Preparação de Mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) de ingênuos e pâncreas Tumor-rolamento Ratos utilizando citometria de fluxo e separação de células automatizado magnético ativado (AutoMACS)

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Este é um método rápido e abrangente de imunofenotipagem mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) e enriquecendo Gr-1

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nelson, N., Szekeres, K., Cooper, D., Ghansah, T. Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS). J. Vis. Exp. (64), e3875, doi:10.3791/3875 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

MDSC são uma população heterogénea de macrófagos, células dendríticas imaturas e granulócitos que se acumulam nos órgãos linfóides em condições patológicas, incluindo infecção por parasitas, inflamação, stress traumático, enxerto-versus-hospedeiro da doença, a diabetes eo cancro 1-7. Em ratinhos, MDSC expressa Mac-1 (CD11b) e Gr-1 (Ly6G e Ly6C) antigénios de superfície 7. É importante notar que MDSC são bem estudada em vários hospedeiros portadores de tumor, onde são significativamente expandidas e suprimir anti-tumorais respostas imunes homólogos em comparação com naive 7-10. No entanto, dependendo do estado patológico, existem diferentes subpopulações de MDSC com mecanismos distintos e alvos de supressão 11,12. Assim, os métodos eficazes para isolar populações viáveis ​​MDSC são importantes na elucidação suas diferentes mecanismos moleculares de supressão in vitro e in vivo.

Recentemente, o Ghansah grupo relatou a expansão do MDSC num modelo murino de pâncreas cancro. O nosso portadores de tumor MDSC exibir uma perda de homeostase e aumento da função supressora em comparação com MDSC ingénuos 13. Percentagens MDSC são significativamente menos nos compartimentos linfóides de camundongos normais vs tumor-rolamento. Esta é uma ressalva importante, que muitas vezes dificulta precisas análises comparativas destes MDSC. Portanto, enriquecendo Gr-1 + leucócitos de camundongos ingênuos antes de separação de células activadas por fluorescência (FACS) fortalece a viabilidade, pureza e reduz significativamente o tempo de classificação. Todavia, o enriquecimento de Gr-1 + leucócitos de camundongos portadores de tumor é opcional uma vez que estes estão em abundância para FACS rápidas de classificação. Portanto, neste protocolo, nós descrevemos um método altamente eficiente de imunofenotipagem MDSC e enriquecendo Gr-1 + leucócitos de baços de camundongos normais para classificar MDSC em tempo hábil. Camundongos imunocompetentes C57BL / 6 são inoculadas com murino Panc02 cells subcutânea enquanto camundongos ingênuos receber 1XPBS. Aproximadamente 30 dias após a inoculação; baços são removidos e processados ​​em suspensões de célula única, utilizando uma célula de dissociação peneira. Os esplenócitos são então glóbulo vermelho (RBC) lisadas e uma alíquota destes leucócitos são coradas usando fluorocromo-anticorpos contra Mac-1 e Gr-1 a percentagens imunofenotipo MDSC utilizando citometria de fluxo. Numa experiência paralela, os leucócitos inteiras a partir de ratinhos naive são coradas com fluorescência conjugados Gr-1, incubados com anticorpos PE-micropérolas e positivamente seleccionadas utilizando uma separação de células automatizado Magnética Activado (autoMACS) Pro Separator. Em seguida, uma alíquota de Gr-1 + leucócitos são coradas com Mac-1 anticorpos para identificar o aumento em percentagem MDSC utilizando citometria de fluxo. Agora, estas GR1 leucócitos + enriquecidos estão prontos para a selecção de FACS MDSC para ser usado em análises comparativas (ingénuo vs portadores de tumor) em in vivo e in vitro

Protocol

Antes da partida, preparar as seguintes soluções:

3% de coloração Media (SM):

-3% De soro fetal bovino (FBS) em 1X tampão fosfato salino (PBS)

MACS buffer (MB):

