Picoeukaryoteのゲノム形質転換

Biology
 

Summary

この資料では、単細胞の海藻の遺伝的形質転換を説明

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van Ooijen, G., Knox, K., Kis, K., Bouget, F. Y., Millar, A. J. Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri. J. Vis. Exp. (65), e4074, doi:10.3791/4074 (2012).

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Abstract

植物科学の急速な進歩を妨げる一般的な問題は、細胞、組織および生物全体の複雑さ、および高等植物の簡単な遺伝学に影響を与えるゲノムの冗長性の特に高いレベルが含まれています。小説のモデル生物Ostreococcusタウリ型は、日付に知られている最小の自由生活真核生物であり、大幅に減少ゲノムサイズと細胞の複雑さの1,2を有しており 、あたりほとんどの細胞小器官の一つの存在(ミトコンドリア、葉緑体、ゴルジスタック)によって明らかにセル、唯一の〜8000の遺伝子を含むゲノム。さらに、unicellularityと容易に文化の組み合わせは、ケミカルバイオロジー的アプローチの影響を受けやすいプラットフォームを提供します。最近、Ostreococcusが正常概計時3-6基礎となる基本的なメカニズムを研究するために採用されている。このモデル生物からの結果は、植物科学だけでなく、哺乳類の生物学7だけでなく、影響を与えています。この例は、どのように迅速な実験に焦点を当て緑系統からの単純な真核生物は、複雑さの低減のこの背景には技術的に可能な方法を使用して検証可能な仮説を生成することによって、より複雑な生物の研究を加速することができます。ゲノムや遺伝子を変更する可能性の知識はすべてのモデル種で欠かせないツールです。遺伝的Ostreococcusを変換する以前に報告された方法6,10は世界でも数少ない研究室によく知られているのに対し、ゲノムの1、トランスクリプトーム8、この種のプロテオミクス9については、自由に利用可能です。

この記事では、遺伝的に過剰発現してこの小説のモデル生物を変換するための実験方法はから発信された変換線の選択を可能にするためにエレクトロポレーションを用いて詳細に説明されて、同様に低い割合アガロースで形質転換細胞の封入の方法で構築する単一の形質転換細胞。 Ostreocoの成功したアプリケーションは、次概日リズムの研究にccus、Ostreococcusへの関心の高まりは、バイオテクノロジーの領域を含む植物科学、内と外の多様な研究分野から期待することができます。保存された生化学的経路上で動作生物学および医学の広い範囲から研究者が大規模なモデル生物種のゲノムと生物複雑性から自由に、Ostreococcusの研究を追求すると考えるかもしれません。

Protocol

1。藻類材料の調製

  1. Ostreococcus細胞 、人工海水(ASW)で培養されています。塩分濃度計を用いて測定された海塩(1リットル当たり典型的には約40グラム)が、pptの30の塩分濃度に脱イオン水に溶解されています。表1-3で説明したように増菌培地11,12、微量金属元素やビタミンが追加されます。メディアは、0.22μmのフィルターを通して、フィルター滅菌します。
  2. メンテナンスのため、Ostreococcus株 OTTH95の細胞は新鮮なASW 7日ごとに1/100の希釈で無菌的に継代培養で、ムーンライトブルーフィルターを装備し、植物成長のインキュベーター内で一定の光の下で成長した。光強度に近い20モルm -2 s -1でのあるべきであり、温度を20℃に維持されてい細胞は一定の撹拌を必要としませんが、凝集を防ぐために、2〜3日後に動揺しています。
  3. 各変換のために、細胞を50mlのセル·ドで必要とされる継代培養後に5-7日間を達成すべきである20から30×10 6 ml -1の 、のnsity。おおよその細胞密度とaxenyは、フローサイトメトリーまたはX40倍率の少なくともhaemocytometerのいずれかを使用して決定することができます。

