डीएनए टुकड़े के पृथक्करण के लिए agarose जेल वैद्युतकणसंचलन

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Summary

Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग डीएनए टुकड़े की जुदाई के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल में वर्णित है.

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Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923, doi:10.3791/3923 (2012).

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Abstract

Protocol

1. जेल के तैयार

  1. एक Erlenmeyer फ्लास्क में agarose की उचित बड़े पैमाने पर तौलना. Agarose जैल ओ / वी प्रतिशत समाधान का उपयोग कर तैयार हैं. agarose की एक जेल में एकाग्रता के डीएनए टुकड़े के आकार पर निर्भर करने के लिए, सबसे अधिक 0.5% -2% के बीच लेकर जैल के साथ अलग किया जा जाएगा. बफर की मात्रा कुप्पी की क्षमता का 1/3 से अधिक नहीं होना चाहिए.
  2. कुप्पी agarose युक्त बफर चल जोड़ें. मिश्रण भंवर. सबसे आम बफ़र्स चल जेल (40 मिमी Tris - एसीटेट, 1 मिमी EDTA) TAE और tbe (45 मिमी Tris - borate, 1 मिमी EDTA).
  3. Agarose / बफर मिश्रण पिगलो. यह सबसे अधिक एक माइक्रोवेव में हीटिंग के द्वारा किया जाता है, लेकिन यह भी एक लेम्प लौ पर किया जा सकता है. 30 के अंतराल पर, कुप्पी और ज़ुल्फ़ सामग्री को अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए हटा दें. दोहराएँ जब तक agarose पूरी तरह से भंग कर दिया है.
  4. 0.5 μg / मिलीग्राम की एकाग्रता के लिए जोड़ें ethidium ब्रोमाइड EtBr (). वैकल्पिक रूप से, जेल भी विद्युत के बाद सना हुआ जा सकता है15-30 मिनट, समय के एक समान लंबाई के लिए बफर चलाने में destaining के बाद के लिए 0.5 μg / मिलीलीटर EtBr युक्त बफर चल में phoresis.

नोट: EtBr एक संदिग्ध कैसरजन है और ठीक से संस्था के नियमों के अनुसार किया जा निपटारा करना चाहिए. दस्ताने हमेशा जब EtBr जैल युक्त संभाल पहना जाना चाहिए. डीएनए की धुंधला के लिए वैकल्पिक रंगों में उपलब्ध हैं, लेकिन EtBr सबसे लोकप्रिय इसकी संवेदनशीलता और लागत के कारण बनी हुई है.

  1. Agarose या तो के benchtop पर या ऊष्मायन द्वारा एक 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. ऐसा करने में विफलता जेल ट्रे ताना होगा.
  2. कास्टिंग तंत्र में जेल ट्रे रखें. वैकल्पिक रूप से, एक भी एक साँचे में ढालना बनाने के लिए एक जेल ट्रे के खुले किनारों टेप सकता है. जेल मोल्ड में एक उपयुक्त कंघी रखें कुओं बनाने के लिए.
  3. जेल मोल्ड में पिघला हुआ agarose डालो. Agarose कमरे के तापमान पर सेट करने के लिए अनुमति देते हैं. कंघी निकालें और जेल बॉक्स में जेल जगह है. वैकल्पिक रूप से, छएल भी प्लास्टिक की चादर में लिपटे जा सकता है और 4 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस तक का उपयोग करें (छवि 1).

2. जेल उपकरण और डीएनए टुकड़े की पृथक्करण की स्थापना

  1. डीएनए नमूनों को डाई लोड हो रहा है (छवि 2) अलग किया जा जोड़ें. जेल लोड हो रहा है आम तौर पर डाई 6X एकाग्रता (0.25% bromphenol नीले, 0.25% xylene cyanol, 30% ग्लिसरॉल) में किया जाता है. लोड हो रहा है डाई करने के लिए ट्रैक कितनी दूर अपने डीएनए नमूने कूच किया है में मदद करता है, और भी नमूना जेल में सिंक करने के लिए अनुमति देता है.
  2. कार्यक्रम वांछित वोल्टेज बिजली की आपूर्ति (बीच 1-5V/cm इलेक्ट्रोड).
  3. जेल की सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त चल रहा है बफर जोड़ें. यह जेल तैयार किया एक के रूप में ही चल रहा है बफर का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  4. बिजली की आपूर्ति करने के लिए जेल बॉक्स का सुराग देते हैं. बिजली की आपूर्ति पर बारी और सत्यापित करें कि दोनों जेल बॉक्स और बिजली की आपूर्ति का काम कर रहे हैं.
  5. ढक्कन हटाएँ. धीरे - धीरेऔर ध्यान से जेल में डीएनए नमूने (ओं) को लोड छवि (3). एक उचित डीएनए आकार मार्कर हमेशा प्रयोगात्मक नमूने के साथ लोड किया जाना चाहिए.
  6. जेल बॉक्स के ढक्कन बदलें. कैथोड (काला होता है) करीब anode के (लाल होता है) की तुलना में कुओं चाहिए. डबल जाँच है कि इलेक्ट्रोड सही स्लॉट में बिजली की आपूर्ति में खामियों को दूर कर रहे हैं.
  7. सत्ता पर बारी. भागो जेल तक डाई एक उचित दूरी के लिए चले गए है.

3. सेपरेटेड डीएनए टुकड़े अवलोकन

  1. वैद्युतकणसंचलन पूरा कर लिया है, जब बिजली की आपूर्ति की बारी है और जेल बॉक्स के ढक्कन को हटा दें.
  2. जेल बॉक्स से जेल निकालें. जेल की सतह से अतिरिक्त बफर नाली. कागज तौलिए पर जेल ट्रे प्लेस किसी भी अतिरिक्त बफर अवशोषित.
  3. जेल जेल ट्रे से निकालें और यूवी प्रकाश के लिए जेल बेनकाब. यह सबसे अधिक जेल प्रलेखन प्रणाली (4 छवि) का उपयोग किया जाता है. डीएनए बैंड दिखाने चाहिएनारंगी फ्लोरोसेंट बैंड के रूप में. जेल छवि (5) की एक तस्वीर ले लो.
  4. जेल और संस्था के नियमों के अनुसार चल रहा है बफर के ठीक से निपटाने.

4. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 5 पीसीआर उत्पादों के agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के बाद एक ठेठ परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है. जुदाई के बाद, जिसके परिणामस्वरूप डीएनए टुकड़े को स्पष्ट रूप से परिभाषित बैंड के रूप में दिखाई दे रहे हैं. डीएनए मानक या सीढ़ी एक डिग्री है कि नमूना बैंड के आकार के उपयोगी दृढ़ संकल्प के लिए अनुमति देता है अलग किया जाना चाहिए. में उदाहरण दिखाया गया है, 765 बीपी, 880 बीपी और 1022 बीपी के डीएनए टुकड़े के एक 1.5% agarose जेल पर एक डीएनए 2 लॉग सीढ़ी के साथ अलग कर रहे हैं.

आकृति 1.
चित्रा 1. जम कंघी को हटाने के बाद agarose जेल.

चित्रा 2.
चित्रा 2. एक छात्र उसे डीएनए नमूने लोड हो रहा है डाई जोड़ने.

चित्रा 3.
चित्रा 3. एक छात्र जेल में एक अच्छी तरह से में डीएनए का नमूना लोड हो रहा है.

चित्रा 4.
चित्रा 4 एक जेल प्रलेखन प्रणाली का एक उदाहरण है.

चित्रा 5.
5 चित्रा के बाद एक जेल वैद्युतकणसंचलन की एक छवि. EtBr 0.5 μg / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता, 1 घंटे के लिए 100 वी पर जुदाई के बाद वैद्युतकणसंचलन से पहले जेल में जोड़ा गया था. जेल यूवी प्रकाश और एक जेल प्रलेखन प्रणाली के साथ लिया तस्वीर को उजागर किया गया था.

