘 당 50 μl의 최종 볼륨의 3 % SM에서 맥-1-FITC의 1시 25분 희석, GR-1-APC 75 NG / DAPI의 ML의 1시 20분 희석을 추가 각각 웰스 있습니다. (얼룩 없음) 잘 흠없는 50 μl 3 % SM을 추가합니다. 잘 섞어서 얼음에 어두운 30 분 96도 V-맨 아래 판에서 세포를 품어.
  9. 라벨 FACS 튜브는 (5 ML, 12mm X 75mm의 폴리스티렌 원형 바닥 튜브) 96 - 웰 V-하단 플레이트의 각도에 대응합니다. 각 FACS 200 μl 3 % SM 추가튜브.
  10. 5 분 동안 12,000 RPM (250-300 XG)에서 접시를 원심 분리기와 supernatants를 제거합니다. 각 펠렛 100 μl 3 % SM을 추가하여 알약을 씻어 부드럽게 최대 pipetting 및 아래쪽으로 잘 섞는다. 5 분 동안 12,000 RPM (250-300 XG)에서 접시를 원심 분리기. 한 번 더 씻어 단계를 반복합니다.
  11. 이전에 설명한대로 조심스럽게 96도 V-하단에 각 우물에서 뜨는 제거합니다. 100 μl 3 % SM에서 각각의 펠렛을 Resuspend 잘 섞는다.
  12. 그들의 각각 분류 FACS 관으로 96도 V-맨 아래 접시의 각 우물에서 100 μl resuspended 펠렛을 전송합니다.
  13. cytometry 분석을 섞여 이전하기 위해, 75 NG / ML DAPI 제어 및 실험 샘플 및 DAPI 단일 얼룩 보상 컨트롤을 추가합니다.
  14. MDSC 비율의 흐름 cytometric 데이터 수집을 수행합니다. 부정적인 (아무 얼룩 제어)와 하나의 긍정적인 컨트롤을 사용하여 보정을 수행합니다. 있도록 로그 스케일에서 앞으로 (FSC) 대 측면 산란 (SSC)를 표시하는 도트 음모를 설정의 백혈구 인구관심을 확인할 수 있습니다. 파편과 낮은 순방향 및 사이드 흩어있는 대단히 짧은 시간을 제외한 모든 leukocytes에 큰 성문을 그립니다. 이 부모 게이트에서 DAPI-(라이브) 세포에 SSC 대 DAPI와 게이트를 표시 새로 도트 음모를 만듭니다. 이 새로 문이 인구를 선택하고 더블 긍정 맥-1 대 GR-1과 게이트를 표시하는 도트 줄거리 만듭니다 (맥-1 + GR-1 +) MDSC.

