Färgning Protokoll för mänskliga pankreatiska öar

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Denna video demonstrerar förfaranden för karakterisering av humana pankreasöar med hematoxylin och eosin (H & E) och immunohistokemi (IHC). Pankreatiska sektioner från huvud, kropp och regioner svans färgas av både H & E och IHC för att bestämma ö endokrin sammansättning (insulin, glukagon och pankreaspolypeptid), cellreplikation (Ki67) och inflammatoriska infiltrat (H & E, CD3). Den uncinate regionen är lokaliserad användning IHC för pankreatisk polypeptid.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. J. Vis. Exp. (63), e4068, doi:10.3791/4068 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Uppskattningar av ö-område och antalet och endokrina celler komposition i vuxen human pankreas variera från flera hundra tusen till flera miljoner och beta massa ligger i intervallet från 500 till 1500 mg 1-3. Med denna kända heterogenitet, var en vanlig behandling och färgningsproceduren utvecklas så att bukspottkörteln regioner var tydligt definierade och holmar kännetecknas med rigorös histopatologi och undersökningar immunolokalisering.

Standardiserade förfaranden för bearbetning av mänskliga bukspottkörteln återhämtat sig från organdonatorer beskrivs i del 1 av denna serie. Bukspottkörteln är bearbetas i 3 huvudsakliga områden (huvud, kropp, svans) följt av tvärgående sektioner. Tvärgående snitt från bukspottkörteln huvudet är vidare uppdelade, som anges baserat på storlek, och numrerade alfabetiskt att beteckna underavdelningar. Denna standardisering möjliggör en fullständig tvärsektion analys av huvudet regionen inklusive uncinate region som innehåller sammansatta cellöarprimärt av pankreatisk polypeptid celler till svansregionen.

Den här rapporten utgör en del 2 i denna serie och beskriver de förfaranden som används för seriell sektionering och histopatologiska karakterisering av avsnitten pankreas paraffin med en betoning på ö endokrina celler, replikering och T-cellinfiltrat. Patologi pankreas sektioner är avsedd att karakterisera både exokrin, duktulära, och komponenter endokrina. Den exokrina facket utvärderas med avseende på närvaro av pankreatit (aktiv eller kronisk), atrofi, fibros, och fett, liksom kanalsystemet, i synnerhet i relation till närvaron av pankreatisk intraduktal neoplasi 4. Cellöarna utvärderades med avseende på morfologi, storlek och densitet, celler endokrina, inflammation, fibros, amyloid, och närvaron av replikerande eller apoptotiska celler med användning av H & E och IHC fläckar.

Den sista komponenten beskrivs i del 2 är tillhandahållandet av färgade bildens som digitaliserade hela glaset bilder. De digitaliserade bilderna är organiserade från fall till fall och bukspottkörtel region i en online-databas patologi skapa en virtuell biobank. Tillgång till detta online kollektion tillhandahålls för närvarande till över 200 kliniker och forskare som deltar i typ 1-diabetes forskning. Online databasen ger ett medel för snabb och fullständig datadelning och utredarna att välja block för paraffin eller frysta seriella sektioner.

Protocol

1. Mikrotomi för Ofärgade avsnitten

  1. Ställ in vattenbad och mikrotom som för standard paraffin mikrotomi. Använd positivt laddade bilder och pre-etikett med målnummer, pankreas-regionen (prov) och bildnummer. Plats paraffin-block i mikrotomen chucken med kassetten etiketten på den vänstra sidan.
  2. Följ normala mikrotomi förfaranden, avsnitt in i blocket tills vävnaden är jämnt påträffas. Skapa ett band av seriella sektioner (4 m tjocka, 3-6 beroende på antalet ursprungliga nödvändiga fläckar (se formulär mål Submission, bilaga 1)). Separata avsnitt i bandet, plocka upp varje i ordning, och lägg på bilder med beställning numrerade med blyerts. Beteckna om en del är oanvänd med numrering avsnitt i exakt ordning. Behåll samma orientering på bilden som finns i kassetten med bilden etiketten orienterade till vänster. Torka över natten vid rumstemperatur sedan att fortsätta med färgning eller distribution till undersökarna.
  3. ResEAL ytan av paraffin block med tunt skikt av paraffin för att bevara vävnad och arkivera i rumstemperatur eller -20 ° C.
  4. För efterföljande mikrotomi, upprätthålla numrering för seriella sektioner på varje nivå enligt ovan. Erhålla en ytterligare bild och färga med H & E objektglas för varje ~ 100 pM nivå inom varje block.

