अनुभवहीन और अग्नाशय के ट्यूमर असर चूहों से माइलॉयड व्युत्पन्न दबानेवाला कोशिकाओं (MDSC) फ्लो और स्वचालित चुंबकीय सक्रिय सेल छंटनी (AutoMACS) के का उपयोग कर की तैयारी

Medicine

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Summary

यह माइलॉयड व्युत्पन्न दबानेवाला कोशिकाओं (MDSC) immunophenotyping और जीआर एक समृद्ध की एक तेजी से और व्यापक विधि है

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Nelson, N., Szekeres, K., Cooper, D., Ghansah, T. Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS). J. Vis. Exp. (64), e3875, doi:10.3791/3875 (2012).

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Abstract

Protocol

पहले शुरू करने के लिए, निम्न समाधानों को तैयार:

3% धुंधला मीडिया (एस):

1X फास्फेट बफर Saline में -3% भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम (पीबीएस)

एमएसीएस बफर (MB):

0.5% 1XPBS में गोजातीय सीरम (बीएसए) से Albumin

1. चूहे से फसल Spleens

  1. (टीबी, ट्यूमर असर) subcutaneously 1.5 एक्स 10 5 Panc02 murine कोशिकाओं 100 μl 1x पीबीएस में निलंबित के साथ में उम्र C57BL के 6-8 सप्ताह / 6 चूहों (Harlan) के इंजेक्षन. चूहों पर नियंत्रण (भोले) को 100 μl 1XPBS प्राप्त.
  2. लगभग 4 सप्ताह के बाद इंजेक्शन, कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation द्वारा चूहों euthanize.
  3. इस कुंद संदंश और कैंची का उपयोग विच्छेदन के द्वारा चूहों से फसल spleens तो एक संतुलन का उपयोग कर तौलना. पृथक में जगह spleens, 50 मिलीलीटर शंक्वाकार 1 एक्स पीबीएस युक्त ट्यूबों लेबल.

2. एक एकल कोशिका Suspensio उत्पन्नn Spleens से leukocytes की

सभी प्रक्रियाओं एक जैविक सुरक्षा हूड और बर्फ पर रखा कोशिकाओं और एंटीबॉडी के तहत एक बाँझ वातावरण में किया जाना चाहिए.

  1. नीचे की ओर कप के उद्घाटन में जाल स्क्रीन डालने से इकट्ठे सेल हदबंदी चलनी. तो, पिरोया क्षेत्र में रखा पक्ष के साथ बनाए रखना है अंगूठी डालने और अंगूठी को बनाए रखना, इस प्रकार में जगह स्क्रीन पकड़े कस अंगूठी कुंजी का उपयोग करें. 10 मिलीलीटर 1 एक्स पीबीएस युक्त एक पेट्री डिश में इकट्ठे चलनी रखें.
  2. पूल spleens और उपयोग कांच मूसल सेल हदबंदी चलनी के जाल स्क्रीन के खिलाफ और पेट्री डिश में spleens पीसने के लिए. चूहों की प्रत्येक उपचार समूह के लिए दोहराएँ.
  3. 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब का उपयोग कर एक 70 माइक्रोन सेल झरनी और 5 मिलीग्राम सीरम वैज्ञानिक विंदुक में फिल्टर सेल निलंबन. 5 मिनट के लिए 12,000 आरपीएम (250-300 XG) में अपकेंद्रित्र.
  4. 5 मिलीग्राम प्रति तिल्ली 1 एक्स आरबीसी lysis बफर में निकालें सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली. Pipet और सख्ती से नीचे. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. 1 एक्स पीबीएस के 20 मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो. Pipet और सख्ती से नीचे. 5 मिनट के लिए 12,000 आरपीएम (250-300 XG) में अपकेंद्रित्र.
  5. 20 मिलीलीटर बाँझ 1 एक्स पीबीएस में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली निकालें. Pipet और सख्ती से नीचे.
  6. गिनती का उपयोग कर कक्षों trypan नीले और एक hemacytometer और 3% एस.एम. में वांछित एकाग्रता में resuspend इतना है कि 50 μl 5x10 5 - 1x10 6 कोशिकाओं (1x10 7 कोशिकाओं / एमएल 2x10 7 कोशिकाओं / एमएल) के बराबर है.