4. GR-1 + Leukocytes의 자성 농축

  1. 5 분 용 12,000 RPM (250-300 XG)에서 적절하게 라벨이 FACS 튜브 및 원심 분리기로 나누어지는 1x10 7 남아있는 흠없는 leukocytes.
  2. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 GR-1-PE 항체의 MM을 준비합니다. 최대 10 7 세포에 대한 내용은 샘플 당 50 μl 메가바이트에 GR-1-PE 항체의 1시 10분 희석을 사용합니다. 큰 세포 숫자의 경우 적절하게 볼륨을 잡고. 간단히, 5 초 동안 원심 분리기 FACS 튜브의 leukocytes에 추가 및 4시 15 분 ° 어둠 속에서 C에 대해 품어. 5 분 용 12,000 RPM (250-300 XG)에 FACS 튜브, 원심 분리기에 MB 중 두 ML을 추가하고 뜨는 버리고.
  3. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 안티 - 체육 MicroBeads의 MM을 준비합니다. 최대 10 7 세포에 대한 내용은 샘플 당 200 μl 메가바이트에 방지 PE MicroBeads의 1시 4분 희석을 사용합니다. 큰 세포 숫자의 경우 적절하게 볼륨을 잡고. 간단히, 5 초 동안 원심 분리기 FACS 튜브의 leukocytes에 추가 및 4시 15 분 ° 어둠 속에서 C에 대해 품어.
  4. 5 분 용 12,000 RPM (250-300 XG)에 FACS 튜브, 원심 분리기에 MB 중 두 ML을 추가하고 뜨는 버리고. SB 3 ML에 Resuspend 펠릿. 새로운 라벨 50 ML 원뿔 튜브로 70 μm의의 스트레이너를 통해 필터링합니다.
  5. 준비 및 주요 자동차 맥 프로 구분 기호. 적절한 솔루션과 비어있는 폐기물 용기와 리필은 모든 병, 필요한 경우. 악기에 관한 켜고 유체 용기 및 초기화 후 열 (들)의 상태를 검사합니다. 모든 기호가 녹색이어야합니다. 메뉴 상단에서 "분리"를 선택다음 메뉴 표시줄은 아래쪽 메뉴 표시줄에서 "지금 씻으십시오." 마중물 프로세스를 시작하려면 "실​​행"다음에 팝업 옵션에서 "린스"를 선택하십시오. 마중물 프로세스가 성공적으로 완료되면 악기 그러면 그것 상태 메뉴에서 "분리 준비"이라고 표시됩니다.
  6. 행 B의 부정적인 분획 수집 및 행 C. 긍정적인 분수 컬렉션 15 ML 원뿔 관을위한 행, 50 ML 원뿔 튜브의 자기 (磁 气)라고 표시된 셀로 튜브 크기와 장소에 적합한 냉장 튜브 랙 50 ML 원뿔 튜브를 선택하세요
  7. 샘플에서 민감한 모드에서 표시된 타겟 세포의 긍정적인 선택에 대해 "POSSEL_S"세포 분리 프로그램을 선택하십시오. 자기 (磁 气)라고 표시된 대상 세포 automats 칼럼에 보관되며, 레이블이 지정되지 않은 세포를 자석의 자동 철회에 행 B.에 부정적인 분수 수집 관으로 출시되며, 표시된 대상 세포는 튜브의 행 C에서 긍정적인 컬렉션 튜브에 발표 예정 랙.

+ 농축 Leukocytes의 포스트 정렬 분석

  1. GR-1을 재계산 +와 GR-1 - trypan 파란색 hemacytometer를 사용하여 분수. 3 % 염색법 매체에서 원하는 농도에서 Resuspend 세포가 50 μl가 5x10 5-1x10 6 전지 (1x10 7 셀 / ML - 2x10 7 세포 / ml) 쇼핑하는 것과 같습니다 있도록하고 correspondingly 분류 FACS 튜브 50 μl를 전송합니다.
  2. 샘플 당 50 μl의 최종 볼륨 3 % SM에서 1시 25분 희석에서 유일한 맥-1의 MM을 준비합니다. 세포를 착색하고 유동세포계측법 분석 GR-PE, 맥-1 FITC와 DAPI의 단일 얼룩 보상을 준비합니다. 200 μl 3퍼센트 SM 및 DAPI의 생존을 염색하는 등 이전에 설명을 추가합니다.
  3. 비율 또한 전후 autoMACS 농축이 MDSC 비율을 비교하는 - GR-1 +와 GR-1을 결정하는 흐름 cytometric 데이터 수집을 수행합니다.

6. 대표 결과

여기에서 우리는 R을 보여 MDSC (그림 1)으로 분류 후속 FACS를위한 풀링, 순진 spleens에서 GR-1 + leukocytes의 autoMACS 농축을위한 epresentative 결과입니다. 1x10 6 나이브 leukocytes는 사전 autoMACS 정렬로, BD LSRII 악기를 사용하여 MDSC 비율을 식별하는 데 맥-1-FITC와 GR-1-APC의 항체 물들일되었다. 1x10 7 나이브 leukocytes 그 다음 autoMACS 프로 구분 기호를 사용하여 GR-1 + leukocytes의 농축을위한 안티 GR-1-체육 항체와 PE-MicroBeads 물들일되었다. 포스트 autoMACS 농축, GR-1의 GR-1 비율 +와 GR-1 - 수집의 분수가 유동세포계측법를 사용하여 평가되었다. 1x10 6 GR-1 + leukocytes는 유동세포계측법에 의해 종양 베어링 leukocytes를 풀링되지 않은 농축에 순진 leukocytes을 풀링된 농축의 MDSC 비율을 분석하고 비교할 맥-1-FITC 항체로 제거하고 물들어 있었다.