Discussion

Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन nucleic एसिड को अलग करने का एक सक्षम और प्रभावी तरीके से साबित हो गया है. Agarose उच्च जेल ताकत बड़े डीएनए टुकड़े की जुदाई के लिए कम प्रतिशत जैल से निपटने के लिए अनुमति देता है. आणविक sieving agarose जेल मैट्रिक्स में 7 के बंडलों द्वारा उत्पन्न pores के आकार के द्वारा निर्धारित किया जाता है. सामान्य में, agarose, छोटे ध्यान में लीन होना आकार के उच्च एकाग्रता. पारंपरिक agarose जैल 100 बीपी और 25 केबी के बीच डीएनए टुकड़े की जुदाई में सबसे प्रभावी हैं. डीएनए 25 KB से बड़े टुकड़े को अलग करने के लिए, एक नाड़ी क्षेत्र जेल 6 वैद्युतकणसंचलन है, जो दो अलग अलग दिशाओं से वर्तमान alternating के आवेदन शामिल है का उपयोग करने की आवश्यकता होगी. इस तरह बड़े आकार डीएनए टुकड़े गति, जिस पर वे अपने मौजूदा दिशा में परिवर्तन के साथ नई दिशा से अलग हो रहे हैं. डीएनए 100 बीपी से छोटे टुकड़ों और अधिक प्रभावी ढंग से जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर अलग हो रहे हैं. विपरीतagarose जैल, polyacrylamide जेल मैट्रिक्स एक मुक्त कट्टरपंथी प्रेरित रासायनिक प्रतिक्रिया के माध्यम से बनाई है. इन पतली जैल उच्च एकाग्रता के हैं, खड़ी कर रहे हैं चलाने के लिए और बेहतर संकल्प है. आधुनिक डीएनए अनुक्रमण केशिका electrophoresis प्रयोग किया जाता है, केशिका ट्यूब एक जेल मैट्रिक्स के साथ जिससे भर रहे हैं. केशिका ट्यूब का उपयोग उच्च voltages के आवेदन के लिए अनुमति देता है, जिससे डीएनए टुकड़े की जुदाई (और डीएनए अनुक्रम का निर्धारण) जल्दी से सक्षम करने के.

Agarose hydroxyethylation के माध्यम से कम पिघलने agarose बनाने के लिए संशोधित किया जा सकता है. कम पिघलने agarose आम तौर पर प्रयोग किया जाता है जब अलग डीएनए टुकड़े के अलगाव वांछित है. Hydroxyethylation agarose बंडलों की पैकिंग घनत्व, प्रभावी रूप से अपने ताकना 8 आकार को कम करने को कम कर देता है. इसका मतलब यह है कि एक ही आकार के डीएनए टुकड़ा अब लेने के लिए एक कम पिघलने agarose के रूप में एक मानक agarose जेल विरोध जेल के माध्यम से कदम होगा. क्योंकि बंडलों को एक दूसरे के साथ सहयोगीगैर सहसंयोजक 9 संपर्क के माध्यम से, यह संभव है कि फिर से पिघल एक agarose जेल के बाद यह स्थापित किया है.

EtBr सबसे आम के agarose जैल में 10 डीएनए दाग इस्तेमाल किया अभिकर्मक है. जब यूवी प्रकाश के संपर्क में, ethidium अणु के खुशबूदार अंगूठी में इलेक्ट्रॉनों को सक्रिय कर रहे हैं, जो इलेक्ट्रॉनों भूमि राज्य में लौटने के रूप में (प्रकाश) ऊर्जा की रिहाई की ओर जाता है. EtBr ही एक एकाग्रता निर्भर तरीके में डीएनए अणु में intercalating द्वारा काम करता है. यह किसी विशेष डीएनए इसकी तीव्रता के आधार पर बैंड में डीएनए की मात्रा के एक अनुमान के लिए अनुमति देता है. इसके सकारात्मक आरोप की वजह से, EtBr के उपयोग में 15% द्वारा डीएनए प्रवास दर कम कर देता है. EtBr एक संदिग्ध उत्परिवर्तजन और कैसरजन है, इसलिए ध्यान अभ्यास जब agarose यह जैल युक्त संभाल चाहिए. इसके अलावा, EtBr एक खतरनाक अपशिष्ट माना जाता है और उचित का निपटारा किया जाना चाहिए. Agarose जैल में डीएनए के लिए वैकल्पिक दाग SYBR गोल्ड, SYBR हरे, क्रिस्टल वायलेट और मिथाइल ब्लू शामिल हैं. इनमें से,मिथाइल ब्लू और क्रिस्टल वायलेट डीएनए बैंड के दृश्य के लिए यूवी प्रकाश के लिए जेल की जोखिम की आवश्यकता नहीं है जिससे उत्परिवर्तन की संभावना को कम करने अगर जेल से डीएनए टुकड़ा की वसूली वांछित है. हालांकि, उनकी संवेदनशीलता कि EtBr की तुलना में कम कर रहे हैं. SYBR सोना और SYBR हरे रंग दोनों बेहद संवेदनशील, EtBr से कम विषाक्तता के साथ यूवी रंगों निर्भर हैं, लेकिन वे काफी अधिक महंगे हैं. इसके अलावा, वैकल्पिक रंगों के सभी या तो हो सकता है या नहीं काम जब जेल से सीधे जोड़ा नहीं अच्छी तरह से कर सकते हैं, इसलिए जेल वैद्युतकणसंचलन के बाद पोस्ट दाग होना होगा. उपयोग की लागत, आराम, और संवेदनशीलता की वजह से, EtBr अभी भी कई शोधकर्ताओं के लिए पसंद की डाई बनी हुई है. हालांकि, जब खतरनाक अपशिष्ट निपटान मुश्किल या जब युवा छात्रों के रूप में कुछ स्थितियों में प्रदर्शन कर रहे हैं एक प्रयोग, एक कम विषाक्त रंग पसंद किया जा सकता है.

लोड हो रहा है जेल वैद्युतकणसंचलन में इस्तेमाल रंगों के तीन प्रमुख उद्देश्यों की सेवा. पहले वे नमूना घनत्व जोड़नेयह जेल में सिंक करने के लिए अनुमति देता है. दूसरा, रंजक, रंग प्रदान करने और प्रक्रिया को सरल लोड हो रहा है. अंत में, रंग जेल के माध्यम से मानक दरों पर ले जाते हैं, दूरी का अनुमान है कि डीएनए टुकड़े चले गए के लिए अनुमति देता है.

अलग डीएनए टुकड़े का सही आकार प्रत्येक बैंड द्वारा कूच दूरी के खिलाफ एक डीएनए मानक के विभिन्न बैंड के लिए आणविक वजन लॉग साजिश रचने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. डीएनए मानक पूर्व निर्धारित आकार के डीएनए टुकड़े कि अज्ञात डीएनए नमूने के खिलाफ तुलना में किया जा सकता है की एक मिश्रण होता है. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि डीएनए के विभिन्न रूपों अलग दरों पर जेल के माध्यम से कदम. Supercoiled प्लास्मिड डीएनए, अपनी कॉम्पैक्ट रचना की वजह से, सबसे तेजी से जेल के माध्यम से चलता है, एक ही आकार के एक रैखिक डीएनए खुला परिपत्र धीमी यात्रा फार्म के साथ, टुकड़ा द्वारा पीछा किया.

अंत में, 1970 में agarose जैल के डीएनए की जुदाई के लिए गोद लेने के बाद से, यह हैजैविक विज्ञान अनुसंधान में सबसे उपयोगी और बहुमुखी तकनीक साबित हो.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose I Amresco 0710
Boric acid Sigma-Aldrich B7901
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
EDTA Sigma-Aldrich E9884
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637 Carcinogenic—needs to be disposed of as hazardous waste
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP2401-212 Corrosive
Glycerol Fisher Scientific G33-1
Xylene cyanol FF Sigma-Aldrich X4126
Tris base Sigma-Aldrich T1503
Investigator/FX gel documentation system Fotodyne Incorporated
Owl Easycast B1 mini gel electrophoresis system Thermo Fisher Scientific, Inc. B1-PTM
EPS 301 power supply GE Healthcare 18-1130-01

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References

  1. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. 3rd, (2001).
  2. Kirkpatrick, F. H. Overview of agarose gel properties. Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. 9-22 (1991).
  3. Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R•EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).
  4. Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis. Science. 243, 203-206 (1989).
  5. Aaji, C., Borst, P. The gel electrophoresis of DNA. Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).
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  8. Serwer, P. Agarose gels: properties and use for electrophoresis. Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).
  9. Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans. J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).
  10. Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis. Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).

Comments

5 Comments

  1. Well understood................great explanation

    Reply
    Posted by: Muhammad Rizwan A.
    February 27, 2015 - 4:01 PM
  2. Agarose Gel Image -

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    Posted by: Jennifer C.
    March 23, 2015 - 7:49 AM
  3. too good

    Reply
    Posted by: Rosella B.
    April 26, 2015 - 10:12 AM
  4. Thank you!

    Reply
    Posted by: Axel W.
    November 30, 2016 - 1:55 AM
  5. very clear thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 21, 2017 - 6:11 AM

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