3. सेल सतह / MDSC का धुंधला Immunophenotyping के फ्लो का उपयोग

  1. नियंत्रण (, मैक-1-FITC, जीआर-1-APC और DAPI नहीं दाग, एन एस) और प्रयोगात्मक और मुआवजा नियंत्रण के लिए नमूने एकल दाग के लिए एक 96 - अच्छी तरह से वी नीचे की थाली के कुओं लेबल.
  2. 5x10 5 - 1x10 6 96 अच्छी तरह से वी के नीचे प्लेट में 50 / उनके संबंधित कुओं splenocytes की अच्छी तरह से μl के बराबर कोशिकाओं जोड़ें. अपकेंद्रित्र5 मिनट के लिए 12,000 आरपीएम (250-300 XG) पर थाली.
  3. माउस बी.डी. एफसी (चूहा विरोधी माउस CD16/32 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी) ब्लॉक 3% एस.एम. में 1.5 मिलीग्राम बर्फ पर microcentrifuge ट्यूब में, पतला के मास्टर मिक्स (एम एम) तैयार है. एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, 50 μl की अंतिम मात्रा के लिए 3% एस.एम. में 1 μg एफसी ब्लॉक का उपयोग करने के लिए, प्रति अच्छी तरह से.
  4. जल्दी से inverting के प्लेट से 96 अच्छी तरह से वी के नीचे प्लेट की हर अच्छी तरह से ध्यान से सतह पर तैरनेवाला अधिक हटाने और वापस बर्बादी या सेल छर्रों का विघटन के बिना कंटेनर सिंक पर.
  5. भंवर, संक्षेप में 5 सेकंड के लिए एफसी ब्लॉक एम.एम. अपकेंद्रित्र और 96 अच्छी तरह से वी के नीचे प्लेट में सभी छर्रों को 50 μl जोड़ने. धीरे से ऊपर pipetting और नीचे, उनके कुओं में छोड़ने के नमूने अच्छी तरह से मिलाएं. अंधेरे में 15 मिनट के लिए बर्फ पर थाली सेते हैं. 12,000 आरपीएम (250-300 XG) में 5 मिनट के लिए थाली अपकेंद्रित्र.
  6. बर्फ पर एक 1.5ml microcentrifuge ट्यूब में 3% एस.एम. में fluorochrome संयुग्मित पतला एंटीबॉडी के मास्टर मिक्स (एम एम) की तैयारी, जबकि नमूने एफसी ब्लॉक के साथ सेते हैं. एंटीबॉडी titrated किया जाना चाहिएधुंधला प्रक्रियाओं के लिए इष्टतम dilutions के निर्धारण करते हैं. एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, 3% एस.एम. में 50 μl की अंतिम मात्रा के लिए मैक-1-FITC 1:25 कमजोर पड़ने और जीआर-1-APC 1:20 कमजोर पड़ने, गठबंधन अच्छी तरह से नमूना प्रति.
  7. 96 वी के नीचे के प्रत्येक अच्छी तरह से ध्यान से सतह पर तैरनेवाला को हटाने के रूप में पहले से वर्णित है.