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정렬 MDSC FACS에 대한 순진 GR-1 + leukocytes의 그림 1. AutoMACS 농축. Spleens는 췌장 종양 베어링과 순진 생쥐에서 수확 및 단일 세포 현탁액으로 처리되었다. 나이브 leukocytes 표면의 유동세포계측법 분석은 사전 autoMACS 농축 ()로, 맥-1과 GR-1 형광 - 복합 항체 물들일. 유동세포계측법의 GR-1 분석 + (B) 및 GR-1 - GR-1-체육 항체 및 안티 PE MicroBeads 물들일 풀링된 순진 leuckocytes에서 GR-1 + 세포 (C) 분수 포스트 autoMACS 농축. MDSC 및 GR-1 유동세포계측법 분석 GR-1 + 비율 후 autoMACS 농축 종양 베어링 생쥐 (E)에서 비 농축 풀링된 leukocytes (순진 마우스, N = 5에 비해 풀링된 순진 leukocytes (D)에서 + 세포 ; 종양 베어링 마우스, N = 3). MDSC 및 GR-1 비율은 대표적인 윤곽 플롯과 histograms의 문이 있습니다.

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Discussion

이것은 여러 동물 모델에서 다른 림프 조직에 적용 MDSC 인구를 처리하고 immunophentyping에 대한 자세한 방법입니다. 특히 autoMACS 농축은 splenocytes 4 GR-1 고갈, splenocytes과 림프절에서 5 골수양 하위 집합의 정화, CD8의 골수 neutrophils 14 분리와 정제 + 비장에서 T 세포 등 각종 백혈구 인구의 격리에 사용될 수 있습니다 및 림프절 15. 에 관계없이 관심있는 세포 인구, 원하는 림프 조직에서 leukocytes의 단일 세포 현탁액을 생성하는가 최적의 표면 염색법, 유동세포계측법 분석, autoMACS 농축 및 FACS 정렬이 필요합니다. 이 프로토콜에서는 leukocytes의 단일 세포 현탁액을 만드는 기계적인 분리를 사용했습니다. 그러나 이러한 Collagenase D와 같은 소화 효소를 사용하면 높이기 위해이 프로토콜에 대한 적절한 대안입니다spleens이나 기타 림프 기관에서 5 leukocytes의 수율.

유동세포계측법는 immunophenotyping의 leukocytes을위한 중요한 기술이다. 따라서 유동세포계측법 및 농축을위한 충분한 준비도 세포 현탁액 및 항체 시약을 희석에 적합한 버퍼의 사용을 필요로합니다. 더럽히는 것 미디어와 맥을 버퍼를 준비하기위한 FBS과 BSA 사이에 다른 많은 프로토콜. 그러나 이러한 시약은 eBioscience, BD Pharmingen 및 Miltenyi Biotec 같은 회사에서도 상업적으로 이용할 수 있습니다. fluorochrome - 복합 항체와 leukocytes을 더럽히는 것 때와 Miltenyi Biotec과 eBioscience에 의해 설명, BSA와 FBS 모두가 아닌 특정 바인딩을 방지. 더 중요한 건, 이들 동물의 혈청 단백질의 낮은 비율은 생존을 유지하고 leukocytes 16 clumping 방지. 그러나 우리의 경험에서 BSA는 FBS보다 autoMACS 농축을위한 최적의 염색법 나은 해결을위한 더 나은 작동하며 recommen입니다설명된 프로토콜에 ded.

