Transformation génomique de la Picoeukaryote

Biology
 

Summary

Cet article décrit la transformation génétique de l'algue marine unicellulaire

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van Ooijen, G., Knox, K., Kis, K., Bouget, F. Y., Millar, A. J. Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri. J. Vis. Exp. (65), e4074, doi:10.3791/4074 (2012).

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Abstract

Les problèmes courants qui empêchent des progrès rapides en sciences de plantes comprennent les cellules, des tissus et de la complexité organisme entier, et notamment le niveau élevé de redondance génomique touchant la génétique simples chez les plantes supérieures. Le roman organisme modèle Ostreococcus tauri est le plus petit eucaryote libre-vivant connu à ce jour, et possède une taille de génome très réduit et 1,2 complexité cellulaire, qui se manifeste par la présence d'un seul de la plupart des organites (mitochondrie, chloroplaste, pile de Golgi) par cellulaire, et un génome contenant seulement de ~ 8000 gènes. En outre, la combinaison de unicellularity et de la culture facile fournit une plate-forme se prête à des approches de biologie chimique. Récemment, Ostreococcus a été employée avec succès pour étudier les mécanismes sous-jacents de base chronométrage circadien 3-6. Les résultats de cet organisme modèle ont eu un impact non seulement la science des plantes, mais aussi la biologie des mammifères 7. Cet exemple met en évidence comment l'expérimentation rapide dans uneucaryote simple à partir de la lignée verte peut accélérer la recherche dans les organismes plus complexes en générant des hypothèses testables en utilisant des méthodes techniquement réalisables que dans ce contexte de complexité réduite. Connaissance d'un génome et la possibilité de modifier les gènes sont des outils essentiels dans toutes les espèces modèles. Génomique 1, transcriptomique 8, 9 et protéomique des informations de cette espèce est disponible gratuitement, alors que les méthodes précédemment rapportés à 6,10 génétiquement transformer Ostreococcus sont connus pour quelques laboratoires à travers le monde.

Dans cet article, les méthodes expérimentales pour transformer génétiquement cet organisme nouveau modèle à une surexpression de construire au moyen de l'électroporation sont décrites en détail, ainsi que la méthode de l'inclusion des cellules transformées en pourcentage d'agarose à bas pour permettre la sélection de lignées transformées provenant d'une seule cellule transformée. Suite à l'application réussie de OstreocoCCU à la recherche du rythme circadien, un intérêt croissant pour Ostreococcus On peut s'attendre à des domaines de recherche différents dans et en dehors des sciences végétales, y compris les zones biotechnologiques. Les chercheurs d'un large éventail de sciences biologiques et médicales qui travaillent sur ​​les voies biochimiques conservés peut considérer la recherche poursuit dans Ostreococcus, exempt de la complexité génomique et organismique d'espèces modèles plus grands.

Protocol

1. Préparation du matériel d'algues

  1. Cellules sont cultivées dans Ostreococcus eau de mer artificielle (ASW). Sels de la Mer (généralement environ 40 grammes par litre) sont dissous dans l'eau déminéralisée à une salinité de 30 ppt, tel que mesuré à l'aide d'un mètre de la salinité. 11,12 milieu d'enrichissement, éléments traces métalliques et des vitamines sont ajoutées, comme décrit dans les tableaux 1-3. Les médias est alors stérilisé par filtration à travers un filtre de 0,22 um.
  2. Pour l'entretien, les cellules de la souche Ostreococcus OTTH95 sont sous-cultivées aseptiquement à une dilution de 1/100 en eau douce ASW tous les 7 jours et a grandi sous la lumière constante dans la croissance des plantes incubateur muni d'Moonlight filtre bleu. L'intensité lumineuse doit être proche de 20 pmoles m -2 s -1 et de la température est maintenue à 20 ° C. Les cellules n'ont pas besoin d'une agitation constante, mais sont secoués une fois tous les 2 à 3 jours pour empêcher l'agrégation.
  3. Pour chaque transformation, 50 ml de cellules sont nécessaires à une cellule density de 20-30 x 10 6 ml -1, ce qui devrait être atteint 5-7 jours après le repiquage. La densité cellulaire approximative et axeny peut être déterminée en utilisant la cytométrie de flux ou l'autre ou un hémocytomètre à un minimum de grossissement x40.

2. L'électroporation

  1. Préparer l'ADN pour la transformation. Pour chaque transformation, 5 pg de pur, d'ADN plasmidique linéarisé est nécessaire à une concentration de 1 pg / pi dans l'eau dé-ionisée. Pour obtenir cet ADN, les auteurs recommandent d'utiliser un kit Qiagen midi de préparation, même si d'autres méthodes pourraient tout aussi bien fonctionner. Digérer le produit avec une enzyme qui coupe dans le squelette du vecteur utilisé, mais pas dans le transgène ou un gène de sélection. En outre purifier et concentrer l'ADN résultant par précipitation à l'éthanol linéaire, et remettre en suspension le produit dans le volume approprié de haute qualité d'eau dé-ionisée.
  2. Préparer des microtubes contenant 5 ug d'ADN pour chaque transformation. Une control sans ADN est nécessaire pour chaque lignée cellulaire pour être transformé. Maintenir ces tubes sur de la glace, avec une cuvette d'électroporation 2 mm pour chaque transformation.
  3. Préparer 2,2 ml de tampon de resuspension par la transformation. Dissoudre sorbitol à une solution 1 M dans le trou DDH 2 O, ajouter 0,1% d'acide pluronique F68 et filtre-stériliser.
  4. Ajouter de l'acide pluronic F68, à une concentration finale de 0,1% à des cellules, et les granulés pendant 10 minutes à 8000X g à 10 ° C dans un tube de 50 ml à fond conique. Immédiatement remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de resuspension par aspiration et refoulement, et de transférer dans un microtube. Centrifuger pendant 10 minutes à 8000 xg à 10 ° C, et de travailler rapidement, répétez cette étape de lavage une fois de plus.
  5. Avec une pointe de coupe, remise en suspension chaque culot final dans 40 ul de tampon de resuspension. Ajouter 40 ul des cellules remises en suspension dans chaque tube de l'ADN linéarisé sur la glace, mélanger délicatement et transférer à la cuvette d'électroporation.
  6. Mettez la cuvette dans le electropMachine oraison. Modifiez les paramètres à 6 kV cm -1, 600 Ω, et 25 uF. Électroporer des cellules.
  7. Incuber les cellules electoporated dans les cuvettes à température ambiante pendant 10 minutes, et utiliser ce temps pour préparer les flacons de culture tissulaire. Les étiqueter et ajouter 30 ml de frais à chaque ASW. Prélever 1 ml de chaque flacon et doucement l'ajouter à la cuve correspondante. Incuber pendant 2 minutes et retirez délicatement la ASW, qui contient maintenant le globule de cellules et doucement et lentement pipeter directement dans le ASW dans le flacon de culture.
  8. Les cellules restent généralement dans un globule. Prenez soin de ne pas secouer ou de déranger les cellules agrégées en ce moment. Laisser les cellules de récupérer dans l'incubateur pendant 1-2 heures, puis remise en suspension en agitant les flacons. A cette époque, les cellules doivent remettre en suspension librement et sans grumeaux doit être visible. Laissez les cultures afin de récupérer la nuit dans l'incubateur.

3. L'inclusion de cellules sur des plaques dans milieu semi-solide

    2 O dans un flacon contenant un barreau d'agitation. Garder fondu à 65-90 ° C dans une plus grande bécher contenant de l'eau sur un agitateur magnétique chauffant. Pour chaque transformation de préparer des boîtes de Pétri (8 55 mm de diamètre) et 8 tubes de 15 ml contenant chacun 9 ml de ASW, plus la sélection requise. Si vous utilisez nourseothricine ou G418, utilisez 2 mg / ml.
  1. Recueillir les cellules transformées de l'incubateur. Travailler dans un Flowhood stérile, ajouter 1 ml d'eau bouillante agarose LMP à la 9 ml dans l'un des tubes. Fermer le tube, et mélanger en inversant. Ajoutez ensuite 0,5 ml de cellules fraîchement transformées, mélanger rapidement et verser dans la plaque. Répétez cette procédure avec les 7 autres tubes et ensuite dans le ballon de transformation suivante.
  2. Laisser les plaques d'ouvrir dans la hotte à flux pendant une heure, pour l'agarose à définir. Ensuite, fermez les plaques et les transférer à grands carrés des boîtes de Pétri, qui détiennent 4 plaques chacun. Sceller l'esprit carré plaquesh parafilm. Notez que les plaques ne seront pas entièrement fixé, et, par conséquent, le gel est très fragile. Il faut prendre soin de ne pas briser le gel lors de la manipulation des plaques. Placez tous les assiettes carrées dans l'incubateur.

4. Sélection des colonies transformées

  1. Colonies devrait apparaître au bout de 10 à 21 jours sur les plaques de transformation, mais pas sur les plaques des simulacres transformées. Pour prélever des colonies utiliser une pipette 200 pi avec coupure conseils. Il suffit de sélectionner les colonies libres et aspirer la colonie verte. Prenez soin de ne pas inclure toutes les cellules de colonies voisines.
  2. Transférer les cellules à 2 ml de milieu liquide contenant la sélection, dans une plaque de 24 puits. Lorsque vous utilisez nourseothricine, utilisez 1,75 mg / ml. Mélanger en pipetant. Sélectionnez 24-50 colonies par la transformation. Sceller les plaques avec du parafilm et transfert à l'incubateur.
  3. Après une semaine, transférer 100 ul de chaque puits à 2 ml frais ASW avec sélection dans une plaque de 24 puits et de grandir pour une additional 7 jours. Lignées de cellules survivantes peuvent être utilisés pour des études ultérieures. Stabilité de l'intégration du génome du nombre et de l'insertion doivent être analysés en utilisant la PCR et Southern Blot. L'ADN génomique peut être obtenu à ces fins en utilisant n'importe quelle méthode bas-échelle standard pour l'extraction d'ADN des plantes.

5. Les résultats représentatifs

Fractionner les cellules 1/100 a atteint une densité de 25 millions de cellules par millilitre après avoir progressé pendant 7 jours. Électroporation des cellules avec les paramètres appropriés entraîné dans un entre 10 et 14 millisecondes constante de temps. Lorsque les cellules sont transférées dans un milieu en flacons de culture, un globule de cellules doit se former. Lorsque légèrement secoué après une heure, les cellules devraient facilement remettre en suspension. L'inclusion de 1 ml de cellules transformées en agar LMP 0,2% devrait se traduire d'une manière cohérente, mais seulement un gel semi-solide. Colonies devrait apparaître au bout de 10 à 21 jours. Lors de la transformation 5 ug d'ADN linéarisé en utilisant le protocole ci-dessus, 50-100 colonies par la transformationplaque ont été généralement prévu, contre aucun sur les plaques de contrôle négatif. ~ 80% des colonies ont été cueillies sélectionné de façon positive par la résistance aux antibiotiques en milieu liquide et ont été utilisés dans des études ultérieures.

La concentration finale Solution mère Volume pour 1 litre
NaNO 3 8,83 x 10 -4 M 75 g / L dH 2 O 1 ml
NH 4 Cl 3,63 x 10 -5 M 2,68 g / L dH 2 O 1 ml
β-glycérophosphate 1 x 10 -5 M 2,16 g / L dH 2 O 1 ml
H 2 SeO 3 1 x 10 -8 M 1,29 mg / L dH 2 O 1 ml
Tris-base forte (pH 7,2) 1 x 10 -3 M 121,1 g / L dH 2 O 1 ml
Solution K métaux-traces Tableau 2 1 ml
f / 2 solution de vitamines Tableau 3 0,5 ml

Tableau 1. Constituants du milieu pour la croissance de O. tauri 11, 12. Faire un volume total de 1 litre d'eau de mer artificielle à une salinité de 30 ppt, et ajouter les composants ci-dessus à partir de solutions mères comme indiqué. Filtrez-stériliser le milieu et l'utilisation dans une semaine. Les stocks de tous les composés à l'exception de la solution de vitamine A peut être mis en commun pour ajouter 6 ml de cette solution pour chaque litre de milieu.

La concentration finale Solution mère Montant pour 1 litre
Na 2 2 O 1 x 10 -4 M 41,6 g
FeCl 3 • 6H 2 O 1 x 10 -5 M 3,15 g
Na 2 MoO 4 • 2H 2 O 1 x 10 -8 M 6,3 g / L dH 2 O 1 ml
ZnSO 4 .7 H 2 O • 1 x 10 -9 M 22,0 g / L dH 2 O 1 ml
CoCl 2 • 6H 2 O 1 x 10 -9 M 10,0 g / L dH 2 O 1 ml
MnCl 2 • 4H 2 O 1 x 10 -8 M 180,0 g / L dH 2 O 1 ml
CuSO 4 .5 H 2 O • 1 x 10 -8 M 9,8 g / L dH 1 ml

Tableau 2. Tracer une solution métallique 11,12. Maquillage pour un total de 1 litre, en DH 2 O, et chauffer pour dissoudre. Aliquoter la solution et le gel pour le stockage. Les concentrations finales indiquées se rapportent à la moyenne finale, pas la solution des métaux traces.

La concentration finale Solution mère Montant pour 1 litre
La vitamine B 12 1 x 10 -10 M 1 g / l dH 2 O 1 ml
La biotine 1 x 10 -9 M 0,1 g / L dH 2 O 10 ml
Thiamine • HCl 1 x 10 -7 M 200 mg

Tableau 3. f / 2solution de vitamines 11. Maquillage pour un total de 1 litre en dH 2 O, le filtre-stériliser, aliquoter et congeler. Les concentrations finales indiquées se rapportent à la moyenne finale, pas la solution la vitamine.

Figure 1
Figure 1. Présentation graphique de la procédure de transformation. Représentation schématique de la procédure à transformer génétiquement Ostreococcus tauri par électroporation.

Figure 2
Figure 2. La croissance des cellules de la culture. Sont sous-cultivées aseptiquement à une dilution de 1/100 en eau douce ASW tous les 7 jours et a grandi sous la lumière constante dans la croissance des plantes incubateur muni d'Moonlight filtre bleu. L'intensité lumineuse doit être proche de 20 pmoles m -2 s -1 et de la température est maintenue à 20 ° C Cellules ne nécessitent pas une agitation constante, mais ils sont sHaken une fois tous les 2 à 3 jours pour empêcher l'agrégation.

Figure 3
Figure 3. La formation de colonies sur les 0,2% d'agarose LMP. Transfert 4 plaques à une boîte de Pétri grand carré, et le joint avec du parafilm (en haut à gauche). Lorsque les colonies se sont formées, il suffit de sélectionner libres (idéalement de forme conique) colonies (en haut à droite) et les sucer de la plaque avec une pipette P200. Il devrait y avoir aucune colonie sur le contrôle négatif (en bas à droite).

Discussion

Cellulaire axeny Etat et de la culture est d'une importance cruciale pour la procédure de transformation. Bien que les cellules sont généralement maintenus en cycles de 12 heures de lumière, 12 heures sombres, l'efficacité de transformation dans les cellules cultivées dans ces conditions ont été jugées insuffisantes. Au cours des répétées de granulation / remise en suspension des mesures, les cellules doivent toujours remettre en suspension facilement. Si globale cellules, ou d'une substance comme le mucus est présent, il est préférable de commencer la procédure depuis le début. En règle générale, environ 50 colonies on peut s'attendre sur chaque plaque de transformation, par opposition à aucune sur la plaque de contrôle négatif. En cas de faible efficacité de transformation, des conditions de culture doit être modifiée afin d'assurer cellules sont dans l'état optimal. Les variables qui affectent l'efficacité de transformation comprennent la température ambiante dans le laboratoire (qui devrait être proche de 20 ° C) et la vitesse de traitement (la procédure de centrifugation des cellules [2.3] à la reprise [2,7] devrait prendre environ 1 heure). Il est également important que toutes les solutions d'unre fait frais avant chaque transformation. Pour être inclus dans des plaques, la concentration de agarose LMP est crucial. Cellules Ostreococcus ne poussent pas dans des concentrations élevées d'agarose, et se diffuse dans de faibles concentrations.

Trois vecteurs de transformation pour Ostreococcus ont déjà été publiés 6, et plus de vecteurs devraient être générées et publiées sous peu. Le vecteur existant Pot-Luc 6 permet l'utilisation d'un promoteur de choix en combinaison avec une étiquette de luciole luciférase C-terminale permettant la sélection de ligne plus rapide transgénique plus motifs d'expression traitables, que le vecteur porte la Potox 6 inductible fort 13 promoteur de la prise Ostreococcus Haut Phosphate Transporter Affinity (HAPT) gène de la surexpression du gène d'intérêt. Le vecteur Potox-Luc dérive de Potox, portant un marqueur luciférase supplémentaire qui peut être utilisé pour la sélection indirecte de lignes surexpression Ostreococcus sont très résistantes à de nombreux antibiotiques, et les concentrations de composés nécessaires pour la sélection des cellules transgéniques Ostreococcus est plus élevé que pour les systèmes de modèle classique (2 mg / ml).

Bien que le processus semble inefficace, le grand nombre de cellules et l'ADN plasmidique nécessaire pour cette procédure ne pose aucun obstacle significatif. Un plus grand limitation est que chaque ligne générée qui est résistant à l'marqueur sélectionnable doit être analysés individuellement pour vérifier que la construction entière est intégré dans l'ADN. Nous avons observé des exemples dans lesquels l'expression réussie du marqueur de sélection ne correspondent pas à l'insertion du gène d'intérêt réel; intégrations partielles peuvent se produire soit. De toute évidence, l'insertion au hasard dans le génome signifie également qu'il n'y a pas de contrôle du site d'insertion en utilisant cette méthode, et les méthodes de basé sur la recombinaison homologue sont actuellement en cours d'élaboration. Cependant, la méthode décrite ici est, à notre connaissance, actuellement la seule méthode pour générer des cellules caractérisée Ostreococcus génétiquement modifiés.

Comme Ostreococcus tauri a récemment été utilisé comme un organisme modèle expérimental, la plupart des méthodes de travail avec ces cellules est susceptible d'évoluer et d'être affiné par la communauté de recherche de plus en plus impliqués. Ce protocole est destiné à aider les gens à entreprendre des travaux avec Ostreococcus, mais ne prétend nullement à décrire tout ce qu'il ya à savoir sur la transformation de la génomique cette microalgue. La confiance auteurs que les lecteurs seront en mesure d'adapter ce protocole à leurs propres besoins que de petites différences dans les incubateurs (niveaux de luminosité ou de qualité) et d'autres paramètres seront présentes et sans doute être optimisé dans tous les laboratoires individu d'obtenir des cultures saines nécessaires à cette protocole. Après avoir maîtrisé les techniques décrites ici,vecteurs peut être construit pour générer luminescente, fluorescente ou d'autres lignes de fusion étiquette sous le contrôle d'une série de promoteurs. Cette plate-forme expérimentale roman passionnant sera utile d'étudier comment les problèmes complexes biochimiques sont résolus dans un eucaryote de réduction de la complexité, dans laquelle les approches pharmacologiques sont hautement facilitées 3.

Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgments

SynthSys un Centre de biologie intégrative des systèmes financés par le BBSRC et d'attribution EPSRC D019621. EU FP6 réseau d'excellence "Marine Genomics" subvention à FYB a financé le développement de méthodes de transformation génétique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medium constituents
Instant Ocean Marine Salt from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk
NaNO3 S5506-250G Sigma
NH4Cl A9434-500G Sigma
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate G9422-100G Sigma
H2SeO3 84920-250G Sigma
Ultra pure tris 15504-020 Invitrogen
Na2EDTA∙2H2O BPE120-500G Fisher Scientific
FeCl3∙6H2O 157740 Sigma
Na2MoO4∙2H2O 31439-100G-R Sigma
ZnSO4∙7H2O Z0251 Sigma
CoCl2∙6H2O 31277 Sigma
MnCl2∙4H2O 203734-5G Sigma
CuSO4∙5H2O C8027 Sigma
Vitamin B12 (cyanocobalamin) V2876 Sigma
Biotin 47868 Sigma
Thiamine ∙ HCl T4625 Sigma
Ampicillin A9518-25G Sigma
Neomycin N6386 Sigma
Kanamycin K4000 Sigma
Consumables for culturing
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1810.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1813.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1812.502 Starstedt
TPP Bottle top filters, 1L, complete 99950T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 500ml, 99500T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 250ml, 99250T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 150ml, 99150T Helena Bioscience
Salinity Meter for Marine Aquarium DSG-10 Daeyoon
Chemicals for transformation
D-Sorbitol S6021-1KG Sigma
Pluronic F-68 solution P5556-100ML Sigma
ClonNat 51000 Werner
Low melting point agarose 16520-050 Invitrogen
Consumables for transformation
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1810.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1813.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1812.502 Starstedt
Greiner centrifuge tubes 50ml 227261 GBO
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 165-2086 Bio-Rad
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 391-0895 VWR International
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm FB51788 Fisher Scientific
Moonlight Blue light filter 183 Lee Lighting

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References

  1. Derelle, E. Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).
  2. Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. 3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell. PLoS One. 2, e749 (2007).
  3. O'Neill, J. S. Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote. Nature. 469, 554-558 (2011).
  4. van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle. Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).
  5. Troein, C. Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms. Plant. J. 66, 375-385 (2011).
  6. Corellou, F. Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus. Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).
  7. O'Neill, J. S., Reddy, A. B. Circadian clocks in human red blood cells. Nature. 469, 498-503 (2011).
  8. Monnier, A. Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles. B.M.C. Genomics. 11, 192 (2010).
  9. Le Bihan, T. Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri. J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).
  10. Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp. US application patent. Corellou, F., Bouget, F. -Y. 201001174050 (2010).
  11. Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).
  12. Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton. J. Phycol. 23, 633-638 (1987).
  13. Djouani-Tari, elB. A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis. PLoS One. 6, e28471 (2011).
  14. Moulager, M. Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus. PLoS. Genet. 6, e1000957 (2010).

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