2. H & E-färgning

  1. Placera den första seriella snitt bild från varje block i en bild rack sedan i den första brickan på Autostainer.
  2. Välj standard H & E färgning och fortsätt som vanligt.
  3. När du är klar färgning, ta bort bilder från Autostainer och placera i huva för täckglas.
  4. Täckglas med användning av standardteknik. Torka noga och etikett med en tryckt etikett (se avsnitt 12).

3. IHC Set-up

  1. Välj Dako för dubbla fläckar och telefonnummer in i bilder. Framställ TBST och citratbuffertar, antikroppar och andra Reagent på bestämda volymer (tabell 1). Laddas reagensen facket och bilder. Rotation av ren och linjer avfall är programmerade enligt tillverkarens rekommendationer.
  2. Om att utföra dessa analyser manuellt, förbereda beräknade volymer. Inkubera objektglasen i en fuktig kammare för att undvika att bilderna torkning ut på varje steg. Följ samma procedur för varje reagens som när den används för Autostainer.

4. IHC Deparaffinization och antigenåtervinning

  1. Sätt objektglasen i xylen under 5 min. Upprepa en gång. Låt inte objektglasen torka ut vid någon senare punkt tills anges som detta kommer att resultera i överdriven bakgrunden och dålig färgning.
  2. Överför objektglasen till 100% etanol under 2 minuter. Upprepa en gång.
  3. Sätt objektglasen i nyberedd 3% H2O 2 i metanol under 10 minuter.
  4. Dip bilder i 90% etanol och sedan placera i 90% etanol i 3 minuter.
  5. Överför objektglasen till70% etanol under 1 minut.
  6. Skölj objektglasen i avjoniserat vatten.
  7. Förvärma ångkokaren och citratbuffert i ångkokaren i 5 minuter.
  8. Lägg bilder till citrat buffert i ångaren och ånga i 30 minuter.
  9. Omgående överlåta bilder till vatten och håll tills glider svalna till rumstemperatur (~ 20 minuter).
  10. Överför bilder till Dako Autostainer rack enligt färga sekvens (figur 1) och kör dubbla färgningen programmet. De stora stegen i Autostainer programmet listas så att manuella körningar kan kopiera.

5. Första primära antikroppar (Ki-67, CD3, pankreaspolypeptid)

  1. Blockera objektglas med Krypskytten lösningen under 15 minuter. Tvätta två gånger med TBST.
  2. Inkubera objektglasen i primär antikropp i 30 minuter. Tvätta två gånger med TBST.
  3. Inkubera med Mach2 get-anti-mus (Ki-67) eller anti-kanin (CD3, pankreatisk polypeptid) pepparrotsperoxidas (HRP)-polymer för 30 minutes. Tvätta två gånger med TBST.
  4. Tillämpas 3,3-diaminobensidintetrahydroklorid (DAB) till objektglas i 4 minuter. Tvätta två gånger med vatten.
  5. Objektglas inkuberats med pankreaspolypeptid hålls på Dako när de analyseras samtidigt och TBST används för alla efterföljande steg medan de övriga bilderna inkuberas med den andra uppsättningen av primära antikroppar. Alternativt, för manuella analyser, gå vidare till avsnitt 6.

6. Andra primära antikroppar (insulin, glukagon)

  1. Inkubera objektglasen i Deeb i 20 minuter. Tvätta två gånger med TBST.
  2. Blocket med 10% normalt getserum i 20% avidin-blockerare i TBST (insulin) eller Sniper (glukagon) i TBST under 20 min. Tvätta två gånger med TBST.
  3. Inkubera med insulin eller glukagon primär antikropp under 15 minuter. Tvätta två gånger med TBST.
  4. Insulin: Inkubera objektglasen i biotinylerad get anti-marsvin vid 1:300 utspädning i 30 minuter. Tvätta två gånger med TBST. Inkubera med standard vector ABC-AP-reagens under 30 minuter. Tvätta två gånger med TBST.
  5. Glukagon: Inkubera objektglasen i buffert under 30 minuter följt av get-anti-mus-alkaliskt fosfatas (AP)-polymer i 30 minuter. Tvätta två gånger med TBST.
  6. Även bilder inkuberas i konjugat, värma LPR bufferten till rumstemperatur. Tillsätt 1 droppe vätska permanent röd (LPR) per 3 ml buffert omedelbart före användning och placeras i Dako reagensställningen. Inkubera objektglasen i LPC i 4 minuter. Tvätta två gånger med vatten.
  7. Inkubera objektglasen i hematoxylin under 1 minut. Skölj två gånger med vatten.
  8. Inkubera objektglasen i TBS pH 7,6 under 1 minut. Skölj två gånger med vatten.
  9. Inaktivera bilder från DAKO Autostainer.
  10. Omedelbart torka objektglasen färgats för pankreaspolypeptid. För alla dubbla färgade bilder, torka i minst 1 timme torka då.