- 0,5% de albumina de Soro Bovino (BSA) em 1XPBS

1. Os baços de colheita de Ratos

  1. Por via subcutânea injectar 6-8 semanas de idade C57BL / 6 machos (Harlan) com 1,5 x 10 5 murinos Panc02 células em suspensão em 100 uL de PBS 1x (tumor de rolamento; TB). Camundongos controle (Naïve) recebem 100 1XPBS ul.
  2. Cerca de 4 semanas pós-injeção, eutanásia ratos por asfixia dióxido de carbono.
  3. Colheita baços de camundongos por dissecção romba com pinça e tesoura, em seguida, pesar com uma balança. Baços Coloque em separado, chamado tubos de 50 ml cônicos contendo 1 x PBS.

2. Gerar um suspensio de uma única célulan de leucócitos de baços

Todos os procedimentos devem ser realizadas em um ambiente estéril sob uma capa de segurança biológica e as células e os anticorpos mantidos em gelo.

  1. Montar a célula de dissociação peneira, inserindo a tela de malha para dentro da abertura da taça para o fundo. Em seguida, insira o anel de retenção para a área de rosca com o lado da fenda e usar o anel de chave para apertar o anel de retenção, mantendo desta forma a tela no lugar. Coloque a peneira montado numa placa de Petri contendo 10 ml de 1 x PBS.
  2. Baços de piscina e pilão de vidro utilização para moer baços contra a tela de malha de célula de dissociação peneira e para dentro da placa de Petri. Repetir para cada grupo de tratamento de ratinhos.
  3. Suspensão de células de filtro para um tubo cónico de 50 ml usando um filtro de 70 pm e uma célula pipeta de 5 ml serológico. Centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
  4. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 5 1 x ml de tampão de lise dos glóbulos vermelhos por baço. Pipetar cima e para baixo vigorosamente. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Parar a reacção por adição de 20 ml de 1 x PBS. Pipetar cima e para baixo vigorosamente. Centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
  5. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 20 ml estéril 1 x PBS. Pipetar cima e para baixo vigorosamente.
  6. Contar as células utilizando azul de tripano e um hemacitómetro e ressuspender em concentração desejada em SM 3% de modo a que 50 uL é equivalente a 5x10 5-1x10 6 células (1x10 7 células / ml - 2x10 7 células / ml).