2。エレクトロポレーション

  1. 形質転換用DNAを調製する。各形質転換のために、純粋な、線状化プラスミドDNA5μgを滅菌脱イオン水では1μg/μlの濃度で必要とされています。このDNAを得るために、著者らは他の方法が同様に働くかもしれませんが、キアゲンミディプレップキットを使用することをお勧めします。使用するベクターのバックボーンにカットする酵素ではなく、遺伝子または選択遺伝子でで製品を消化。さらに精製し、エタノール沈殿によって得られた直鎖DNAを集中し、高品質の滅菌脱イオン水の適切な量の製品を再懸濁します。
  2. 各変換のための5μgのDNAを含むマイクロチューブを準備します。 controないDNAとlが変換される各セルの行が必要です。各変換のための2mmのエレクトロポレーションキュベットと一緒に、氷の上でこれらのチューブを保持します。
  3. 変換ごとに再懸濁バッファー2.2 mlを準備します。のddH 2 O中1M溶液に溶解させるソルビトール、0.1%プルロニック酸F68とフィルター滅菌を追加します。
  4. 円錐形の底の50 mlチューブに、最終的な細胞に0.1%の濃度、および10で8000X gで10分間ペレットそれら℃にプルロニック酸F68を追加します。すぐに上下にピペッティングによる再懸濁緩衝液1mlで細胞を再懸濁して、遠心管に移す。 10°Cで8000 xgで10分間スピンダウンし、すぐに作業を、もう一度、この洗浄ステップを繰り返します。
  5. カットチップで、再懸濁バッファー40μlで各最終ペレットを再懸濁します。氷の上で線状化DNAのすべてのチューブに再懸濁した細胞の40μlを加え、穏やかに混合し、エレクトロポレーションキュベットに移す。
  6. electropにキュベットを入れ演説のマシン。 6 kVのcm -1で 、600Ω、25μFに設定を変更します。細胞をエレクトロポ。
  7. 10分間室温でキュベットにelectoporated細胞をインキュベートし、組織培養フラスコを準備するその時間を使用しています。それらにラベルを付け、それぞれに新鮮なASWの30ミリリットルを追加します。各フラスコから1mlを取り出し、優しく対応するキュベットに追加します。 2分間インキュベートし、ゆっくりとASWを削除するには、現在のセルの球を含み、優しくゆっくりと培養フラスコにASWに直接ピペット。
  8. 細胞は一般的に球に残っています。この瞬間に集約された細胞を振るか、邪魔しないように注意してください。フラスコを振盪することにより再懸濁した後、細胞が1-2時間インキュベーターに回復することができます。この時、細胞は自由に再懸濁するべきでない塊は見えないはずです。インキュベーターで一晩回復するために文化を残す。

3。半固形培地で細胞をプレートに含めること

    2 O 2.1%低融点アガロース溶液をオートクレーブします。加熱マグネチックスターラーの上に水を含む大きなビーカーに65から90°Cで溶融保持します。各変換に9 ASWのmlに加えて必要な選択を含む8ペトリ皿(55 mm径)と8×15 mlチューブにそれぞれが準備します。 NourseothricinまたはG418を使用している場合は、2 mg / mlのを使用しています。
  1. インキュベーターから形質転換細胞を収集します。滅菌flowhoodで働いて、チューブのいずれかで9ミリリットルを沸騰LMPアガロース1mlを追加します。チューブを閉じ、転倒混和する。その後、新たに形質転換細胞の0.5mlを加え素早く混合し、プレートに注ぐ。残りの7つの管で、このプロセスを繰り返しますし、次の変換フラスコに進みます。
  2. アガロースを設定するためのプレートは、時間のフローフード内で開いたまま。その後、プレートを閉じて、4枚それぞれを保持する大きな正方形をペトリ皿にそれらを転送します。正方形のプレートウィットを封印Hパラフィルム。プレートが完全に設定されていないことに注意してください、その結果、ゲルは非常に壊れやすいものです。ケアは、プレートを取り扱う際にはゲルを壊さないように注意する必要があります。インキュベーター内のすべての正方形のプレートを置きます。