7. Dehydratisering

  1. Placera objektglasen i 80% etanol under 1 minut.
  2. Doppa objektglasen i 95% etanol. Håll bilder i 95% etanol i 30 sekunder.
  3. Överför bilder till 100% etanol och håll ned 1 minut. Upprepa.
  4. Dip bilder i xylen.
  5. Håll bilder i xylen under 1 minut. Upprepa.
  6. Omedelbart montera täckglas på objektglas med Cytoseal.

8. Slide Märkning

  1. Ange informationen fallet identifiering, inklusive orgel och blocknummer, bets, och datum och tryck. Serienummer avsnitt nummer är frivilligt för de första slide fläckar i varje block. Efterföljande nivåer är betecknade med numrering.
  2. Placera etiketter på bilder.

9. Diabilder

  1. Placera färgade bilder i scanner bricka och scanna efter instrumentering.
  2. Ordna bilder med givare och vävnadstyp (pankreas huvud, kropp, svans, mjälte).
  3. Arkivera färgade objektglasen vid rumstemperatur och eventuellt kvarvarande ofärgade objektglas vid -20 ° C tills de användes.

10. Representative Resultat

Dessa färgningsförfaranden utvecklades för JDRF Nätverket för givare bukspottkörtel orgel med Diabetes (nPOD) för att ge baslinjen karakterisering av paraffin och färska frysta block. Varje givare har en baslinje karakterisering utförs består av färgning 2 kvarter från varje bukspottkörteln region (huvud, kropp och svans) och mjälte (Figur 1, se även mål inlämningsformuläret, bilaga 1). H & E-färgning genomfördes med användning av en Autostainer programmeras som en klinisk anläggning med klinisk kvalitet lösningar som används genomgående. Som ytterligare givare block är sektioneras, har varje en bild tagen för H & E för att visa vävnadsmorfologin. När block är sektioneras igen, som för distribution till utredare, kommer djupare nivåer har också diabilder tagna för representativa H & E bilder för att dokumentera hela blocket vävnad morfologi samt numrering seriella sektioner på varje nivå. Färgade objektglasen är märkta medVid identifiering, bukspottkörtel region, blocknummer, bets och datum (Figur 2) och skannas in i online-patologi informationshanteringssystem. Representativa bilder från en kontroll donator visas i figur 3 vid både låga och höga förstoringar för att visa förväntade resultaten av detta förfarande. Sliden färgades med pankreatisk polypeptid (d, H) analyserades på en annan dag med analysen genomfördes manuellt och visar minskad nedfläckning intensitet hematoxylin motfärg. Skillnader i färgningsintensitet av primära antikroppar eller Motfärga mellan analyser skall undvikas speciellt om du använder bildanalys annat glider att det krävs individuella färgkorrigering för att uppnå samma cell områden eller räknas.

Varje laboratorium bör räkna med att optimera antikropps koncentrationer sats-till-många variation och andra reagenser och förhållanden kan påverka färgning intensitet och specificitet. Med förvärv av nya REAgents är färgningsförfaranden valideras med kända positiva och negativa kontrollprover att uppnå samma grad av färg intensitet med tidigare reagenser. Ytterligare antikroppar optimerades i det nPOD patologin kärnan ges i tabell 2 som en referenskälla och har använts för multilabeling immunfluorescensanalyser för konfokal mikroskopi.

Figur 1
Figur 1. Dako färgning nätet. Detta schema visar en rutinanalys från en nPOD donator bukspottkörteln utförs på ett Dako Autostainer. De nPOD givarna är kodade med en 4-siffrigt identifikationsnummer. Två bildspel brickor visas med bilder som anordnas av fläcken. Alternativa bildspel konfigurationer förväntas beroende på antalet givare bilder. Positiva kontroller omfattar införandet av en känd positiv donator för de två dubbla fläckar och givare mjälte för Ki-67 och CD3. Negativa kontroller är två och inkluderar två SLIdes från en donator pankreas blocket inkuberades med immunglobulin (Ig) från värdarten av de primära antikropparna och två objektglas från donator mjälte för insulin och glukagon.