이 프로토콜에서는 CD11b-FITC와 GR-1-APC 형광등 - 복합 항체 및 유동세포계측법를 사용 murine MDSC의 특징. 그것은 최적화되지 않은 결과를 방지하기 위해 높은 배경 형광의 염색법을 줄이기 위해 사용하기 전에 이러한 항체가 적정하다 것이 필수적입니다. 또한, 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법 분석에 항체를 선택할 때, fluorochromes 가능한 스펙트럼의 중복은 또한 17,18 고려해야 할 또 다른 중요한 요소입니다. 따라서 보상은이자 보상 구슬의 각 fluorochome - 복합 항체에 대한 단일 색 얼룩의 형태로 제어 스펙트럼 오버랩 18 문제를 해결할 수 있습니다. 정확한 유동세포계측법 결과에 대한 또 다른 중요한 고려 사항 생존의 염료를 사용하는 것입니다. 죽은 세포가 아닌 구체적 따라서 허위 긍정적인 결과에게 19 생성, 항체에 바인딩할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리의 생존의 염료로 얼룩 핵산, DAPI를 사용그것이 최고의 최소한의 스펙트럼 오버랩 함께 사용 fluorochrome - 복합 항체의 패널을 보완으로 우리의 분석에서 죽은 세포를 제외할 수 있습니다. 그러나 이러한 7 Aminoactinomycin D ​​(7-AAD)와 propidium의 요오드화물 (PI) 등 다른 생존의 염료가 사용 항체의 패널에 따라 설명 염색법 방법과 함께 사용할 수 있습니다. 현재, 스테인드 세포 생존 (Invitrogen)를 구별하는 능력을 잃지 않고 고정되어 permeabilized 수 있도록하여 가능한 고칠수 죽은 세포 얼룩의 숫자도 있습니다. 전반적으로, 다른 염색법 기법은 정확한 유동세포계측법 분석도 중요하다. 예를 들어,이 프로토콜에서는 96도 V-하단 플레이트의 사용은 세포와 유동세포계측법을 사용 MDSC 및 백혈구 백분율의 분석에 사용되는 시약의 작은 집중 볼륨을 허용합니다. 마스터 믹스 (MM)의 사용은 접근 방식은 또한 중 96 - 웰 V-바닥 PL을 사용하여 작은 볼륨에서 leukocytes의 동등한 immunofluorescence 라벨링을위한 중요한 기술이다ates이나 FACS 튜브. 이러한 기법은 샘플의 교차 오염의 위험을 줄일 멸균 항체를 유지하고 사용 시약 및 항체의 양을 줄일 수 있습니다.

autoMACS 프로 구분 기호는 어떤 종의 여러 개의 샘플에서 세포 인구의 효율적이고 자동화된 격리를 허용합니다. 이 프로토콜에서는 GR-1-체육 항체와 자기 PE MicroBeads을 사용 leukocytes의 간접적인 자성 라벨은 GR-1 + leukocytes의 autoMACS 농축에 사용됩니다. 이 절차는 여러 가지 세포 인구 20 농축을 위해 다른 fluorochrome - 복합, biotinylated 및 unconjugated 일차 항체에 MicroBeads를 사용 autoMACS 분리에 대해 수정할 수 있습니다. PE 분자가 여러 바인딩 사이트를 가지고 전해진다 그러나이 절차에서 우리는 매우 따라서 강하고 더 자성 라벨 (Miltenyi Biotec 그 결과, 같은 예를 들어 FITC에 반대하는 PE-복합 항체 및 안티-PE-microbeads를 사용하는 것이 좋습니다 ). 또 다른 P인간, 마우스 및 쥐 leukocytes (Miltenyi Biotec)의 절연 Mac 용 MicroBeads 다양한가이 프로토콜에 대한 ossible 수정은 직접 자기 상표의 사용이다. 그러나 fluorochrome - 복합 일차 항체를 사용하여 간접적으로 자기 라벨 추가 염색법없이 농축이나 고갈 백혈구 분수의 유동세포계측법 평가를 얻을 수 있습니다. 맥에서 가능 구분 기호하지만 수동으로 맥에서 구분 기호에 비해 매우 실용적 leukocytes의 부드러운 선택 6 샘플까지 고속, 자동 정렬을 위해 허락 autoMACS 프로 구분 기호 시스템 활용 다양한도 있습니다. 가능한 경우에는 수동으로 맥 구분 기호는 autoMACS 프로 구분 기호에 맞는 대안입니다. 추가 나이브 GR-1 + leukocytes,이 프로토콜에 대한 잠재적인 수정을 풍부하게하기 위해서는 autoMACS 프로 구분에 새로운 autoMACS 칼럼을 사용하여 적극적으로 수집 분수를 다시 실행하는 것입니다. 풍부하게 함이러한 세포가 순진 leukocytes에 비해 농축 중에 컬럼에 집중하는 경향으로 GR-1 autoMACS 프로 구분 기호를 사용하여 + 종양 베어링 leukocytes는 GR-1 분수의 회복에 크게 감소에서이 결과는 이후에이 프로토콜에 권장하지 않습니다 . 따라서이 프로토콜은 강하게 가능한 MDSC으로 정렬 후속 FACS에 대한 종양 - 베어링 leukocytes을 풀링을 권장합니다.

사전 농축, 순진 leukocytes을 풀링하고 종양 베어링 leukocytes는 그러한 MDSC 인구의 격리를 위해 정렬 저속 FACS 등 향후 애플 리케이션을 위해 사용되는 수 풀링된. 이 프로토콜은 특히 MDSC의 상당히 낮은 비율에 의한 순진 생쥐에서 MDSC의 분류 지루하고 적시 FACS를 우회하도록 설계되었습니다. 나이브 생쥐에서 GR-1 + leukocytes의 AutoMACS 농축 후 생체내의 그들의 사용을 위해 실용적이고 기능적인 MDSC의 분류, 신속 편리하고 효율적인 FACS 가능하며체외 실험 인치 같은 순진 MDSC 같은 미천한 표현 세포 인구의 직접 정렬은 정렬 긴 시간과 높은 비용과 낮은 세포 복구 및 생존 능력과 매우 비효율적 프로세스입니다. 나이브 생쥐의 준비 및 GR-1 + leukocytes의 autoMACS 농축은 약 45 분, 4 배 (그림 1)보다 MDSC 비율이 더욱 증가 걸립니다. 이 농축은 풀링된 순진 leukocytes에서 최소한 1x10 6 실용적, 농축 MDSC의 절연을위한 약 20~30분에 비 농축 leukocytes에 대한 약 12 시간에서 정렬 FACS의 시간을 줄여줍니다. 종양 - 베어링 생쥐에서 그러나, 이외의 농축에서 가능한 MDSC으로 정렬 FACS는 풀링된 leukocytes는 종양 부담에 대응 MDSC 비율의 증가 풍부한로 인해 시간이 적게 필요합니다. 그것은 정렬된 MDSC 및 기타 leukocytes 그때와 같은 혼합 백혈구 반응 (미르)와 같은 두 기능 assays에서 사용할 수 있습니다하는 것이 중요하다 생체내 입양 전송 실험 21뿐만 아니라 qRT-PCR 22, 서양 얼룩 23 cytospin / 현미경 분석을 포함하여 14 비 기능적인 assays에 있습니다. 전반적으로,이 프로토콜은 immunophenotyping 및 생체내 및 시험 관내 assays에의 과다에 사용되는 마우스, 쥐, 인간의 림프 조직이나 말초 혈액에서 면역 및 기타 leukocytes의 강화를 위해 수정할 수 있습니다.

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Disclosures

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Acknowledgements

우리는 USF의 유동세포계측법 핵심 시설을 인정합니다. 우리는 자원을 공유 닥터 드니즈 쿠퍼 감사드립니다. 우리는 또한 설정이 비디오의 촬영에 그들의 도움 마야 코헨, 로라 비롯와 다이애나 Latour 감사드립니다. NN은 박사 원정대 HRD # 0,929,435에 NSF FG-LSAMP 브리지에 의해 지원. 이 작품은 TG에게 수여 미국 암 학회 기관 연구 그랜트 # 93-032-13/Moffitt 암 센터에 의해 재정 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific Hyclone SH30028.02 Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906 Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific Hyclone SV3001403HI Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) BD Biosciences 553142 Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC eBioscience 11-0112 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC eBioscience 17-5931 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE eBioscience 12-5931 Sterile Environment
DAPI Invitrogen D1306 Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve Sigma-Aldrich CD1-1KT Autoclave before use
70-μm strainer BD Biosciences 352350 Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4333-57 Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes Fisher Scientific 08-757-12 Sterile Environment
50ml conical tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. 339652 Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes BD Biosciences 352054 Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates Corning 3897 Sterile Environment
Trypan Blue Cellgro 25-900-CI Sterile Environment
PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801 Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
AutoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101
AutoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221

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References

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Comments

2 Comments

  1. very good

    Reply
    Posted by: jin f.
    July 1, 2012 - 10:01 AM
  2. excellent

    Reply
    Posted by: Somayeh A.
    January 24, 2014 - 10:22 AM

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