  8. भंवर, 5 सेकंड के लिए संक्षिप्त फ्लोरोसेंट संयुग्मित धुंधला एंटीबॉडी के एम.एम. अपकेंद्रित्र और नियंत्रण और प्रयोगात्मक छर्रों 50 μl जोड़ने. धीरे से ऊपर pipetting और नीचे अच्छी तरह से मिलाएं. एकल दाग मुआवजा के लिए, 3% एस.एम. में अच्छी तरह से प्रति 50 μl के अंतिम मात्रा के लिए मैक-1-FITC 1:25 कमजोर पड़ने, जीआर-1-APC और 75 एनजी / DAPI की मिलीलीटर 1:20 कमजोर पड़ने, जोड़ने उनके संबंधित कुओं के लिए. 50 μl 3% एस.एम. जोड़ें अच्छी तरह से बेदाग नहीं दाग. मिश्रण अच्छी तरह से और 96 में अच्छी तरह से बर्फ पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए वि नीचे थाली में कोशिकाओं को सेते हैं.
  9. लेबल FACS ट्यूब (5 मिलीग्राम, 12 मिमी x 75 मिमी polystyrene दौर नीचे ट्यूब) 96 वी नीचे अच्छी तरह से थाली में एक अच्छी तरह के अनुरूप. प्रत्येक FACS 200 μl 3% एस.एम. जोड़ेंट्यूब.
  10. 12,000 आरपीएम (250-300 XG) में थाली और 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र supernatants हटाने के. 100 μl 3% प्रत्येक गोली एस.एम. जोड़कर छर्रों धो और धीरे से ऊपर pipetting और नीचे मिश्रण अच्छी तरह से. 12,000 आरपीएम (250-300 XG) में 5 मिनट के लिए थाली अपकेंद्रित्र. धो एक बार और अधिक कदम दोहराएँ.
  11. 96 वी के नीचे के प्रत्येक अच्छी तरह से ध्यान से सतह पर तैरनेवाला को हटाने के रूप में पहले से वर्णित है. 100 μl 3% एस.एम. में प्रत्येक गोली Resuspend और मिश्रण अच्छी तरह से.
  12. 96 अच्छी तरह से वी के नीचे प्लेट की हर अच्छी तरह से 100 μl resuspended गोली उनके क्रमशः लेबल FACS ट्यूब पर स्थानांतरण.
  13. पहले प्रवाह cytometry विश्लेषण, 75 एनजी / एमएल DAPI को नियंत्रित करने के लिए और प्रयोगात्मक नमूने और DAPI एक दाग मुआवजा नियंत्रण जोड़ें.
  14. MDSC प्रतिशत के प्रवाह cytometric डेटा अधिग्रहण प्रदर्शन करते हैं. (कोई दाग नियंत्रण) नकारात्मक और एक सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग कर मुआवजा प्रदर्शन करते हैं. इतना है कि एक डॉट साजिश है कि लॉग पैमाने में (FSC) आगे बनाम ओर तितर बितर (एसएससी) को प्रदर्शित करता है सेट के ल्युकोसैट आबादीब्याज पहचाना जा सकता है. मलबे और सबसे कम आगे और पक्ष बिखराव के साथ clumps को छोड़कर सभी leukocytes पर एक बड़े गेट, ड्रा. यह माता पिता के गेट से एक नई डॉट साजिश है कि DAPI कोशिकाओं (जी) पर प्रदर्शित करता है एसएससी बनाम DAPI और फाटक बनाने. इस नए gated आबादी के चयन और एक डॉट साजिश है कि अपने डबल सकारात्मक पर मैक 1 बनाम जीआर-1 और फाटक प्रदर्शित करता है (मैक-1 + जीआर-1 +) MDSC.