Figur 2
Figur 2. Representant dubbla färgade bilden. En typisk färdig bild visas med parametrar bildspel märkning och vävnader placering innan digital scanning utförs.

Figur 3
Figur 3. Representant H & E och IHC fläckar i bukspottkörteln sektioner. § från bukspottkörteln hos en vuxen hona organdonator (6096-04 Panhead) färgades och digitala utförda skanningar som beskrivs i protokollet. Bilder erhölls med användning av ImageScope betraktelseprogrammet för hela sektionen (AD) och från en ö (EH). De förväntade ö fläcken intensiteter för insulin, glukagon och pankreaspolypeptid ärobserverades för sektionerna BD som sektion D linjera att denna pankreas huvud block innehåller en liten del av uncinate regionen eller ventrala pankreatisk lob som alla öar innehåller huvudsakligen pankreatiska polypeptiden-positiva celler. Observera att hematoxylin motfärg i panel D är för ljus medan hematoxylin Motfärga intensiteter i B och C är optimala. Panelerna EH visar en ö av den dorsala loben med den förväntade fördelningen av p-celler och α-celler. Några pankreatisk polypeptid celler finns i den nedre vänstra delen av ö (H). A, E-H &E; B, F-Ki67 + insulin, C, G-CD3 + glukagon; d, H-pankreatisk polypeptid. AD, 0,2 x, EH-12,8 X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Standardisering av IHC förfaranden är kritisk för bildanalys, speciellt vid användning av dator-baserade algoritmer i stora mängder glider över tiden. IHC färgning som beskrivs i denna rapport kan parti analys av en viss givares prover med en Autostainer inom en 8-timmars arbetsdag och ändras från en tidigare rapport 5. Digitaliserade hela glaset bilder av varje färgade bild görs tillgänglig för nPOD-anslutna utredare genom det webbaserade online-patologi system. Utredarna kan granska givare demografi, data laboratorium och annan relevant klinisk historia tillsammans med bilderna och kan välja block mest lämpade för sina studier (se http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php för mer information) . Ett sådant nätet patologi systemet fungerar som en "virtuell biobanken". En ytterligare förbättring av detta system kommer att genomföras whefaldig bildspel etiketter innehåller en streckkod för att spåra seriella sektioner och nivåer för varje block med en eventuell mål 3-D rekonstruktion av bukspottkörteln.