4。形質転換コロニーの選択

  1. コロニーは、形質転換プレート上ではなく、モック変換プレート上で10から21日後に表示されます。コロニーを選択するカットオフヒントを200μlのピペットを使用しています。単に自由なコロニーを選択し、緑色のコロニーを吸い出す。近隣のコロニーから任意のセルが含まれていないように注意してください。
  2. 24ウェルプレートに、選択を含む液体培地2mlにセルを転送します。 Nourseothricinを使用する場合は、1.75 mg / mlのを使用しています。上下にピペッティングにより混和する。変換ごとに24から50コロニーを選択します。パラフィルムとインキュベータへの転送でプレートをシールします。
  3. 一週間後、24ウェルプレートの選択で2 mlの新鮮なASWを各ウエルに100μlを転送し、additionaために成長するL 7日。生き残った細胞株は、さらなる研究のために使用することができます。ゲノムおよび挿入数に安定した統合は、PCRおよびサザンブロット法を用いて分析する必要があります。ゲノムDNAは、植物DNA抽出のための任意のダウンスケーリングされた標準的な方法を用いてこれらの目的のために取得することができます。

5。代表的な結果

細胞は、1/100、7日間の成長後、ミリリットルあたり2500万個の細胞密度に達して分割します。適切な設定を持つ細胞のエレクトロポレーションは、時定数10〜14ミリ秒となりました。細胞は培養フラスコに培地に移している場合、セルの球を形成する必要があります。軽く時間後に振とうした場合、細胞が容易に懸濁する必要があります。 0.2%LMP寒天に1ミリリットルの形質転換細胞の包含は、一貫しただけの半固体ゲルになるはずです。コロニーは10から21日後に表示されます。変換ごとに上記のプロトコルを使用して線状化DNAの5μgを変換し、50から100コロニープレートは、通常、負の制御プレート上なしと比べ、期待されていた。 〜選んだコロニーの80%が積極的に液体培地に抗生物質耐性によって選択されたと、その後の研究で使用されていた。

最終濃度 ストック溶液 1リットルのボリューム
NaNO 3を 8.83×10 -4 M 75グラム/ LのdH 2 O 1 mLの
NH 4 Clを 3.63×10 -5 M 2.68グラム/ LのdH 2 O 1 mLの
β-グリセロリン酸 1×10 -5 M 2.16グラム/ LのdH 2 O 1 mLの
H 2 SEO 3 1×10 -8 M 1.29 mg / LでのdH 2 O 1 mLの
トリスベース液(pH7.2) 1×10 -3 M 121.1グラム/ LのdH 2 O 1 mLの
K微量金属溶液表2 1 mLの
f / 2のビタミン溶液表3 0.5 mLの

表1。 Oの成長のための培地成分タウリ 11、12は 30 pptの塩分に人工海水1リットルの総量を確認し、示されているようにストック溶液から上記のコンポーネントを追加します。週間以内に培地および使用をフィルター滅菌する。ビタミン溶液を除くすべての化合物のストックは、媒体のすべてのリットルのこの溶液6mlを追加するためにプールすることができます。

最終濃度 ストック溶液 1リットルの金額
のNa 2 2 O 1×10 -4 M 41.6グラム
のFeCl 3•6H 2 O 1×10 -5 M 3.15グラム
のNa 2たMoO 4•2H 2 O 1×10 -8 M 6.3グラム/ LのdH 2 O 1 mLの
硫酸亜鉛4•7H 2 O 1×10 -9 M 22.0グラム/ LのdH 2 O 1 mLの
のCoCl 2•6H 2 O 1×10 -9 M 10.0グラム/ LのdH 2 O 1 mLの
のMnCl 2•4H 2 O 1×10 -8 M 180.0グラム/ LのdH 2 O 1 mLの
のCuSO 4•5H 2 O 1×10 -8 M 9.8グラム/ LのdH 1 mLの