4. जीआर-1 + leukocytes के चुंबकीय संवर्धन

  1. अशेष भाजक 1x10 7 FACS उचित लेबल 5 मिनट के लिए 12,000 आरपीएम (XG 250-300) और ट्यूबों अपकेंद्रित्र में शेष अस्थिर leukocytes.
  2. जीआर-1-पीई एंटीबॉडी की एक 1.5 मिलीग्राम microcentrifuge ट्यूब में एम.एम. तैयार करते हैं. 10 7 कोशिकाओं के लिए, 50 μl एमबी नमूना प्रति जीआर-1-पीई प्रतिरक्षी 1:10 कमजोर पड़ने का उपयोग करें. अधिक से अधिक सेल नंबर के लिए, तदनुसार संस्करणों के ऊपर पैमाने पर. संक्षेप में 5 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र, FACS ट्यूबों में leukocytes को जोड़ने और 15 मिनट में 4 ° अंधेरे में सी के लिए सेते हैं. FACS ट्यूबों, अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 12,000 आरपीएम (XG 250-300) में 2 एमबी की मिलीलीटर जोड़ें सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  3. 1.5 मिलीग्राम microcentrifuge ट्यूब में विरोधी पीई microbeads के एम.एम. तैयार. 10 7 कोशिकाओं के लिए, 200 μl एमबी नमूना प्रति विरोधी पीई microbeads 01:04 कमजोर पड़ने का उपयोग करें. अधिक से अधिक सेल नंबर के लिए, तदनुसार संस्करणों के ऊपर पैमाने पर. संक्षेप में 5 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र, FACS ट्यूबों में leukocytes को जोड़ने और 15 मिनट में 4 ° अंधेरे में सी के लिए सेते हैं.
  4. FACS ट्यूबों, अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 12,000 आरपीएम (XG 250-300) में 2 एमबी की मिलीलीटर जोड़ें सतह पर तैरनेवाला त्यागने. गोली 3 एस.बी. की मिलीलीटर में resuspend. एक नया लेबल 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब में एक 70 माइक्रोन झरनी के माध्यम से फ़िल्टर करें.
  5. तैयार है और प्रधानमंत्री ऑटो एमएसीएस प्रो विभाजक. फिर से भरना उचित समाधान और खाली बेकार की बोतल के साथ सभी बोतलों यदि आवश्यक हुआ तो. साधन पर बारी और द्रव कंटेनर और आरंभीकरण के बाद स्तंभ (ओं) की स्थिति की जांच. सभी प्रतीकों हरे रंग होना चाहिए. मेनू पर, ऊपरी से "पृथक्करण" का चयन करेंमेनू बार के बाद "अब धो कम मेनू पट्टी से. "पॉप - अप विकल्प" भागो "लिए भड़काना प्रक्रिया शुरू के बाद से कुल्ला" चुनें. एक बार भड़काना प्रक्रिया को सफलतापूर्वक पूरा हो गया है, साधन तो प्रदर्शित है कि यह "पृथक्करण के लिए तैयार" स्थिति मेनू के तहत.
  6. पंक्ति बी में नकारात्मक अंश संग्रह और पंक्ति सी में सकारात्मक अंश संग्रह के लिए 15 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब के लिए चुंबकीय लेबल, 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब पंक्ति में कोशिकाओं के साथ उपयुक्त ट्यूब के आकार और स्थान के लिए ठंडा ट्यूब रैक 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब चुनें
  7. "POSSEL_S" लेबल लक्ष्य कोशिकाओं के नमूने से संवेदनशील मोड में सकारात्मक चयन के लिए सेल जुदाई कार्यक्रम के चुनें. चुंबकीय लेबल लक्ष्य कोशिकाओं automats स्तंभ पर बनाए रखा जाता है, unlabeled कोशिकाओं नकारात्मक अंश संग्रह ट्यूब में चुंबक की स्वचालित त्याग पंक्ति बी में जारी कर रहे हैं, लेबल लक्ष्य कोशिकाओं ट्यूब की पंक्ति सी में सकारात्मक संग्रह ट्यूब में जारी किया जाएगा रैक.

+ समृद्ध leukocytes के विश्लेषण के बाद क्रमबद्ध करें

  1. जीआर - 1 ब्योरा और जीआर 1 - भिन्न trypan नीले और एक hemacytometer का उपयोग कर. 3% धुंधला मध्यम में वांछित एकाग्रता resuspend कोशिकाओं को इतना है कि 50 μl 5x10 5 - 1x10 6 कोशिकाओं (1x10 7 कोशिकाओं / एमएल - 2x10 7 कोशिकाओं / एमएल) के बराबर है और तदनुसार लेबल FACS ट्यूबों 50 μl हस्तांतरण.
  2. केवल मैक-1 के एक एम.एम. नमूना प्रति 50 μl की एक अंतिम मात्रा के लिए एक 3% एस.एम. में 1:25 कमजोर पड़ने पर, तैयार हो जाओ. कोशिकाओं दाग और जीआर पीई, मैक-1 FITC और DAPI एक दाग मुआवजा प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए तैयार हैं. 200 μl 3% एस.एम. और DAPI व्यवहार्यता डाई के रूप में पहले वर्णित जोड़ें.
  3. प्रवाह cytometric डेटा अधिग्रहण प्रदर्शन करने के लिए + और ​​जीआर-1 जीआर-1 निर्धारित प्रतिशत और भी MDSC प्रतिशत पूर्व और बाद autoMACS के संवर्धन की तुलना.