De två dubbla färgningsförfaranden har främst valt att bestämma ö β-cellkomposition (insulin) i samförstånd med cellulär replikation (Ki-67) med tanke på vikten av att förstå mekanismer för vuxna β-cell förnyelse i typ 1-diabetes 5,6. Eftersom den andra dubbla IHC-analysen utförs på seriesnitt till den första är varje skär kännetecknad både β-cell (insulin) och α-cellkomposition (glukagon). Dessutom är närvaron av T-lymfocyter (CD3) bestäms i samband med α-cell-färgning av två huvudsakliga skäl. Basis av T-cellsmedierad autoimmunitet i progressionen av typ 1-diabetes har tydligt inses ännu beskaffenheten av de initierande medel (virus-, bakterie-, inflammatoriska celler) eller sammansättningen av den kroniska infiltrat med Resulviktigt β-cell dysfunktion och död har ännu inte definieras (över 7,8). Andra givare med typ 1-diabetes har en väl karakteriserad brist på p-celler så att kombinationen av CD3 och fläckar glukagon garanterar identifiering av öar, även om β-celler förlusten är svår 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Författarna tackar givarna familjer och orgeln organisationer för tillvaratagande inblandade i denna forskning och Emily Montgomery, Robert Pietras, Ann Fu, Mitali Agarwal och Roshan Agarwal för deras experthjälp. Detta arbete har finansierats av Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) till stöd för nätverket för givare bukspottkörtel Organ med diabetes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30% Hydrogen Peroxide (H2O2) Fisher Scientific H325-500 Endogenous peroxidase blocking
ABC-Alkaline Phosphatase (AP) Vector Laboratories AK-5000 AP conjugate
Antibody Diluent Invitrogen 003218 Primary antibody
Avidin blocker Vector Laboratories SP-2001 Block endogenous biotin
Biotinylated Goat anti-guinea pig Vector Laboratories BA-7000 Secondary antibody
Bluing Reagent Fisher Scientific 7301 Leica autostainer
Citrate buffer, pH 6.0 BioGenex HK086-9K Antigen retrieval
Clarifier 1 Fisher Scientific 7401 Leica autostainer
Cytoseal XYL Fisher Scientific 8312-4 Coverslip mountant
DAB Vector Laboratories SK-4100 HRP chromogen
DEEB Dako S2003 Endogenous AP blocking reagent
Eosin Y Alcoholic Fisher Scientific 71204 Leica autostainer
Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% Fisher Scientific Various Deparaffinization and coverslipping
Hematoxylin Dako S3301 Dako autostainer
Hematoxylin 7211 Fisher Scientific 7211 Leica autostainer
IgG (all host species for primary antibodies) Various Various Negative controls for primaries
Liquid Permanent Red (LPR) Dako K0640 AP chromogen
Mach2 AP Biocare Medical MALP521L Goat anti-Mouse AP conjugate
Mach2 HRP Biocare Medical MHRP520L Goat anti-Mouse HRP conjugate
Mach2 HRP Biocare Medical RHRP520L Goat anti-Mouse HRP conjugate
Methanol Fisher Scientific Various H2O2 diluent
Normal goat serum Vector Laboratories S-1000 IHC blocking reagent
Sniper Biocare Medical BS966M IHC blocking reagent
TBST 20X Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-999-TT IHC buffer
Triology 20x Cell Marque 920P-06 Antigen Retrieval
Xylene Fisher Scientific Various Deparaffinization and coverslipping
Table 1. Specific reagents.
Name Company Catalog Number Comments
Paraffin
Amylase Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-46657 Mouse
Amylin Serotec MCA11267 Mouse
Carbonic anhydrase 19.9 Abcam ab15146 Mouse
Caspase-3, cleaved Cell Signaling Technology 9961 Rabbit
CD20 Dako M0755 Mouse
CD3 Dako A0452 Rabbit
CD34 Cell Signaling Technology 3569 Mouse
CD4 Dako M7310 Mouse
CD45 Dako M0754 Mouse
CD68 Dako M0876 Mouse
CD8 Dako M7103 Mouse
Chromogranin A Dako A0430 Rabbit
CK17 Dako M7046 Mouse
CK19 Dako M0772 Mouse
CK7 Dako M7018 Mouse
C-peptide Cell Signaling Technology 4593 Rabbit
Foxp3 e Bioscience 14-4776-80 Rat
Ghrelin Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-10386 Goat
Ghrelin Abcam ab85104 Rabbit
Glucagon Dako A0565 Rabbit
Glucagon Abcam ab10988 Mouse
Glucagon Bachem T-5037 Guinea Pig
Glut-1 Abcam ab40084 Mouse
Glut-2 Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-9117 Rabbit
Insulin Dako A0564 Guinea Pig
Ki-67 Dako M7240 Mouse
Mafa Novus Biological NB400-137A Rabbit
Pancreatic polypeptide Invitrogen 18-0043 Rabbit
Pdx-1 Abcam ab47308 Guinea Pig
Proinsulin Novocastra NCL-proin-1G4 Mouse
Proinsulin Developmental Studies Hybridoma Bank GS-9A8 Mouse
Secretagogin Sigma-Aldrich HPA 006641 Rabbit
Smooth muscle actin Abcam ab5694 Rabbit
Somatostatin Dako A0566 Rabbit
Synaptophysin Dako M0776 Mouse
Fresh Frozen
CD11b Abcam ab6332 Rat
CD11c Serotec AHP1226 Rabbit
CD25 Novus Biological NB 600-564 Mouse
CD94 Abcam ab61874 Mouse
GAD65 Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-130569 Mouse
HLA-ABC Dako M0736 Mouse
Table 2. Primary antibodies.
Name Company Catalog Number Comments
Aperio Scanscope CS Aperio Technologies Digital slide scanner
DAKO Autostainer Plus Dako IHC stains
Label Matrix printing software BioCarta LM7UP57 Slide label software
Leica XL Autostainer Leica Microsystems H&E stains
Premium Coverglass Fisher Scientific 12-548-5J Coverslip
Spectrum Information Manager Aperio Technologies Scanner software
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15 Positively charged slides
Vegetable steamer Black and Decker Various Antigen retrieval
Zebra TLP 3742 CDWG TLP3742 Slide label printer
Table 3. Specific supplies and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. In't Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
  2. Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008).
  3. Saisho, Y. Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes. Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).
  4. Hruban, R. H. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).
  5. Campbell-Thompson, M. Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area. Diabetologia. 52, 262-270 (2009).
  6. Meier, J. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).
  7. Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. The pancreas in human type 1 diabetes. Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).
  8. Veld, I. n't, P, Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion. Islets. 3, 131-138 (2011).
  9. van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics