Gentransfer in Hühnerembryonen durch Ältere Ex ovo Die Elektroporation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen Gentransfer in ältere Hühnerembryonen in vivo durchzuführen, um die Genfunktion und -regulation in älteren Entwicklungsstadien zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Ei etwa am 2.5. Inkubationstag aufgeschlagen und der gesamte Embryo in ein Petrischale-System übertragen wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Plasmid, das für das interessierende Gen kodiert, in den entsprechenden Teil des Embryos zu injizieren.

Nach der Injektion des Plasmids, dem Platzieren der Elektroden neben dem Embryo und der Durchführung der X-Ovo-Elektroporation, besteht der letzte Schritt darin, die elektroporierten Embryonen für die Analyse zu entnehmen. Letztendlich wird die Immunhistochemie verwendet, um die Expression von übertragenen Genen im Embryo nachzuweisen. Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie die X-ovale Elektroporation mit Hühner-BULs durchführen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die X-Überelektroporation die Probleme der Überelektroporation überwinden kann, die für den Gentransfer bei älteren Hühnerembryonen verwendet wird. Eine erfolgreiche X-Ovo-Kultur von Hühnerembryonen erfordert die Verwendung von frisch befruchteten Eizellen. Verwenden Sie keine Eier, die länger als eine Woche bei 12 Grad Celsius gelagert werden.

Legen Sie die Eier nach einer 2,5-tägigen Inkubation auf ihre langen Seiten in einen Zwangszugbrutkasten bei 37,5 Grad Celsius und 60 % Luftfeuchtigkeit. Wenn Embryonen sind bei etwa Hamburger und Hamilton. Stufe 17: Nehmen Sie die Eier aus dem Brutkasten.

Beschrifte die Oberseite jedes Eies mit einem Bleistift, um die Richtung für das Aufschlagen jedes Eies anzugeben. Gießen Sie etwa 20 Milliliter steriles destilliertes Wasser in eine saubere, große Petrischale mit einem Durchmesser von 145 Millimetern. Legen Sie eine kleine sterile Petrischale mit einem Durchmesser von 94 Millimetern in die große Petrischale.

Als nächstes schlagen Sie jedes Ei auf der Unterseite gegen eine scharfe Metallkante. Öffnen Sie das Ei vorsichtig und geben Sie den gesamten Inhalt in die kleine Petrischale. Um die gute Qualität des Embryos zu gewährleisten, sollte der gesamte Inhalt der Eizelle in einer Petrischale in einer normalerweise runden Form aufbewahrt werden, ohne dass die Vilinmembran verletzt wird.

Nachdem Sie den Inhalt jedes Eies in die kleine Schüssel gegeben haben, decken Sie die große Schüssel mit einem Deckel ab. Stellen Sie die Petrischalensysteme in einen weiteren Inkubator für die weitere Kultivierung bei 37,5 Grad Celsius und etwa 60 % Luftfeuchtigkeit, bevor Sie die X-Ovo-Elektroporation durchführen. Verwenden Sie eine Mikroelektrode polar, um Glaskapillaren aus Glasröhren mit einem Durchmesser von 1,0 Millimetern zu ziehen.

Brechen Sie die Spitze der Glaskapillaren in einen geeigneten Durchmesser. Stellen Sie als Nächstes die entsprechenden Parameter für die Elektroporation ein, wie z. B. unterschiedliche Spannungen für das jeweilige Gewebe und die Größe der Embryonen. Verbinden Sie die entsprechenden Elektroden mit der Elektro, je nach Zielgewebe und Größe der Embryonen.

Bereiten Sie eine Plasmidlösung vor, die Plasmide enthält, die für ein Zielgen und ein Markergen kodieren. In dieser Demonstration ist Cadherin sieben oder CAD sieben das Ziel und das grün fluoreszierende Protein oder GFP der Marker. Fügen Sie Fast Green bis zu einer Endkonzentration von 0,1 % hinzu, um die Plasmidlösung grün zu markieren.

Verwenden Sie abschließend eine Mundpipette, um die Glaskapillare mit der Plasmidlösung zu beladen. Für die X-Ovo-Elektroporation werden Hühnerembryonen aus der X-Ovo-Kultur verwendet, die sechs Tage lang inkubiert wurden. Um dieses Verfahren zu beginnen, reißen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Tylen- und Amnionenmembranen über dem optischen Tectum auf und geben Sie drei Tropfen sterile 0,9%ige Natriumchloridlösung auf die Oberfläche des Tectums .

Injizieren Sie mit einer Mundpipette die Plasmidlösung aus der Glaskapillare in den Hohlraum des Tectums. Platzieren Sie die Elektroden mit einer Wolframnadelkathode und einer rechteckigen Plattenanode neben dem Tectum. Benutze sofort den Elektro, um elektrische Impulse auf das Tectum zu bringen.

Decken Sie die große Petrischale mit dem Deckel ab und stellen Sie sie zwei oder drei Tage nach der Elektroporation von Plasmiden, die für GFP und CAD seven kodieren, in das Hühner-Tectum bei E sechs wieder in den Inkubator zurück. Die Ergebnisse sind in dieser Abbildung bei E acht dargestellt. Das GFP-Protein wird stark im Tum exprimiert, wie diese Whole-Mount-Bilder hier zeigen.

Panel A ist ein Hellfeldbild. Feld B ist ein GFP-Bild, und Feld C wird angezeigt. Des Weiteren sind in den Abschnitten des Tectums bei E neun GFP-Proteine, die in Panel D grün visualisiert sind, und CAD, sieben Proteine, die in Panel E rot visualisiert sind, co-exprimiert, wie durch die gelbe Farbe in Panel F dargestellt. Wenn es richtig gemacht wird, beträgt die Effizienz der X-Ovo-Elektroporation 60 bis 100 %. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die X-Ovo-Elektroporation eine erfolgreiche Methode für den Gentransfer in ältere Hühnerembryonen in vivo ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Gentransfer in ältere Hühnerembryonen durchführt, und viel Glück bei Ihrem Experiment.