6. प्रतिनिधि परिणाम

यहाँ हम आर दिखाने के जीआर-1 + जमा MDSC (चित्र 1) की छंटाई के बाद FACS के लिए, भोले spleens से leukocytes के autoMACS संवर्धन के लिए epresentative परिणाम है. 1x10 6 भोले leukocytes मैक-1-FITC और जीआर-1-APC एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे करने के लिए MDSC प्रतिशत एक बी.डी. LSRII साधन का उपयोग पहले autoMACS छँटाई करने के लिए, पहचान. 1x10 7 भोले leukocytes तो विरोधी जीआर-1-पीई जीआर - 1 + एक autoMACS प्रो विभाजक का उपयोग leukocytes के संवर्धन के लिए और एंटीबॉडी पीई microbeads के साथ दाग रहे थे. पोस्ट autoMACS संवर्धन, जीआर-1 जीआर-1 प्रतिशत और जीआर 1 एकत्र भिन्न प्रवाह cytometry का उपयोग मूल्यांकन किया गया. 1x10 6 जीआर - 1 + leukocytes हटा दिया गया और मैक-1-FITC एंटीबॉडी का विश्लेषण करने के लिए और समृद्ध MDSC प्रतिशत, गैर समृद्ध, प्रवाह cytometry द्वारा में leukocytes जमा ट्यूमर असर भोले leukocytes जमा की तुलना के साथ दाग है.

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चित्रा 1 भोले जीआर-1 MDSC छंटनी FACS के लिए leukocytes की AutoMACS संवर्धन. Spleens अग्नाशयी ट्यूमर असर और भोले चूहों से काटा गया और एकल कोशिका निलंबन में संसाधित. भोले leukocytes सतह के प्रवाह cytometry विश्लेषण मैक-1 और जीआर-1 फ्लोरोसेंट संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ दाग पूर्व autoMACS संवर्धन (ए),. प्रवाह cytometry विश्लेषण जीआर - 1 + (बी) और जीआर-1 - जीआर जमा भोले जीआर-1-पीई एंटीबॉडी और विरोधी पीई microbeads साथ दाग leuckocytes से 1 + कोशिकाओं (सी) भिन्न बाद autoMACS संवर्धन. MDSC और जीआर-1 के प्रवाह cytometry विश्लेषण जीआर - 1 + प्रतिशत संवर्धन के बाद autoMACS ट्यूमर असर चूहों (ई) से गैर समृद्ध जमा leukocytes (भोले चूहों, n = 5 की तुलना में जमा भोले leukocytes (डी) से कोशिकाओं. , ट्यूमर असर चूहों, n = 3). MDSC और जीआर-1 प्रतिशत प्रतिनिधि समोच्च भूखंडों और हिस्टोग्राम में gated हैं.

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Discussion

यह प्रसंस्करण और immunophentyping MDSC आबादी है कि विभिन्न पशु मॉडल से अलग lymphoid ऊतकों को लागू करने के लिए एक विस्तृत विधि है. विशेष रूप में, autoMACS संवर्धन 4 splenocytes की जीआर-1 कमी, माइलॉयड सबसेट की splenocytes और लिम्फ नोड्स 5 से शुद्धि, अस्थि मज्जा 14 neutrophils की सीडी 8 की अलगाव और शुद्धि + तिल्ली से टी कोशिकाओं सहित विभिन्न ल्युकोसैट आबादी के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और 15 लिम्फ नोड्स. ब्याज की सेल की आबादी के बावजूद, वांछित lymphoid ऊतकों से leukocytes की एकल कोशिका निलंबन पैदा करने के इष्टतम सतह धुंधला, प्रवाह cytometry विश्लेषण, autoMACS संवर्धन और FACS छँटाई के लिए आवश्यक है. इस प्रोटोकॉल में, हम यांत्रिक हदबंदी leukocytes के एक एकल कोशिका निलंबन बनाने का इस्तेमाल किया. हालांकि, Collagenase डी के रूप में एंजाइम पाचन का उपयोग भी इस प्रोटोकॉल को बढ़ाने के लिए एक पर्याप्त विकल्प हैspleens या अन्य lymphoid अंगों 5 से leukocytes की उपज.

प्रवाह cytometry immunophenotyping leukocytes के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है. इसलिए, प्रवाह cytometry और संवर्धन के लिए पर्याप्त तैयारी भी सेल निलंबन और एंटीबॉडी अभिकर्मकों के कमजोर पड़ने के लिए उपयुक्त buffers के उपयोग की आवश्यकता है. कई धुंधला मीडिया और एमएसीएस बफर तैयार करने के लिए FBS और BSA के बीच वैकल्पिक प्रोटोकॉल. हालांकि, इन अभिकर्मकों भी eBioscience, से बी.डी. Pharmingen और Miltenyi बायोटेक जैसे कंपनियों से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. Miltenyi बायोटेक और eBioscience समझाया, दोनों BSA और FBS गैर विशिष्ट बंधन को रोकने जब fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ धुंधला leukocytes. इससे भी महत्वपूर्ण बात, इन पशुओं के सीरम प्रोटीन के कम प्रतिशत व्यवहार्यता बनाए रखने और 16 ल्यूकोसाइट्स के रोकने. हालांकि, हमारे अनुभव से, बीएसए FBS से इष्टतम और autoMACS संवर्धन के लिए बेहतर संकल्प धुंधला के लिए बेहतर काम करता है और सिफारिशों हैवर्णित प्रोटोकॉल में Ded है.

इस प्रोटोकॉल में, हम murine MDSC का उपयोग CD11b FITC और जीआर-1-APC फ्लोरोसेंट संयुग्मित एंटीबॉडी और प्रवाह cytometry की विशेषता. इन एंटीबॉडी पहले टाइट्रेट उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति धुंधला को कम करने के लिए गैर इष्टतम परिणामों को रोकने के लिए उपयोग करने के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, जब बहुरंगा प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए एंटीबॉडी का चयन संभव वर्णक्रमीय ओवरलैप fluorochromes की भी एक और महत्वपूर्ण माना जा 17,18 कारक है. इसलिए, मुआवजा ब्याज या मुआवजा मोती के प्रत्येक प्रतिरक्षी लिए fluorochome संयुग्मित एकल रंग के धब्बे के रूप में नियंत्रित करता है, वर्णक्रमीय 18 ओवरलैप के मुद्दों के लिए सही कर सकते हैं. सटीक प्रवाह cytometry परिणामों के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण विचार व्यवहार्यता रंगों का उपयोग है. मृत कोशिकाओं को गैर विशेष रूप से एंटीबॉडी के लिए बाध्य कर सकते हैं, इस प्रकार 19 झूठी सकारात्मक परिणाम बनाने के. इस प्रोटोकॉल में, हम एक व्यवहार्यता के लिए डाई के रूप में न्यूक्लिक दाग एसिड, DAPI का उपयोगहमारे विश्लेषण से मृत कोशिकाओं को बाहर के रूप में यह सबसे अच्छा fluorochrome संयुग्मित की न्यूनतम वर्णक्रमीय ओवरलैप के साथ इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के पैनल पूरक. हालांकि, 7 - Aminoactinomycin (7 AAD) और propidium आयोडाइड PI () के रूप में अन्य व्यवहार्यता रंगों को वर्णित धुंधला इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के पैनल के आधार पर तरीकों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. वर्तमान में, वहाँ भी फिक्स मृत सेल उपलब्ध दाग कि दाग कोशिकाओं को निर्धारित किया जा करने के लिए और व्यवहार्यता (Invitrogen) भेदभाव की क्षमता खोने के बिना permeabilized की अनुमति के एक नंबर रहे हैं. कुल मिलाकर, अन्य धुंधला तकनीक भी सटीक प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण हैं. उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में, 96 अच्छी तरह से वि नीचे प्लेटों के उपयोग के कोशिकाओं और MDSC और ल्युकोसैट प्रवाह cytometry का उपयोग प्रतिशत के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा अभिकर्मकों की छोटी, केंद्रित संस्करणों के लिए अनुमति देता है. मास्टर मिक्स (एम एम) के उपयोग के दृष्टिकोण भी छोटे संस्करणों में leukocytes के बराबर immunofluorescence लेबलिंग के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक का उपयोग कर या तो 96 अच्छी तरह से वि नीचे plates या FACS ट्यूब. इन तकनीकों में नमूने के पार संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए, बनाए रखने के बाँझ एंटीबॉडी और इस्तेमाल किया अभिकर्मकों और एंटीबॉडी की मात्रा को कम.