3. Superfície celular de coloração / Imunofenotipagem de MDSC por citometria de fluxo

  1. Rotular os poços de uma placa de fundo 96-V bem para o controlo e as amostras experimentais e manchas únicas para os controlos de compensação (nenhuma mancha, NS; Mac-1-FITC; Gr-1-APC e DAPI).
  2. Adicionar 5x10 5-1x10 6 células equivalentes a 50 uL / poço de esplenócitos para os seus respectivos poços na placa de 96 poços de fundo em V. Centrifugarem placas a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
  3. Preparar "Mix Master" (MM) do rato BD Fc Block (Rat anti-rato CD16/32 anticorpo monoclonal) diluída em SM 3%, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml em gelo. Como ponto de partida, usar 1 ug Bloco Fc em SM 3% para um volume final de 50 ul, por poço.
  4. Cuidadosamente remover o sobrenadante de cada poço da placa de 96 poços de fundo em V por rapidamente invertendo a placa sobre e para trás, ao longo de um recipiente de resíduos ou pia sem interrupção dos peletes celulares.
  5. Vortex, brevemente centrifugar Fc MM Bloco durante 5 segundos e adicionar 50 uL a todos os peletes na placa de 96 poços de fundo em V. Misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo, deixando amostras em seus poços. Incubar placa durante 15 min no escuro em gelo. Centrifugar em placas a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
  6. Preparar "Mix Master" (MM) de fluorocromo-anticorpos diluídos em SM 3% em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml em gelo, enquanto as amostras incubar com o Bloco Fc. Anticorpos deve ser tituladapara determinar diluições óptimas para a coloração de procedimentos. Como ponto de partida, combinar uma diluição 1:25 do Mac-1-FITC e diluição 1:20 de Gr-1-APC em SM 3% para um volume final de 50 ul, por poço de amostra.
  7. Cuidadosamente remover o sobrenadante de cada poço da 96-V bem inferior como descrito anteriormente.
  8. Vortex, brevemente centrifugar MM de anticorpos fluorescente-conjugados de coloração durante 5 segundos e adicionar 50 uL de controlo e de peletes experimentais. Misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo. Para uma única mancha compensações, adicionar uma diluição 1:25 do Mac-1-FITC, diluição 1:20 de Gr-1-APC e 75 ng / ml de DAPI, em SM 3% para um volume final de 50 uL por poço para os seus respectivos poços. Adicionar 50 ul SM 3% a imaculada bem (não mancha). Misturar bem e incubar as células na placa de 96 poços de fundo em V durante 30 min no escuro em gelo.
  9. Tubos de etiquetas FACS (5 ml, 12 mm x 75 mm de poliestireno tubos de fundo redondo) para corresponder a cada poço na placa de 96 poços de fundo em V. Adicionar 200 uL SM 3% a cada um FACStubo.
  10. Centrifugar em placas a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min e remover os sobrenadantes. Lave pelotas pela adição de 100 ul SM 3% a cada pellet e misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo. Centrifugar em placas a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min. Repita o passo de lavagem mais uma vez.
  11. Cuidadosamente remover o sobrenadante de cada poço da 96-V bem inferior como descrito anteriormente. Ressuspender cada sedimento em 100 SM ul 3% e misture bem.
  12. Transferir 100 uL sedimento ressuspenso a partir de cada poço da placa de 96 poços de fundo em V à sua tubo FACS respectivamente rotulado.
  13. Antes da análise de fluxo de citometria, adicionar 75 ng / ml DAPI para controlar e as amostras experimentais e de controlo de compensação DAPI única mancha.
  14. Execute o fluxo de aquisição de dados por citometria de percentagens MDSC. Execute a compensação usando o negativo (nenhum controlo mancha) e os controlos positivos individuais. Configurar um gráfico de pontos que mostra a dispersão frontal (FSC) versus lateral (SSC) em escala logarítmica, para que populações de leucócitos deinteresse pode ser identificada. Desenhe um grande portão em todos os leucócitos, excluindo detritos e aglomerados com menor dispersão para a frente e lateral. A partir deste portão principal, criar um novo gráfico de pontos que exibe SSC contra DAPI e DAPI em porta (ao vivo) células. Seleccionar esta população recém-gated e criar um gráfico de pontos que exibe Mac-1 versus Gr-1 e portão no seu positiva dupla (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC.

4. Enriquecimento magnético de GR-1 + Leucócitos

  1. Alíquotas 1x10 7 restantes leucócitos não coradas em tubos adequadamente marcados FACS e centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min.
  2. Preparar MM de Gr-1-PE anticorpo em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Para até 10 7 células, utilizar uma diluição de 1:10 de Gr-1-PE anticorpo em 50 MB ul, por amostra. Para um maior número de células, aumentar os volumes de acordo. Resumidamente centrifugar durante 5 segundos, adicionar aos leucócitos em tubos de FACS e incubar durante 15 min a 4 ° C no escuro. Adicionar 2 ml de MB para tubos de FACS, centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min e elimine o sobrenadante.
  3. Preparar MM de Anti-PE micropérolas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Para até 10 7 células, utilizar uma diluição de 1:4 de anti-PE micropérolas em 200 MB ul, por amostra. Para um maior número de células, aumentar os volumes de acordo. Resumidamente centrifugar durante 5 segundos, adicionar aos leucócitos em tubos de FACS e incubar durante 15 min a 4 ° C no escuro.
  4. Adicionar 2 ml de MB para tubos de FACS, centrifugar a 12.000 rpm (250-300 xg) durante 5 min e elimine o sobrenadante. Ressuspender o granulado em 3 ml de SB. Filtrar através de uma peneira iM 70 para um novo tubo ml, rotulados 50 cónico.
  5. Prepare-se e prepare Auto MACS Separador Pro. Recarga de todos os frascos com as soluções adequadas e esvaziar o depósito de resíduos, se necessário. Vire instrumento e examinar o status de recipientes de fluido e de coluna (s) após a inicialização. Todos os símbolos devem ser verdes. No menu, selecione "separação" do superiorbarra de menu, seguido de "Lavar Agora" na barra de menu inferior. Selecione "Lavar" a partir da opção pop-up, seguido de "Executar" para iniciar o processo de preparação. Uma vez que o processo de priming é concluída com êxito, o instrumento, então, mostrar que é "Ready for Separation" no menu Status.
  6. Escolha suporte de tubos refrigerados adequado para tamanhos de tubos e coloque 50 ml de tubo cônico com células marcadas magneticamente na linha A, 50 ml tubo cônico de coleta de fração negativa na linha B e 15 ml tubo cônico para a coleta de fração positiva na linha C.
  7. Escolha "POSSEL_S" programa de separação de células para seleção positiva de células alvo marcadas no modo sensível a partir de amostras. Células alvo magneticamente marcadas são retidos na coluna automáticos; células não marcadas são libertados para o tubo de recolha negativo fracção em B. Em linha de retracção automática do magneto, as células alvo marcadas irá ser libertado para o tubo de recolha positiva na linha C do tubo rack.

