El α-test: Rapid libre de células CD4 enumeración utilizando toda la saliva

Published 5/16/2012
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Medicine

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Summary

Un método de enumeración de CD4, la α-test, se describe que utiliza toda la saliva para proporcionar recuentos de células CD4 rápidos y precisos. Las pruebas α-cuesta centavos y elimina la necesidad de formación técnica, reactivos costosos, como los anticuerpos monoclonales, instrumentación, refrigeración, transporte de muestras, así como la recolección y el manejo de sangre.

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Bristow, C. L., Babayeva, M. A., Modarresi, R., McArthur, C. P., Kumar, S., Awasom, C., et al. The α-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva. J. Vis. Exp. (63), e3999, doi:10.3791/3999 (2012).

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Abstract

Hay una necesidad urgente para el recuento de CD4 asequibles para controlar la enfermedad del VIH. Recuento de CD4 está fuera del alcance de las regiones con recursos limitados, debido a la restricciones de tiempo y temperatura, la sofisticación técnica, y el costo de los reactivos, en particular los anticuerpos monoclonales para medir los CD4 en las células de la sangre, el único método aceptable. Una estrategia de uso común de ahorro de costes y ahorro de tiempo de laboratorio consiste en calcular, en lugar de medir los valores sanguíneos determinados. Por ejemplo, los niveles de LDL se calculan utilizando los niveles medidos de colesterol total, HDL y triglicéridos 1. Por lo tanto, la identificación de células libres de los correlatos que regulan directamente el número de células CD4 + T podría proporcionar un método exacto para calcular el recuento de células CD4, debido a la importancia fisiológica de las correlaciones.

El número de células madre que entran a la sangre y están destinados a convertirse en circulación células T CD4 + está determinada por la quimioquina CXCL12 unª de su receptor CXCR4, debido a su influencia sobre la locomoción 2. El proceso de la locomoción de las células madre en sangre es, además, regulada por la superficie celular elastasa de leucocitos humanos (HLE CS) y la ELH CS-reactivo activo α 1 inhibidor de proteinasa (PI 1 α, α 1 antitripsina, SERPINA1) 3. En la enfermedad de VIH-1, α 1 PI está inactiva debido a procesos de la enfermedad 4. En las categorías primeros asintomáticos de VIH-1 enfermedad, activo α 1 PI se encontró que era inferior a lo normal en el 100% de VIH-1 no tratados los pacientes (mediana = 12 mM, y para lograr niveles normales durante las categorías sintomáticas 4, 5. Este patrón se ha atribuido a la inactivación inmune, no a la síntesis insuficiente, la inactivación proteolítica, o la oxigenación. Hemos observado que en VIH-1 sujetos con CD4> 220 células / l, el recuento de CD4 se correlaciona con los niveles séricos de PI activo α 1 (R 2 = 0,93, p &lt; 0.0001, n = 26) y los inactivos α 1 PI (R 2 = 0,91, p <0,0001, n = 26) 5. La administración de α 1 PI al VIH-1 en individuos infectados y no infectados como resultado aumentos significativos en los recuentos de CD4 que sugieren α 1 PI participa en la regulación del número de células T CD4 + en la sangre 3.

Con la estimulación, toda la saliva contiene exudado seroso suficiente (plasma que contiene material proteínico que pasa a través de las paredes de los vasos sanguíneos en la saliva) para permitir la medición de la actividad α 1 PI y la correlación de esta medida es evidencia de que es un método preciso para calcular los recuentos de CD4. En pocas palabras, sialogogos tales como la goma de mascar o ácido cítrico estimula la exudación de suero en la saliva toda la boca. Después de la estimulación exudación de suero, la actividad de suero α 1 PI en la saliva se mide por su capacidad para inhibir la actividad de la elastasa. Elastasa pancreática porcina (EPP)es una fuente barata fácilmente disponibles de la elastasa. PPE se une a α 1 PI formando un complejo uno-a-uno que evita PPE de escindir sus sustratos específicos, uno de los cuales es el péptido colorimétrico, succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida (SA 3 NA). Incubando saliva con una concentración de saturación de PPE durante 10 min a temperatura ambiente permite la unión de PPE a toda la sesión α 1 PI en la saliva. La inhibición de PPE por activo α 1 PI puede ser medido mediante la adición del PPE sustrato SA 3 de NA. (Figura 1). Aunque los recuentos de CD4 se miden en términos de volumen de sangre (células CD4 / l), la concentración de α 1 PI en la saliva se relaciona con la concentración de suero en la saliva, no al volumen de la saliva puesto que el volumen puede variar considerablemente durante el día y persona a persona 6. Sin embargo, prácticamente toda la proteína en la saliva es debido al contenido de suero, y el contenido en proteínas de la saliva es MEAmensurable 7. Por lo tanto, activa α 1 PI en la saliva se calcula como la relación al contenido de proteínas y la saliva se denomina α 1 Índice de PI. Los resultados presentados en este documento demuestran que la α 1 Índice de PI proporciona un método fisiológico exacto y preciso para el cálculo de los recuentos de CD4.

Protocol

1. Preparar soluciones frescas de Trabajo

  1. TBS: 0,05 M de Tris Buffered Saline pH, 7,8 (TBS). Preparar 60 ml de TBS / microplaca.
  2. EPI: elastasa pancreática porcina, de tipo 1 (EPP) se proporciona como una suspensión. Agitar bien y diluir PPE en TBS a aproximadamente 0,01 U / ml. Preparar 6 ml de solución de trabajo / microplaca).
  3. SA 3 NA: succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida (SA 3 NA). Prepare 0,1 M de valores SA 3 solución de NA en dimetilsulfóxido (DMSO) y utilizar inmediatamente o almacenar a -20 ° C. Preparar la solución de 6 ml de trabajo / microplaca mediante la dilución de valores SA 3 solución de NA 1/100 en TBS.
  4. Azul de Coomassie: Prepare una solución madre de Coomassie Brilliant Blue 10% de R-250 (Azul de Coomassie) en TBS y utilizar inmediatamente o almacenar a -20 ° C. Preparar 6 ml de solución de trabajo diluyendo la solución madre 1/1000 en TBS.

2. Preparar la saliva

Colector de saliva: En la posición de pie, estimular la exudación de suero en la saliva mediante la colocación de un sialogogo como el ácido cítrico o goma de mascar en la boca. Una gota de limón sin azúcar es conveniente para los pacientes VIH-1 que con frecuencia son desdentados y no puede masticar goma de mascar. Swallow, según sea necesario durante los primeros 3 minutos, y recoger la saliva toda la boca en un recipiente con tapa para el próximo 3 min. Esto proporcionará aproximadamente 2 ml de saliva. Usar inmediatamente o almacenar a -80 ° C.
  • MANEJO DE SALIVA: Si la muestra congelada, descongelar a 37 ° C y el lugar en el hielo. Almacenar espécimen fresco o descongelado a 2-4 ° C no más de 3 días. Hacer la saliva no vórtice y evitar pipeteado mucina que no contiene suero exudado. Use precauciones básicas cuando manipulen la saliva http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf .
  • 3. Microplacas Set-up

    1. MUESTRAS: Para cada pocillo de ensayo, se añadieron 20 l de saliva para un volumen final de 150 l / pocillo. Mezclar con la pipeta sin introducir burbujas.
    2. CONTROLES: El control positivo contiene PPE, pero la saliva no. El control negativo contiene la saliva, pero no PPE.To el control positivo se añadieron 20 l de TBS. Para el control negativo y se añadieron 20 l de saliva.
    3. INCUBACIÓN PPE: Agite la solución PPE funcionando bien. Añadir 50 l de trabajo PPE solución a cada pocillo con exclusión de los pocillos de control negativo. A los pocillos de control negativo, se añaden 50 l de TBS. Incubar 10 min a 23 ° C.
    4. Incubación del substrato: Añadir 50 l SA 3 solución de NA de trabajo a cada pocillo. Incubar 45 min a 23 ° C.
    5. Azul de Coomassie. Añadir 50 l de solución de azul de Coomassie de trabajo </ Li>
    6. Lectura: Lea la absorbancia en el lector de microplacas, una de 405 nm para detectar SA 3 división NA que representa activa α 1 PI y A 595 nm para la detección de Coomassie azul que representa el contenido de proteína.

    4. Calcular α 1 Índice de PI

    1. Normalizar LA MEDIA A 405 nm y 595 nm A: Por cada tres ejemplares, calcular la media. Restar la media del control negativo de la media de la pieza. Para minimizar la placa a placa de variación, la normalización de los promedios, dividiendo cada término medio entre el promedio de muestras de control positivo de la siguiente manera:

    Ecuación 1

    1. CALCULAR EL α 1 PI INEX: Dividir el normalizada A 405 nm por las normalizadas A 595 nm:


    5. Los resultados representativos

    Para determinar si la α-test podría ser adecuado para su uso como prueba de detección de punto de atención para vigilar los recuentos de CD4 en endémicas, las regiones con recursos limitados, la saliva estimulada se obtuvieron de 20 mujeres y 11 hombres VIH-1 clínica de los sujetos para asistir a rutina de cuidado en el Camerún. De acuerdo con observaciones preliminares durante el desarrollo de la α-prueba con la saliva recogida en Nueva York, la α 1 Índice de PI en la saliva recogida en Camerún correlaciona con recuentos de células CD4 (R 2 = 0,91, p <0,0001. N = 31). La relación se define por una curva sigmoidea 3-parámetro que es consistente con una relación dosis-respuesta (Figura 2A). La confianza del 95% y los intervalos de predicción se representan con líneas azules y rojas, respectivamente (Figura 2B).

    Enun estudio previo, se determinó que las células CD4 + T presentan ciclos sinusoidales con una periodicidad de 23 ± 3,5 días en sujetos VIH-1 y en sujetos con la versión heredada de la deficiencia de α 1 PI (PIZZ) 3. Se muestra aquí es un ejemplo representativo de la generada por ordenador análisis de la curva sinusoidal de las células CD4 bicicleta en un no-VIH-1 exhibe 27 controles sanos periodicidad días (Figura 3).

    Generada por computadora análisis de la curva sinusoidal de las células CD4 + T cambios celulares en 6 sujetos dieron valores de pico a pico de amplitud y el eje de oscilación 3. Como era de esperar, el eje de oscilación se correlacionó con la amplitud (R 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6) (Figura 3B). En los pacientes que se CD4 bajos recuentos de células T +, los cambios cíclicos en el recuento de CD4 de células T eran pequeños, y en pacientes con CD4 + altos recuentos de células T, los cambios cíclicos eran grandes.

    Debido a que ellínea de regresión se muestra en la Figura 2 estima que el eje de oscilación y el eje de oscilación está correlacionada con la amplitud, la amplitud puede ser calculado por la línea de regresión así estimar la distancia por encima y por debajo de los CD4 de la línea de regresión + células T se espera que variar debido a (véase la figura 3C). La superposición de la amplitud calculada en la Figura 3C y el intervalo de confianza calculado en la Figura 2B, se encontró que la amplitud (línea verde) está dentro del 95% del intervalo de confianza (línea azul) (Figura 3D).

    Figura 1
    Figura 1. Resumen del procedimiento: El ácido cítrico Coloque en la boca y recoger la saliva. Añadir la saliva diluida a los pocillos de una microplaca por triplicado. Añadir PPE a cada pocillo y se incuba durante 15 min a 23 ° C. Añadir el sustrato PPE a cada pocillo y se incuba durante 45 min a 23 ° C. Añadir Azul de Coomassie y se leyeron a 405 nm para detectar la actividad del PPE y a 595 nm para detectar la proteína.

    Figura 2
    Figura 2. Comparación de la α-test con el método de enumeración de CD4 estándar. A) La α-test se realizó por la cuantificación de la α 1 Índice de PI en la saliva estimulada toda la boca. Recuentos de CD4 se realizaron en un laboratorio médico independiente mediante citometría de flujo estándar. Sangre por citometría de flujo y la saliva se recogieron en la visita a la clínica misma. La relación entre la α 1 Índice de PI y los recuentos de CD4 fue definida por una curva sigmoidea de 3 parámetros (r 2 = 0,91, p <0,0001, n = 31). B) La confianza del 95% y los intervalos de predicción se muestran en azul y rojo líneas, respectivamente.

    Figura 3
    Figura 3. La precisión del cálculo de CD4 counts utilizando el Index.A α1PI) células T CD4 + mostraron ciclo sinusoidal con periodicidad de 27 días en un control no-VIH-1 saludable. El eje de oscilación se representa (línea punteada roja). B) generado por ordenador de análisis de onda sinusoidal de CD4 se usan ciclos de células T para calcular la amplitud de pico a pico y el eje de oscilación en 4 sujetos VIH-1, 1 no-VIH -1 Pizz tema, y la no-VIH-1 control sano se muestra en la parte A. La relación entre T CD4 + amplitud de la celda y el eje de oscilación fue definida por la curva sigmoidea de 3 parámetros (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6). C) La relación sigmoidal entre la amplitud y el eje de oscilación deriva en parte B) se utiliza para calcular la amplitud esperada (líneas verdes) de puntos a lo largo de la línea de regresión (línea negro) de la Figura 2. D) La amplitud esperada intervalo (líneas verdes) fue significativamente diferente de la del intervalo de confianza 95% (líneas azules) como se determina por el ensayo de Mann Whitney suma de rangos (basado en una comparación de la diferencia media entre el intervalo de confianza del 95% y la línea de regresión (63 células / l) y la mediana de la diferencia entre la línea de amplitud y la línea de regresión (37 células / l), p = 0,001).

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    Discussion

    Suero sin diluir contiene la mediana de 36 mM α 1 PI y 3,6 mM α 2 macroglobulina (α 2 M), una diferencia de 10 veces 8. Ambas proteínas competir por la unión a EPI. Estas dos características, la concentración y la afinidad del PPE, se han explotado para desarrollar un método que es capaz de medir específicamente α 1 PI en el suero normal en presencia de competir α 2 M 8. Este método puede detectar cantidades tan pequeñas como 50 μ nM 1 PI en 0,3% de suero. En una dilución de suero de 2,5%, la unión de α 2 M a los EPI se convierte en indetectable, y esta dilución contiene alrededor de 900 nM α 1 PI y 90 nm α 2 M.

    En contraste con suero que se compone de 10-veces más α 1 PI que α 2 M, la saliva contiene toda la boca una diferencia de 20 veces 9. Hemos encontrado en el presente estudio que sin diluir, la saliva estimuladacontiene aproximadamente 30 veces menos α 1 PI de suero o nM aproximadamente 1200 α 1 PI y se espera que contienen aproximadamente 60 nM α 2 M. La dilución de saliva óptimo para la α-prueba se encontró que era 13% saliva estimulada, y esta dilución se espera que contienen aproximadamente 160 nM α 1 PI y 8 nM α 2 M, una concentración de α 2 M que está por debajo del umbral de la detección en el protocolo. Debido a la baja concentración de α 2 M, es posible determinar con precisión la actividad específica de α 1 PI en la saliva sin preocupación por la competencia de α 2 M. Las mediciones de la actividad α 1 PI y el contenido de proteínas en la saliva permite el cálculo de la α 1 Índice de PI que se encontró correlación con el método estándar para medir los conteos de CD4, citometría de flujo. Es importante destacar que los resultados del análisis de regresión (r

    Métodos de CD4 enumeración no hayan tenido en cuenta la variación que se debe a la bicicleta. En términos prácticos, los recuentos de CD4 puede variar hasta en 200 células / microlitro entre el nadir y el ápice con una periodicidad de 23-27 días, y esto es cierto independientemente del método para la medición de células T CD4 + 3. Así, el eje de la onda senoidal de oscilación proporciona una medida más exacta de las células CD4 verdadera de una persona + recuento de células T de medida de un solo día, porque el eje de oscilación es hora constante de hora, semana a semana. Mientras que puede no ser factible para medir directamente el eje de oscilación de CD4 de un individuo + células T, esto puede ser estimada usando un promedio de CD4 + longitudinales recuentos de células T siempre que la variación en los recuentos de CD4 no exceda de la amplitud esperada. Gran variacións en el recuento de CD4 indicaría la influencia de otras variables que el ciclismo.

    La línea de regresión se muestra en la Figura 2 es una estimación del eje de oscilación. Cálculo de la amplitud de espera por encima y por debajo de la línea de regresión mostró que la amplitud se encuentra dentro del intervalo de confianza del 95%. La mediana de la diferencia entre el intervalo de confianza del 95% y la línea de regresión es de 63 células CD4 / l, y la mediana de la diferencia entre la amplitud y la línea de regresión es de 37 células CD4 / l. Esto puede ser interpretado en el sentido de que el 95% de los CD4 calculada a partir de las mediciones de prueba α-estará dentro de aproximadamente 63 células CD4 / l de los recuentos de células CD4 reales y que aproximadamente el 58% de esta diferencia será debido a los ciclos de CD4. Por lo tanto, la precisión de la α-prueba es la distancia entre el intervalo de confianza y amplitud que es aproximadamente de 26 células CD4 / l, y la exactitud de la α-prueba es la correlación coefficient de la línea de regresión, que es de 0,95 o 95%.

    Hay varias limitaciones a la α-prueba como se describe aquí, pero las soluciones son fácilmente disponibles. Por ejemplo, aunque la α-ensayo descrito utiliza un formato de microplacas, la capacidad de realizar la α-prueba utilizando una dilución de saliva solo permite la prueba de α-para ser utilizado con la tecnología de varilla, un instrumento libre, sistema tecnológicamente sencillo. Aproximadamente el 2% de las muestras de saliva recogidas en el Camerún eran demasiado viscoso para manipular, y esto es consistente con la saliva recogida en Nueva York. La aplicación de DNasa a dichas muestras se pueden utilizar para mejorar la viscosidad permitiendo con ello la medición 10. Una solución adicional puede ser el uso de sialogogos farmacológicos que estimulan la secreción de la saliva en concreto a través de la vía parasimpática en comparación con simpatía lo que se produce saliva acuosa. Una sialagogue tal es pilocarpina 11. Finalmente, la α-prueba no tienet sido validado todavía, y esto es necesario para determinar si el rendimiento es lo suficientemente discriminatorio para los niveles críticos de los recuentos de CD4 12.

    Los niveles críticos de CD4 están en la región lineal de la curva de regresión sigmoidal que permitió que estos valores se calcula mediante un algoritmo lineal. En esta población, la regresión lineal para los valores <860 células CD4 / l (R 2 = 0,86, n = 30, p <2x10 -7) era tan buena como la regresión sigmoidal (R 2 = 0,88, n = 30, p < 0,0001). La regresión lineal de los índices alfa-1 PI por encima de 67, que corresponde a alrededor de 350 células CD4 / l (R 2 = 0,88, n = 15, p = 0,002) era tan buena como la regresión sigmoidal (r 2 = 0,89, n = 15, p <0,0001). Sin embargo, la correlación no fue significativa en los índices alfa-1 PI por debajo de 67, que correspondían a <350 células CD4 / l (R 2 = 0,17, p = 0,54, n = 15). Este es un valor crítico ya que WHO directrices recomiendan un recuento de CD4 <350 células CD4 / l para calificar para el acceso al tratamiento antirretroviral 13. Para determinar mejor el rendimiento de la α-test y mejorar la sensibilidad a los valores más bajos, un adicional de 800 muestras de saliva se recogen en el Camerún de 4 grupos: los recién nacidos, 2 años, años 3-5 y 6-15 yrs y 16 yrs y mayores.

    En conclusión, la α-prueba es fisiológicamente relevantes para el número de células CD4 en sangre todavía se puede realizar utilizando la saliva proporcionando con ello una no invasiva, exacta y precisa de puntos de atención método para vigilar los recuentos de CD4 en las regiones endémicas sin instrumentación en un el coste por prueba que es menos de un dólar.

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    Disclosures

    No hay conflictos de interés declarado.

    Acknowledgements

    La investigación fue apoyada por la Fundación de Investigación de Harry Winston.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sialogogue, 0.05M citric acid Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 Sugar-Free Lemon dropS
    Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 E1250
    Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide Sigma-Aldrich S4760
    Coomassie Brilliant Blue R-250 Sigma-Aldrich B7920
    Tissue culture-treated, 96 well microplates Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 35-3072
    Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 Dynex P97277

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    References

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