autoMACS प्रो विभाजक सेल आबादी से कई नमूने के कुशल और स्वचालित किसी भी प्रजाति में, अलगाव के लिए अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल में, जीआर-1-पीई एंटीबॉडी और चुंबकीय पीई microbeads का उपयोग leukocytes के अप्रत्यक्ष चुंबकीय लेबलिंग जीआर - 1 + leukocytes के autoMACS संवर्धन के लिए प्रयोग किया जाता है. यह प्रक्रिया अन्य fluorochrome - संयुग्मित biotinylated,, और unconjugated प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए विभिन्न सेल 20 आबादी के संवर्धन के लिए microbeads का उपयोग autoMACS जुदाई के लिए संशोधित किया जा सकता है. हालांकि, इस प्रक्रिया में, हम अत्यधिक पीई संयुग्मित एंटीबॉडी और विरोधी पीई microbeads के रूप में उदाहरण के लिए FITC के लिए विरोध का उपयोग करने की सलाह देते हैं, के रूप में पीई अणु कई बाध्यकारी साइटों के लिए कहा जाता है, इस तरह मजबूत और बेहतर चुंबकीय लेबलिंग (Miltenyi बायोटेक में जिसके परिणामस्वरूप ). एक और पीइस प्रोटोकॉल के लिए ossible संशोधन प्रत्यक्ष चुंबकीय लेबलिंग के उपयोग के रूप में वहाँ मानव, माउस, और चूहा leukocytes (Miltenyi बायोटेक) के अलगाव के लिए एक एमएसीएस microbeads की एक विस्तृत विविधता हैं. हालांकि, अप्रत्यक्ष चुंबकीय fluorochrome संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग लेबलिंग के अतिरिक्त धुंधला के लिए की आवश्यकता के बिना समृद्ध या समाप्त ल्युकोसैट भिन्न प्रवाह cytometry के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है. वहाँ भी एमएसीएस उपलब्ध विभाजक लेकिन autoMACS प्रो सेपरेटर सिस्टम फायदेमंद है क्योंकि यह अप करने के लिए उच्च गति, स्वचालित पुस्तिका एमएसीएस विभाजक की तुलना में अत्यधिक व्यवहार्य leukocytes की कोमल चयन के लिए छह नमूने के छँटाई, के लिए अनुमति देता है की एक किस्म है. हालांकि, मैनुअल एमएसीएस विभाजक autoMACS प्रो विभाजक के लिए उपयुक्त विकल्प हैं, यदि उपलब्ध है. आगे भोले जीआर-1 + leukocytes, इस प्रोटोकॉल के लिए एक संभावित संशोधन को समृद्ध करने के लिए सकारात्मक एकत्र autoMACS प्रो विभाजक पर एक नया autoMACS स्तंभ का उपयोग कर अंश को फिर से चलाने के लिए होगा. समृद्धिइस प्रोटोकॉल में जीआर - 1 + ट्यूमर असर leukocytes autoMACS प्रो विभाजक का उपयोग जीआर-1 भिन्न की वसूली में महत्वपूर्ण कमी में इस परिणाम के बाद से नहीं की सिफारिश की है के रूप में इन कोशिकाओं की तुलना में भोले leukocytes के संवर्धन के दौरान कॉलम के लिए छड़ी करते हैं . इसलिए, यह प्रोटोकॉल बाद व्यवहार्य MDSC की छँटाई FACS के लिए दृढ़ता से ट्यूमर असर leukocytes पूलिंग की सिफारिश की है.