Leucócitos + enriquecidos

  1. Recontagem Gr-1 + e Gr-1 - frações utilizando Trypan Blue e um hemocitômetro. Ressuspender as células em concentração desejada em meio de coloração com 3% de modo a que 50 uL é equivalente a 5x10 5-1x10 6 células (1x10 7 células / ml - 2x10 7 células / ml) e transferir 50 uL para tubos correspondentemente rotulados FACS.
  2. Prepara-se uma MM de Mac-1 só, a uma diluição 1:25 em SM 3% para um volume final de 50 uL por amostra. Corar as células e preparar individuais compensações mancha de Gr-PE, Mac-1 FITC e DAPI para análise de citometria de fluxo. Adicionar 200 uL SM 3% e DAPI corante de viabilidade, como descrito anteriormente.
  3. Execute o fluxo de aquisição de dados por citometria de determinar Gr-1 + e Gr-1 - Percentagens e também para comparar as proporções MDSC enriquecimento pré-e pós-autoMACS.

6. Os resultados representativos

Aqui nós mostramos r resultados epresentative para autoMACS enriquecimento de Gr-1 + leucócitos a partir do conjunto, baço ingénuas para FACS subsequentes de triagem de MDSC (Figura 1). 1x10 6 leucócitos naive foram coradas com Mac-1-FITC e Gr-1-APC anticorpos para identificar percentagens MDSC usando um instrumento BD LSRII, antes de triagem autoMACS. 1x10 7 leucócitos naive foram então coradas com anti-Gr-1-PE anticorpos e PE-micropérolas para o enriquecimento de Gr-1 + leucócitos utilizando um autoMACS Separator Pro. Pós-autoMACS enriquecimento, Gr-1 percentagens em Gr-1 + e Gr-1 - fracções recolhidas foram avaliados usando citometria de fluxo. 1x10 6 Gr-1 + leucócitos foram removidas e coradas com Mac-1-FITC de anticorpos para avaliar e comparar percentagens MDSC de enriquecido, pooled leucócitos virgens de não enriquecido, reunidas portadores de tumor leucócitos por citometria de fluxo.

fig1.jpg "/>
Figura 1. Enriquecimento AutoMACS de Naïve Gr-1 + leucócitos para FACS MDSC Ordenação. Os baços foram colhidas a partir de ratos portadores de tumor pancreático e ingénuos e transformados em suspensões de célula única. Análise de citometria de fluxo de superfície de leucócitos ingénuo coradas com Mac-1 e Gr-1 fluorescente anticorpos conjugados, antes de autoMACS enriquecimento (A). Análise de citometria de fluxo de Gr-1 + (B) e Gr-1 - (C) As fracções de enriquecimento pós-autoMACS de Gr-1 + células a partir do conjunto leuckocytes naive coradas com Gr-1-PE anticorpos e anti-PE micropérolas. Análise por citometria de fluxo de MDSC e Gr-1 + percentagens enriquecimento pós-autoMACS de Gr-1 + células a partir do conjunto de leucócitos ingênuo (D) em comparação aos não enriquecidos leucócitos obtidos a partir de camundongos portadores de tumor (E) (ratos ingênuos, n = 5 ; camundongos portadores de tumor, n = 3). MDSC e Gr-1 percentagens são fechado nos gráficos de contorno representativas e histogramas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este é um método detalhado para o processamento e immunophentyping populações MDSC que é aplicável a diferentes tecidos linfóides a partir de vários modelos animais. Em particular, o enriquecimento autoMACS pode ser usado para o isolamento de várias populações de leucócitos, incluindo Gr-1 depleção de esplenócitos 4, a purificação de subconjuntos mielóides de esplenócitos e gânglios linfáticos 5, o isolamento dos neutrófilos da medula óssea de 14 e purificação de células T CD8 + de baço e linfonodos 15. Independentemente de a população de células de interesse, gerando uma única célula suspensões de leucócitos a partir dos tecidos linfóides desejados é necessária para a coloração de superfície óptima, a análise de citometria de fluxo, o enriquecimento autoMACS e triagem de FACS. Neste protocolo, utilizou-se mecânica dissociação para criar uma suspensão de células individuais de leucócitos. No entanto, usando digestão enzima tal como a colagenase D é também uma alternativa adequada para este protocolo para aumentaro rendimento de leucócitos a partir de baços ou outros órgãos linfóides 5.

Citometria de fluxo é uma técnica importante para imunofenotipagem de leucócitos. Portanto, uma preparação adequada para a citometria de fluxo e de enriquecimento também requer a utilização de tampões apropriados para suspensão de células e à diluição de reagentes de anticorpo. Muitos protocolos alternam entre FBS e BSA para preparar meios de coloração e tampão MACS. No entanto, estes reagentes estão também comercialmente disponível a partir de empresas como a eBioscience, BD Pharmingen e Biotec Miltenyi. Como explicado por Miltenyi Biotec e eBioscience, tanto BSA e FBS impedir a ligação não específica quando coloração leucócitos com fluorocromo anticorpos conjugados. Mais importante, as percentagens baixas destas proteínas animais de soro manter a viabilidade e evitar aglomeração de leucócitos 16. No entanto, a partir de nossa experiência, BSA funciona melhor para a coloração ideal e melhor resolução para o enriquecimento autoMACS de FBS e é recomended no protocolo descrito.

Neste protocolo, que caracteriza MDSC murino utilizando CD11b-FITC e Gr-1-APC fluorescente anticorpos conjugados e citometria de fluxo. É imperativo para titular estes anticorpos antes da utilização para reduzir a coloração de fundo de fluorescência elevada para evitar que não óptimas resultados. Além disso, quando se escolhe anticorpos para multicolor análise de citometria de fluxo, possíveis sobreposição espectral dos fluorocromos é também um outro factor crítico para ser considerada 17,18. Portanto, a compensação controla na forma de manchas de cor única para cada anticorpo fluorochome conjugado de contas de juros ou de compensação, pode corrigir problemas de sobreposição espectral 18. Outra consideração importante para os resultados de citometria de fluxo precisos é o uso de corantes de viabilidade. As células mortas pode não se ligam especificamente a anticorpos, criando assim resultados falsos positivos 19. Neste protocolo, usamos o ácido nucleico mancha, DAPI como corante de viabilidade paraexcluir as células mortas da nossa análise como o melhor complementa o painel de fluorocromo-anticorpos utilizados com o mínimo de sobreposição espectral. No entanto, corantes de viabilidade, tais como 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) e iodeto de propídio (PI) pode ser utilizado com os métodos de coloração descritos, dependendo do painel de anticorpos utilizados. Actualmente, existem também um número de fixável manchas de células mortas disponíveis que permitem que as células coradas para ser fixadas e permeabilizadas sem perder a capacidade de discriminar viabilidade (Invitrogen). Em geral, técnicas de coloração outros também são importantes para uma análise precisa citometria de fluxo. Por exemplo, neste protocolo, a utilização de 96-poços de fundo V-placas permite pequenas, volumes concentradas de células e reagentes a serem utilizados para a análise das percentagens MDSC e leucócitos utilizando citometria de fluxo. A utilização da mistura principal (MM) abordagem é também uma técnica significativa para imunofluorescência igual de leucócitos em pequenos volumes usando 96-poços de fundo em V plAtes ou tubos FACS. Estas técnicas de reduzir o risco de contaminação cruzada de amostras, manter anticorpos estéreis e reduzir a quantidade de reagentes e os anticorpos utilizados.