表2。金属溶液11,12をトレースします 。のdH 2 Oで1リットルの合計、および溶解する熱に構成しています。ストレージ用に小分け液と凍結。最終濃度は、最終的な培地ではなく、微量金属溶液を参照して示された。

最終濃度 ストック溶液 1リットルの金額
ビタミンB 12 1×10 -10 M 1グラム/ LのdH 2 O 1 mLの
ビオチン 1×10 -9 M 0.1グラム/ LのdH 2 O 10 mLの
チアミン塩酸• 1×10 -7 M 200 mgの

表3。 F / 2ビタミン溶液11のdH 2 O、フィルター滅菌し、分注し、凍結で1リットルの合計を最大にします。最終濃度は、最終的な培地ではなく、ビタミン溶液を参照して示された。

図1
図1。変換手順のグラフィカルな概要。遺伝的エレクトロポレーションによってOstreococcusタウリ型を変換する手順の模式図。

図2
図2。培養増殖。細胞は7日ごとに新鮮なASWの1/100の希釈で無菌的に継代培養であり、インキュベーターがムーンライトブルーフィルタを装着し、植物の成長に一定の光の下で成長した。光強度に近いから20マイクロモルm -2 s -1である必要があり、温度を20℃に維持するC細胞は、一定の撹拌を必要としますが、sではありません凝集を防ぐために2〜3日おきに一度ハーケン。

図3
図3。 0.2パーセントLMPアガロース大きな正方形のペトリ皿に転送4プレート、パラフィルム(左上)とシールのコロニー形成 。コロニーが形成されている場合は、単にフリー(理想的には円錐形)コロニー(右上)を選択し、P200のピペットを用いてプレートからそれらを吸う。ネガティブコントロール(右下)にはコロニーがあってはなりません。

Discussion

細胞の状態や文化axenyは、変換手順については、非常に重要である。細胞は通常、光12時間のサイクルで維持されていますが、12時間暗、これらの条件下で培養した細胞の形質転換効率が不十分であることが判明した。繰り返しペレット化/再懸濁ステップ中に、細胞は常に容易に再懸濁する必要があります。細胞の集合体、あるいは粘液様物質が存在する場合は、再度最初から手順を開始することをお勧めします。通常は、〜50のコロニーがネガティブコントロールのプレート上なしと比べ、各形質転換プレートに期待することができます。低い形質転換効率の場合には、培養条件は細胞が最適な状態であることを確認するために変更する必要があります。形質転換効率に影響を与える変数は、周囲の研究室の温度(に近い20°Cなければなりません)と処理速度(ペレット化細胞からの手順[2.3]回復[2.7]〜1時間を取るべきであるから)が含まれています。それはまた重要であるすべてのソリューション再は、各変換の前に新鮮ました。プレートに含めるために、LMPアガロースの濃度が非常に重要です。Ostreococcus細胞高いアガロース濃度で成長せず、低濃度で拡散します。

Ostreococcusの3つの形質転換ベクターは、以前6公開されており、より多くのベクトルが生成され、まもなく公開されることが期待されています。既存のベクトルポットリュック6 Potoxベクトル6 Ostreococcusから採取した強力な誘導13プロモーターを運ぶのに対し、高速なトランスジェニックラインの選択に加えて扱いやすいの発現パターンを可能にするC-末端ホタルルシフェラーゼタグとの組み合わせで、任意のプロモーターを使用することができます目的の遺伝子の過剰発現に対する高親和性リン酸トランスポーター(HAPT)遺伝子。 Potox-Lucのベクトルが過剰発現株の間接的な選択のために使用できる追加のルシフェラーゼマーカーを運ぶ、Potoxから派生、Ostreococcus細胞多くの抗生物質に対して非常に耐性があり、トランスジェニックOstreococcus細胞選択のために必要な化合物の濃度は、従来のモデルシステム(2 mg / ml)をより高くなっています。

