췌장 선암 조직의에서 B7-H1의 Immunohistochemical 착색 (PD-L1) 파라핀은 - 임베디드 슬라이드

이 절차의 전반적인 목표는 면역조직화학적 염색 기술을 사용하여 인간 췌장 선암 조직의 파라핀 절편에서 B 7 H 1 PD L 1의 발현을 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 절편된 조직 부분에서 파라핀을 제거하고 재수화함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 항원 채취로, 압력솥을 사용하여 조직을 염색하는 것입니다.

항체 염색 절차 후에는 신호 증폭 및 DAB 발색 단계가 이어집니다. 마지막 단계는 조직을 탈수하고 장착하는 것입니다. 완료되면.

현미경 검사법과 심상 분석은 막질과 세포질 B 7 H 1를 구상하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 문제는 B seven one BTL one이 종양의 미세환경에서 항종양 면역 억제에 어떻게 기여하는지에 대한 더 나은 이해를 제공함으로써 췌장 내막암 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 극저온 절편의 염색과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 종종 더 쉽게 구할 수 있고 더 쉽게 보관할 수 있는 파라핀 내장 조직 절편의 사용에 최적화되어 있다는 것입니다.

슬라이드에서 신뢰할 수 있는 항체 염색은 파라핀을 먼저 제거하지 않고는 불가능합니다. 따라서 파라핀이 함유된 티슈가 포함된 슬라이드를 준비하려면 먼저 섭씨 55도에서 20분 동안 슬라이드를 굽습니다. 다음으로, 화학 후드에서 일련의 7 개의 화학 수조를 사용하여 파라핀을 제거한 다음 먼저 슬라이드를 자일렌에 10 분 동안 담그십시오.

다음으로, 슬라이드를 두 번째 신선한 자일렌 욕조에 10분 동안 담그십시오. 셋째, 슬라이드를 100% 에탄올에 5분 동안 담그십시오. 넷째, 다시 한 번 슬라이드를 신선한 100% 에탄올에 5분 동안 담그십시오.

다섯째, 슬라이드를 95% 에탄올에 5분 동안 담그십시오. 여섯째, 슬라이드를 80% 에탄올에 5분 동안 담급니다. 마지막으로 탈이온수로 슬라이드를 5분 동안 깨끗이 씻습니다.

파라핀이 제거되면 다음으로 항원을 사용할 수 있도록 해야 합니다. 먼저 슬라이드를 Tris EDTA 버퍼에 담급니다. 이제 압력솥의 슬라이드를 2단계 프로그램으로 가열합니다.

먼저 섭씨 125도에서 30초간 가열한다. 둘째, 섭씨 90도에서 10초 동안 유지합니다. 그런 다음 슬라이드를 따로 보관하여 실온으로 식힙니다.

슬라이드를 한 시간 동안 식힌 후 목욕 당 5분씩 TBST로 슬라이드를 두 번 씻습니다. 이제 슬라이드를 각 슬라이드에 염색할 수 있습니다. 먼저 TBST 용액을 조직 주위로 블롯으로 건조시킨 다음 소수성 펜으로 조직 주위에 원을 표시합니다.

이 절차를 통해 슬라이드를 가습된 챔버에 보관하여 조직의 건조를 피하십시오. 목욕을 하지 않을 때는 슬라이드의 소수성 원 안에 과산화효소 블록 한 방울을 떨어뜨립니다. 5분 정도 기다렸다가 과산화효소를 TBST로 헹굽니다.

그런 다음 TBST에서 슬라이드를 5분 동안 목욕시킵니다. 용액에서 슬라이드를 제거하고 여분의 TBST를 부드럽게 털어냅니다. 이제 각 슬라이드에 CE 차단 버퍼를 한 방울 떨어뜨리고 실온에서 15분 동안 배양합니다.

헹굼으로 슬라이드를 청소하고 TBST에서 5분 동안 목욕을 합니다. 다음으로 각 슬라이드에 Vidan 용액 한 방울을 떨어뜨리고 15분 동안 기다립니다. 동일한 TBST 헹굼 및 목욕 요법으로 AVADON을 제거하십시오.

이제 비오틴을 바르십시오. 5분 정도 기다렸다가 TBST로 슬라이드를 다시 청소합니다. 이제 마우스 단클론 항체 또는 대조 항체의 희석으로 슬라이드를 배양하십시오.

TBST에서는 두 항체 중 하나가 섭씨 4도에서 22시간 동안 접합하도록 합니다. 다음날 이전과 같이 TBST로 슬라이드를 세 번 세척합니다. 각 세척에는 A-T-B-S-T 헹굼과 5분 목욕이 포함됩니다.

이 삼중 세척 요법은 1차 항체를 씻어내는 동안 앞으로 여러 번 반복됩니다. STR titin Bio ITIN 복합체 용액을 준비합니다. 사용하기 최소 30분 전에 준비해야 합니다.

이제 염소 혈청 용액에 비오틴 접합 염소 항미 2차 항체와 함께 슬라이드를 30분 동안 배양합니다. 이 배양 중에 DACO 키트 지침에 따라 DAB 기질 CHROMOGEN 용액을 준비합니다. 이 용액은 4도의 어두운 곳에서 최대 8시간 동안 보관할 수 있습니다.

배양 후 TBST 삼중 세척을 수행합니다. 다음으로 스트립핀 비오틴 복합체 한 방울을 떨어뜨립니다. 각 슬라이드에서 슬라이드를 15분 동안 배양한 다음 TBST로 슬라이드를 세 번 세척합니다.

다음으로, 각 슬라이드에 증폭 시약 한 방울을 도포합니다. 4분 정도 기다렸다가 TBST로 슬라이드를 세 번 세척합니다. 증폭 시약을 씻어낸 후 각 슬라이드에 스트렙타비딘 HRP 한 방울을 추가하고 15분 동안 배양합니다.

계속하기 전에 TBST 삼중 세척을 한 번 더 수행하십시오. 이제 절차에서 가장 민감한 단계가 있습니다. 기질 과산화수소가 있는 DAB 기질 CHROMOGEN 한 방울을 슬라이드에 추가하고 색상 발달인 DAB 기질을 관찰하기 시작합니다.

CHROMOGEN 현상 시간은 일반적으로 2분이지만, 최적의 염색을 보장하기 위해 현미경으로 현상을 정기적으로 모니터링합니다. 각 염색 라운드에 대한 최소한의 배경으로 이전 배치의 슬라이드 1개와 편도선 슬라이드 1개를 양성 대조군으로 포함합니다. 완료되면 즉시 TBST가 아닌 물로 슬라이드를 씻으십시오.

90초 동안 헤마틴 한 방울로 슬라이드를 배양합니다. 즉시 증류된 탈이온수로 슬라이드를 세척한 다음 비눗물 수돗물과 DD 물을 더 많이 세척하십시오. 이것으로 염색 절차가 완료됩니다.

모든 슬라이드가 염색되면 장착하기 전에 에탄올 시리즈를 사용하여 슬라이드를 탈수합니다. 첫. 슬라이드를 80% 에탄올에 3분 동안 담그십시오. 둘째, 슬라이드를 95% 에탄올에 3분 동안 담그십시오.

세 번째와 네 번째 목욕의 경우 슬라이드를 100% 에탄올에 5분 동안 담그십시오. 다섯 번째와 여섯 번째, 슬라이드를 자일렌에 5분 동안 담그십시오. 마지막으로 각 슬라이드에 양당 한 방울을 추가하고 커버 슬립을 부드럽게 적용합니다.

슬라이드는 이제 췌장 선암에서 B 7 H의 이질적인 발현을 입증 한 B 7 H로 현미경 검사, 면역 조직 화학 염색을 할 준비가되었습니다. 그들은 DAB 색상 발달과 함께 갈색으로 보입니다. 일부 췌장 선암 세포는 B 7 H 1의 막질 발현이 우세한 반면, 다른 세포는 B 7 H 1의 세포질 발현 또는 B 7 H 1 정상 췌관 상피의 발현이 적거나 B 7 H 1 정상 췌관 상피의 발현이 거의 없음 마우스 IgG 1 칸파 동위원소 대조 항체 대신 항 B 7 H 1 항체는 배경 염색이 거의 생성되지 않았습니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 7 시간 안에 수행 할 수 있으며, 이 개발 후에 적절하게 수행되면 22 시간 하룻밤 배양으로 이틀에 걸쳐 수행 할 수 있습니다.

이 기술은 종양학 분야의 연구자들이 다른 악성 종양에서 B 7 H 1 PD L 1 신호 전달을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.