O autoMACS Separator Pro permite o isolamento eficiente e automatizada de populações de células a partir de amostras múltiplas, em qualquer espécie. Neste protocolo, a rotulagem magnético indirecta de leucócitos utilizando Gr-1-PE anticorpos e magnético PE micropérolas é utilizado para autoMACS enriquecimento de Gr-1 + leucócitos. Este procedimento pode ser modificada para autoMACS separação usando microesferas de outros fluorocromo-, biotinilados e não conjugada anticorpos primários para o enriquecimento de populações de células diferentes 20. No entanto, neste processo, é altamente recomendável utilizar anticorpos conjugados PE e anti-PE-microesferas em oposição a FITC por exemplo, como a molécula de PE diz-se ter múltiplos locais de ligação, resultando assim em mais forte e uma melhor rotulagem magnética (Miltenyi Biotec ). Outra pmodificação OSSÍVEIS para este protocolo é o uso de rotulagem magnético directa, pois há uma grande variedade de micropérolas MACS para o isolamento de rato, humano e de rato leucócitos (Miltenyi Biotec). No entanto, a rotulagem magnético indirecta utilizando um anticorpo conjugado com fluorocromo primária permite a avaliação de citometria de fluxo de enriquecidos ou empobrecido fracções de leucócitos, sem a necessidade para a coloração adicional. Há também uma variedade de MACS Separadores disponíveis, mas o autoMACS Sistema Separador Pro é vantajoso, pois permite alta velocidade, triagem automatizada de até seis amostras para a seleção suave de leucócitos altamente viáveis, em comparação com separadores manuais MACS. No entanto, Separadores de manuais MACS são alternativas adequadas para o Separador Pro autoMACS, se disponível. Para enriquecer ainda mais ingênuos Gr-1 + leucócitos, uma modificação potencial para este protocolo seria re-executar a fração positiva coletados por meio de uma coluna autoMACS novo no separador autoMACS Pro. Enriquecimentode Gr-1 + portadores de tumor leucócitos utilizando o autoMACS Separator Pro não é recomendado neste protocolo uma vez que esta resulta em redução significativa na recuperação de Gr-1 fracções que estas células tendem a ficar com as colunas durante o enriquecimento em comparação com os leucócitos naive . Portanto, este protocolo recomenda reunir portadores de tumor de leucócitos para FACS subseqüentes ordenação de MDSC viável.