प्री - समृद्ध, भोले के leukocytes जमा और जमा ट्यूमर असर leukocytes MDSC आबादी के अलगाव के लिए कम गति छँटाई FACS के रूप में भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से थकाऊ और समय पर भोले चूहों, जो MDSC की काफी कम प्रतिशत के कारण से MDSC की छँटाई FACS को दरकिनार करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. जीआर-1 भोले चूहों से leukocytes के AutoMACS संवर्धन तो शीघ्र, सुविधाजनक और कुशल vivo में उनके उपयोग के लिए व्यवहार्य और कार्यात्मक MDSC की छँटाई FACS के लिए अनुमति देता है औरइन विट्रो प्रयोगों में. नीच के रूप में व्यक्त भोले MDSC सेल आबादी की सीधी छँटाई लंबा तरह, उच्च लागत और कम सेल वसूली और व्यवहार्यता के साथ एक बहुत अक्षम प्रक्रिया है. और भोले चूहों से जीआर - 1 + leukocytes की autoMACS संवर्धन तैयार लगभग 45 मिनट और MDSC प्रतिशत 4 गुना (चित्रा 1) की तुलना में अधिक बढ़ जाती है लेता है. यह संवर्धन गैर समृद्ध leukocytes के लिए लगभग 12 घंटे से जमा भोले leukocytes से 1x10 कम से कम 6 व्यवहार्य, समृद्ध MDSC के अलगाव के लिए लगभग 20-30 मिनट के लिए छँटाई FACS के समय कम कर देता है. ट्यूमर असर चूहों से हालांकि, FACS, गैर समृद्ध से व्यवहार्य MDSC की छँटाई जमा leukocytes कम ट्यूमर बोझ के जवाब में एक MDSC प्रतिशत की वृद्धि की बहुतायत के कारण समय की आवश्यकता होगी. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि हल MDSC और अन्य leukocytes तब ऐसे मिश्रित ल्युकोसैट प्रतिक्रियाओं (एम एल आर) के रूप में दोनों कार्यात्मक assays में इस्तेमाल किया जा सकता है vivo प्रयोगों में 21 के रूप में 22 qRT - पीसीआर, वेस्टर्न ब्लाट 23 और cytospin / 14 माइक्रोस्कोपी विश्लेषण सहित गैर कार्यात्मक assays के रूप में अच्छी तरह से. कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल immunophenotyping और lymphoid चूहे, चूहे और मनुष्य से या परिधीय रक्त ऊतकों से immunosuppressive और अन्य leukocytes के ढेर में और vivo में इन विट्रो assays में इस्तेमाल किया जा के संवर्धन के लिए संशोधित किया जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

हम USF के फ्लो Cytometry कोर सुविधा स्वीकार करते हैं. हम संसाधनों को साझा करने के लिए डॉ. डेनिस कूपर धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी उनकी सहायता के लिए स्थापित है और इस वीडियो की शूटिंग में माया कोहेन, लौरा Pendleton और डायना Latour का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. एनएन NSF के FG LSAMP ब्रिज से डॉक्टरेट फैलोशिप 0929435 मानव संसाधन विकास के लिए समर्थित है. इस काम अमेरिकन कैंसर सोसायटी संस्थागत अनुसंधान अनुदान # 93-032-13/Moffitt कैंसर टीजी के लिए सम्मानित किया गया केंद्र द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific Hyclone SH30028.02 Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906 Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific Hyclone SV3001403HI Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) BD Biosciences 553142 Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC eBioscience 11-0112 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC eBioscience 17-5931 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE eBioscience 12-5931 Sterile Environment
DAPI Invitrogen D1306 Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve Sigma-Aldrich CD1-1KT Autoclave before use
70-μm strainer BD Biosciences 352350 Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4333-57 Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes Fisher Scientific 08-757-12 Sterile Environment
50ml conical tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. 339652 Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes BD Biosciences 352054 Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates Corning 3897 Sterile Environment
Trypan Blue Cellgro 25-900-CI Sterile Environment
PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801 Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
AutoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101
AutoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221

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References

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Comments

2 Comments

  1. very good

    Reply
    Posted by: jin f.
    July 1, 2012 - 10:01 AM
  2. excellent

    Reply
    Posted by: Somayeh A.
    January 24, 2014 - 10:22 AM

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