プロセスが非効率に見えますが、この手順に必要な細胞とプラスミドDNAの大規模な数は有意な障害をもたらしません。大きな制限は、選択マーカーに耐性のあるすべての生成された行は、全体構造がDNAに組み込まれていることを確認するために個別に分析する必要があるということです。我々は、選択マーカーの正常な発現は、興味のある実際の遺伝子の挿入に対応していませんでした例を観察している、すなわち部分的な統合が発生する可能性があります。明らかに、ゲノムにランダムに挿入すると、このメソッドを使用して、挿入部位のないコントロールが存在しないことを意味し、メソッドB相同組換えにasedは、現在開発されています。しかし、ここで説明するメソッドは、現在、私たちの最善の知識に、遺伝子組み換えOstreococcus細胞生成するための唯一の特徴とする方法である。

Ostreococcusタウリはごく最近の実験モデル生物として使用されているように、これらの細胞で働くほとんどのメソッドは進化する可能性があると関わって成長している研究コミュニティによって洗練される。このプロトコルは、人々がOstreococcusで作業を開始する際に役立ちますが、決してこの藻類のゲノム変換について知っているそこにあるすべてを説明するために主張されています。読者はインキュベーターの小さな違い(光のレベルまたは質)およびその他のパラメータが存在し、おそらくこのために必要な健康文化を得るためにすべての個々の研究室で最適化する必要がありますので、自分のニーズに合わせて、このプロトコルを適応させることができると著者らは、信頼プロトコル。マスタリング後の技術は、ここで説明するベクターは、プロモーターの範囲の制御下で発光、蛍光、またはその他のタグ融合行を生成するように構築することができます。このエキサイティングな新しい実験プラットフォームは、どのように複雑な生化学的な問題を勉強するために有用であろう薬理学的ア ​​プローチは、非常に3を容易にされている、複雑さの低減の真核生物で解決されています。

Disclosures

利害の衝突が宣言されません。

Acknowledgments

BBSRCとEPSRC賞D019621によって資金を供給統合システム生物学センターSynthSys。 FYBへエクセレンス "マリンゲノム"助成金EUのFP6ネットワークは、遺伝的形質転換法の開発に資金を提供しています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medium constituents
Instant Ocean Marine Salt from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk
NaNO3 S5506-250G Sigma
NH4Cl A9434-500G Sigma
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate G9422-100G Sigma
H2SeO3 84920-250G Sigma
Ultra pure tris 15504-020 Invitrogen
Na2EDTA∙2H2O BPE120-500G Fisher Scientific
FeCl3∙6H2O 157740 Sigma
Na2MoO4∙2H2O 31439-100G-R Sigma
ZnSO4∙7H2O Z0251 Sigma
CoCl2∙6H2O 31277 Sigma
MnCl2∙4H2O 203734-5G Sigma
CuSO4∙5H2O C8027 Sigma
Vitamin B12 (cyanocobalamin) V2876 Sigma
Biotin 47868 Sigma
Thiamine ∙ HCl T4625 Sigma
Ampicillin A9518-25G Sigma
Neomycin N6386 Sigma
Kanamycin K4000 Sigma
Consumables for culturing
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1810.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1813.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1812.502 Starstedt
TPP Bottle top filters, 1L, complete 99950T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 500ml, 99500T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 250ml, 99250T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 150ml, 99150T Helena Bioscience
Salinity Meter for Marine Aquarium DSG-10 Daeyoon
Chemicals for transformation
D-Sorbitol S6021-1KG Sigma
Pluronic F-68 solution P5556-100ML Sigma
ClonNat 51000 Werner
Low melting point agarose 16520-050 Invitrogen
Consumables for transformation
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1810.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1813.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1812.502 Starstedt
Greiner centrifuge tubes 50ml 227261 GBO
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 165-2086 Bio-Rad
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 391-0895 VWR International
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm FB51788 Fisher Scientific
Moonlight Blue light filter 183 Lee Lighting

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References

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