Pré-enriquecido, reunidas leucócitos naive e reunidas portadores de tumor leucócitos pode ser usado para futuras aplicações, tais como baixa velocidade de FACS de classificação para o isolamento de populações MDSC. Este protocolo é projetado especificamente para contornar FACS tediosos e oportuna classificação de MDSC de camundongos ingênuos, o que é devido a percentagens significativamente mais baixos de MDSC. AutoMACS enriquecimento de Gr-1 + leucócitos de camundongos ingênuos permite, então, FACS rápidas, conveniente e eficiente de classificação de MDSC viável e funcional para o seu uso em in vivo eem experiências in vitro. Classificação direta de humildes populações de células expressas como MDSC ingênuo é um processo muito ineficiente, com tempos de classificação longos, altos custos e recuperação de células reduzida e viabilidade. Preparação e autoMACS enriquecimento de Gr-1 + leucócitos a partir de ratinhos naive leva aproximadamente 45 minutos e os aumentos percentuais MDSC maiores do que 4 vezes (Figura 1). Este enriquecimento reduz o tempo de FACS de triagem de aproximadamente 12 horas para não-enriquecidas leucócitos para aproximadamente 20-30 minutos para o isolamento de pelo menos 1x10 6 viável, enriquecido MDSC a partir do conjunto de leucócitos ingénuas. Leucócitos No entanto, a selecção de FACS MDSC viável de não-enriquecido, obtidos a partir de camundongos portadores de tumor vai exigir menos tempo devido a uma maior abundância de percentagens MDSC em resposta a carga tumoral. É importante notar que ordenados leucócitos MDSC e outros podem então ser utilizados em ambos os ensaios funcionais, tais como reacções de leucócitos mistos (MLR) e in vivo experiências de transferência adoptivas 21, bem como em não-funcionais, incluindo ensaios de qRT-PCR 22, Western Blot e 23 cytospin / análises de microscopia 14. Em geral, este protocolo pode ser modificada para imunofenotipagem e enriquecimento de leucócitos e outros imunossupressores de tecidos linfóides ou de sangue periférico a partir de ratinhos, ratos e seres humanos a serem usados ​​em uma pletora de in vivo e in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

Reconhecemos o fluxo USF Facilidade Núcleo Citometria. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Denise Cooper para a partilha de recursos. Gostaríamos também de agradecer a Maya Cohen, Laura Pendleton e Diana Latour por sua assistência na criação e filmagens deste vídeo. NN suportado pela NSF FG-LSAMP Ponte para o Doutorado Fellowship HRD # 0929435. Este trabalho foi financiado pela Sociedade Americana de Câncer Research Grant Institucional # 93-032-13/Moffitt Cancer Center, atribuído ao TG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific Hyclone SH30028.02 Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906 Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific Hyclone SV3001403HI Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) BD Biosciences 553142 Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC eBioscience 11-0112 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC eBioscience 17-5931 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE eBioscience 12-5931 Sterile Environment
DAPI Invitrogen D1306 Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve Sigma-Aldrich CD1-1KT Autoclave before use
70-μm strainer BD Biosciences 352350 Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4333-57 Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes Fisher Scientific 08-757-12 Sterile Environment
50ml conical tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. 339652 Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes BD Biosciences 352054 Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates Corning 3897 Sterile Environment
Trypan Blue Cellgro 25-900-CI Sterile Environment
PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801 Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
AutoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101
AutoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).
  2. Zhu, B. CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).
  3. Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress. J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).
  4. Ghansah, T. Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses. J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).
  5. Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease. J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).
  6. Yin, B. Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models. J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).
  7. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).
  8. Gallina, G. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).
  9. Zhao, F. Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma. Immunology. 128, 141-149 (2009).
  10. Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. Myeloid derived suppressor cells in human diseases. Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).
  11. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  12. Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells. Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).
  13. Pilon-Thomas, S. Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function. PLoS One. 6, (2011).
  14. Panopoulos, A. D. STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils. Blood. 108, 3682-3690 (2006).
  15. Preynat-Seauve, O. Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process. Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).
  16. Davies, D. Cell separations by flow cytometry. Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).
  17. Maecker, H., Trotter, J. Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry. Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).
  18. Bagwell, C. B., Adams, E. G. Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters. Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).
  19. Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
  20. Safarik, I., Safarikova, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).
  21. Collazo, M. M. SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment. Blood. 113, 2934-2944 (2009).
  22. Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures. Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).
  23. Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS One. 4, e5994 (2009).

Comments

2 Comments

  1. very good

    Reply
    Posted by: jin f.
    July 1, 2012 - 10:01 AM
  2. excellent

    Reply
    Posted by: Somayeh A.
    January 24, 2014 - 10:22 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics