גילוי תרופות בהנחיית: Assay אוטומטי גבוהים תוכן דלקת דג הזברה

Immunology and Infection
 

Summary

כאן אנו מתארים assay הרומן גבוהה תוכן דלקת הנגרמת כימית מכוון לזיהוי modulatory החיסון bioactives. יש לנו שילוב בהצלחה מיקרוסקופ עם אוטומטיות מותאמות אישית סקריפטים תוכנה שפותחו המאפשרים כימות אוטומטי של התגובה הדלקתית כמו גם עוד עיבוד נתונים, ניתוח, כרייה, ואחסון.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wittmann, C., Reischl, M., Shah, A. H., Mikut, R., Liebel, U., Grabher, C. Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish. J. Vis. Exp. (65), e4203, doi:10.3791/4203 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הזחלים דג הזברה הם נוחים במיוחד בעל חיים כל מולקולה קטנה מסכי 1,2 בשל גודלם הקטן והקלות היחסית של מניפולציה תצפית, כמו גם את העובדה כי תרכובות יכול פשוט להוסיף מים לרחצה נספגים בקלות כאשר מנוהל <1% DMSO פתרון. בשל בהירות אופטית של הזחלים דג הזברה ואת הזמינות של קווי מהונדס המבטאים חלבונים ניאון leukocytes, דג הזברה להציע את היתרון הייחודי של ניטור תגובה דלקתית חריפה in vivo. כתוצאה מכך, ניצול דג הזברה גבוהה תוכן מסכי מולקולה קטנה שמטרתן זיהוי של modulatory החיסון תרכובות עם קצב העברת נתונים גבוה הוצע 3-6, דבר המצביע על אינדוקציה תרחישים דלקת כגון חתכים מקומיים ברקמת הסנפיר, נזק לייזר מכוונת אל פני השטח של חלמון עוברים 7 או קטיעה הסנפיר 3,5,6. החיסרון העיקרי של שיטות אלו עם זאת היההדרישה של מניפולציה הזחל ידנית על מנת לגרום לפציעה, ובכך למנוע תפוקה גבוהה ההקרנה. מבוא של דלקת הנגרמת כימית (סנטר) assay 8 בוטלו המכשולים הללו. מאז הפציעה נגרם באופן כימי את מספר העוברים, כי ניתן לטפל בעת ובעונה אחת הוא כמעט בלתי מוגבל. טיפול זמני של הזחלים דג הזברה עם נחושת סלקטיבי גורם מוות של תאים בתאי השיער של מערכת קו לרוחב והתוצאות בגיוס granulocyte מהירה neuromasts פצועים. התגובה הדלקתית ניתן בעקבות בזמן אמת באמצעות תרכובת מהונדס cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 6,9 הזחלים דג הזברה המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק בתאים neuromast, כמו גם כמה אדומים ניאון תיוג גרנולוציטים חלבון.

על מנת לגבש אסטרטגיה ההקרנה שיאפשר שני ניתוחים גבוהה תוכן תפוקה גבוהה הצגנו טיפול הנוזל רובוטית ו MICR אוטומטי משולבoscopy עם סקריפט תוכנות מותאמות אישית מפותחת. סקריפט זה מאפשר כימות אוטומטי של התגובה הדלקתית על ידי הבקיע את השטח הכבוש על ידי אחוז leukocytes ניאון אדומים בתוך שטח מוגדר באופן אמפירי סביב הפצועים neuromasts ניאון ירוקים. יתר על כן, אנו עיבוד נתונים אוטומטי, טיפול, דמיון מודרך, אחסון מבוססים על מותאם אישית שפותחה MATLAB ו הסקריפטים פייתון.

בקיצור, אנחנו מציגים את המסך אוטומטית HC / HT המאפשר בדיקה של תרכובות כימיות עבור השפעתם על התפתחות ייזום, או ברזולוציה של תגובה דלקתית granulocytic. פרוטוקול זה משמש נקודת פתיחה טובה ניתוחים מעמיקים יותר של מנגנוני סמים המסלולים המעורבים תזמור תגובת החיסון המולדת. בעתיד, הוא עשוי לסייע בזיהוי ההשפעות הרעילות או מטרה מחוץ בלתי נסבלים בשלבים המוקדמים של גילוי תרופות ועל ידי כך להפחית את הסיכונים פרוצדורליים ועלויות לפיתוח התרופה.

Protocol

1. טיפול בבעלי חיים

עבור assay צ'ין שימוש 3 זחלים DPF הנובעים הזדווגויות הקבוצה בין הומוזיגוטים כפול מהונדס cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 ו AB (wild-type) דגים. איסוף עוברים על ידי הרבייה הטבעית לגדל אותם על 29 מעלות צלזיוס במדיום E3 (5 mM NaCl, KCl mM 0.17, 0.33 mM CaCl 2, 0.33 mM MgSO 4, ו - 0.1% מתילן כחול, equilibrated ל-pH 7.0) בצלחות פטרי. זה חיוני כדי לשמור על צפיפות של עוברים לא יעלה על 50-70 לכל צלחת.

2. הזחל מיון

בדוק את כל זחלי תחת stereoscope הקרינה לביטוי הכתב ניאון, דלקת ספונטנית ופיתוח גיל מתאים בנושא.

3. בינוני הכנה ההקרנה (תמיד להכין טרי)

הכן בינוני E3 ללא כחול מתילן השלימו עם DMSO (1% האחרון) ו MS222 (0.05 גר '/ ל').

4. CuSO4אופן ההכנה (תמיד להכין טרי)

ראשית שוקלים את CuSO 4r = 159.6 g / mol) ולהכין פתרון המניה 20 מ"מ DH 2 א ' הכן 120 מיקרומטר CuSO 4 פתרון עבודה (מפתרון 20 המניות מ"מ) E3/DMSO (1%) / MS-222. הגן CuSO 4 פתרון מן האור.

5. 384 גם צלחת אופן ההכנה (גריינר 384 ובכן Microplate)

לפני הוספת 20 μl של E3/DMSO (1%) / MS-222 כדי גם כל אחד עם טפטפת הפוך. יותר פיפטה עצה משעמם נדרש להתמודד עם עוברים בזהירות, ללא גרימת כל פציעה, זה נעשה על ידי חיתוך קצה מ"מ 2 משעמם. העברת זחל אחד של μl 74 בינוני עד טוב כל (84 μl עבור מטופלים). אם יש צורך, הזחלים לכוון במצב לרוחב בתוך גם באמצעות גמישות Eppendorf Microloader פיפטה עצה (Eppendorf, 5242 956.003).

לבצע את כל הפעולות הבאות טיפול הנוזל בנוזל רובוטטיפול עבודה כדי להבטיח טיפול בו זמני של כל הזחלים.

6. התרופה לטיפול

מערבבים בצלחת תרכובות המניות התרופה 5 פעמים על ידי pipetting מעלה ומטה. הוסף 16 μl של הצלחת התרופה 7.5X המניות גם כל ומערבבים 5 פעמים. התאם את מיקום קצה בתוך בארות כדי למנוע פגיעה של זחלים לוותר על המדיום של 10 / μl. מערבבים בינוני בבארות 4 פעמים על מנת להבטיח חלוקה הומוגנית של התרופה בתוך הבאר.

7. דגירה

דגירה הצלחת ההקרנה של 1 ש 'ב 29 מעלות מכוסה בנייר אלומיניום כדי להגן על מרכיבים כמו גם CuSO 4 מן האור.

8. כימית פציעה

הוסף 10 μl של 120 מיקרומטר פתרון CuSO 4 עובד זה גם פרט לקבוצת הביקורת השלילית, לערבב 4 פעמים לדגור שוב 1 שעות על 29 ° C.

9. כביסה

להסיר ולהחליף 80 μl של לי dium מכל באר פעמיים (ב -20 שלבים μl) להסיר תרכובות CuSO 4.

10. תמונה רכישה

התחל רכישת התמונה על מיקרוסקופ אוטומטי הפוך (כלומר: Olympus סריקה ^ חזרה R) 90 דקות לאחר הטיפול הראשוני נחושת. קבוצה ראשונית z ברמה כל כך neuromasts מקו ימין לשמאל לרוחב האחורי גלויים. כל תמונה גם פעם אחת לשעה brightfield ערוצים, Cy3 ו-GFP ב -4 מטוסים מוקד (מרחק 50 מיקרומטר) באמצעות המטרה 4x (NA = 0.13).

מידע נוסף על התמונה ועיבוד נתונים זמינים על פי דרישה.

11. עיבוד תמונה

1. מיון נתונים

תמונות גלם מעובדים עם סקריפט מותאם אישית LabVIEW התוכנה שלנו. הפעולה הראשונה צינור עיבוד התמונה הוא מיון של תמונות גולמיות מתוך התיקייה נתונים שנוצרו על ידי מיקרוסקופ גם ערוץ, והזמן נקודות מידע.

ove_step "> 2. מורחב המיקוד

לאחר מכן התוכנה יוצרת מיקוד תמונות הוארך מ 4 מטוסים מוקד עבור כל אחד הערוצים.

3. RGB-כיסוי

בשלב האחרון התמונות מיקוד המורחבת מן 3 ערוצים ימוזגו להביא תמונת RGB-כיסוי סופי.

4. Neuromast זיהוי אוטומטי

זיהוי תבניות כלי (LabVIEW מהירה כלי IA prototyping) מזהה neuromasts בתוך תמונות שכבת RGB ו יוצר שטח מוגדר באופן אמפירי עניין סביב neuromasts את.

5. קביעת כמות

בתוך שטח מוגדר באופן אמפירי עניין סביב neuromasts פצועים leukocytes ניאון אדומים (כפי שהיא משתקפת פיקסלים אדומים) מקבלים נקודות וכתוצאה מכך הקריאה הראשונית של p ercent o ריאה ccupied ידי eukocytes L (Paol). בממוצע 95.27 ± 2.11% (FDA1) ו 95.12 ±1.56% (FDA2) בארות (זחלים) זוהו כהלכה לאחר מכן כבר היה נתון עיבוד נתונים נוסף. פלט הנתונים הגולמיים (Paol עבור neuromast כל זוהה) מאוחסן בקובץ txt ומשמש קלט נתונים עבור התסריטים MATLAB שהתהליך הנתונים הגולמיים נוסף.

12. עיבוד נתונים

1. IMaps

הערכת ההצלחה של הניסויים שונות על ידי הדמיה גרפית של Paol נתונים גולמיים פלט בקוד צבע יכול להתממש עם מה שנקרא במפות דלקת (iMaps) (איור 2). ירוק בהיר משקף מדד גבוה דלקתי ראשוני: שחור מציין שאין דלקת. סקירה מהירה זו מאפשרת זיהוי מהיר של ניסיונות כושלים, אשר לאחר מכן יש למנוע ומנתח נתונים נוספים.

2. ממוצע של בקרות

כל הצלחת הניסוי מכיל 320 חומרים המשקפיםהנתונים מצביעים בודדים לכל מתחם וזמן נקודות, כמו גם 32 בקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה. השליטה 32 משכפל הם ממוצעים וסטיית התקן מחושבת. עבור הפקדים רק נקודות נתונים בתוך 2 סטיות תקן כלולים.

3. נורמליזציה

הנורמליזציה נעשה על ידי הניתוח של גליונות אלקטרוניים. הערך הממוצע של DMSO, להיות בשליטה שלילית, הוא 0 ו Paol הממוצעת הגבוהה ביותר עבור נחושת הוא 1, אז זה ההבדל בין שליטה מקסימלית חיובי ושלילי הוא 1. Paol של כל המתחם הוא ליניארי אינטרפולציה או אקסטרפולציה הפקדים השונים על הצלחת הניסוי.

4. סופי לקריאה מתוך: אינדקס דלקתיות

לאחר ניסויים לשכפל מספיק (כלומר 15) נערכו, הנתונים הגולמיים לנורמליזציה מניסויים לשכפל הם ממוצעים, והתוצאה הסופית לקריאה החוצה - דלקתיתהמדד. מדד דלקתי ראשוני של שליטה נחושת מתחיל ב 100% עבור השעה אפס נקודות וקושרת לעת רכישת התחל תמונה (90 דקות לאחר הטיפול הראשוני נחושת).

5. מונוטונית רגרסיה מעריכית הולם

בשל ההחלטה דלקת לאורך זמן אנו מבצעים הולם מונוטונית מעריכי רגרסיה ליניארית לקראת הדלקת הראשוני באמצעות משוואה 1 - 0 הוא מדד לתגובה הראשונית בזמן t = 0, 1 קשור המדרון בסדר גודל עם הזמן.

6. 2-D שטח תכונה העלילה (איור 4)

כדי ליצור את החלל תכונה, רגרסיה לא ליניארי מוחל אשכול ניתוח מחלק את החלל תכונה האופייניים לאזורים, ובכך מאפשר זיהוי אוטומטי של מועמדים מעניינים modulatory החיסון קטגוריות שונות (inflammat נגדאורי, נגד ההחלטה, הפרו דלקתי, ברזולוציה Pro-). תרכובות כל מוצגים העלילה 2-D על בסיס פרמטרים 0 ו 1.

13. טיפול ואחסון נתונים

הנתונים שלנו בטיפול שגרות ליצור דפי אינטרנט כדי להמחיש ולייצג מסכי סמים כאלה המספקים סקירה מהירה של התמונה, עיבוד נתונים התוצאות של הצעדים, וכן תצוגה מפורטת כאשר המבוקש על ידי המשתמש 10. קישורים קלים עד הרלוונטיים מסדי נתונים אחרים ביולוגי וכימי הטרוגניות משולבים, כמו גם לספק משאב יקר ערך לחקר השוואתי רומן 11. על ידי שגרות אלה, מתאימים נתונים סטנדרטים metainformation נקבעים לאחסון לטווח ארוך של נתונים אלה.

14. נציג תוצאות

במסך טייס ניתחנו ספרייה הכוללת 640-FDA אישר תרכובות ביו ידועים ההשפעות על התקדמות ייזום, או ברזולוציה של granulתגובה דלקתית ocytic. בהתבסס על ההשפעות שנצפו אנו מסווגים 4 סוגי פנוטיפים modulatory החיסון שעלולים להצביע על מצבים שונים של פעולה: אנטי דלקתיות (1), רזולוציה נגד (2), הפרו דלקתי (3) ו Pro-רזולוציה (4) , אשר יכול להיות מתואר עם פרמטרים 0 ו 1, הנובעים הולם שאינו ליניארי מונוטונית רגרסיה (ה Ao ALX + -) לקראת הדלקת הראשוני. 0 מייצג את עוצמת התגובה הדלקתית בעוד 1 מאפיין את שיפוע עקום וכך מתאר ברזולוציה דלקת. מציג את כל מולקולות ב העלילה 2-D תכונה שטח (1 מול 0) מאפשרת זיהוי אוטומטי של המועמדים שנפגעו מן הקטגוריות השונות modulatory החיסונית (איור 3).

45 מתוך 640 מתחמים הפעילו השפעה אנטי דלקתית על ידי הפחתת המדד דלקתי ראשוני ל -50% או פחות. במסגרת תישל הקטגוריה מצאנו 6 תרכובות השייכות למעמד תרופתי של סטרואידיות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs), המאשר את תוקפו של הגישה שלנו. עם זאת, NSAIDs לא מדורגת בין תרופות אנטי דלקתיות חזקות ביותר. מלבד NSAIDs מצאנו כמה כיתות נוספות סמים תרופתי כגון עבור אנגיוטנסין חוסמי הקולטן לדוגמה (ARBs), אנטיביוטיקה ו מעכבי משאבת מימן.

7 תרכובות עמדו בקריטריונים הסף שהוגדרו אמפירית על הפרו ברזולוציה תרופות פוטנציאליות.

18 תרופות הייתה בעלת השפעה הפרו דלקתי, וכתוצאה מכך גיוס ליקוציט מופרזת neuromasts פצועים בהשוואה לקבוצת הביקורת חיוביות.

רק 2 תרכובות למנוע החלטה בזמן של התגובה הדלקתית.

השפעה אנטי דלקתית של מועמדים פגע כמה (מועמדים מופת של הנ"ל כיתות סמים תרופתי) מ coul מסך טייסד לאשר באופן תלויה במינון של הבאים מבחני צ'ין משניים (מידע לא מוצג). Retesting של 4 Pro ברזולוציה תרופות פוטנציאליות לא לאשר את מצב הפעולה המצוין כפי שהופעל במסך הראשי. 2 התרופות היה פוטנציאל אנטי דלקתית קלה בריכוזים גבוהים יותר (20 מיקרומטר). התרופה 3 הציג שולית שאינה תלויה במינון אנטי דלקתי השפעה על ריכוזי התרופה החל 5-20 מיקרומטר. התרופה 4 לא הייתה השפעה על התגובה הדלקתית על הריכוזים שנבדקו.

איור 1
באיור 1. זרימת עבודה של assay ין. הפרט מתחם מהונדס cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 הזחלים (3 DPF) מופצים באופן ידני ב 384 גם הצלחות microtiter. תרופות נוספות בו זמנית זה גם באמצעות טיפול קומפקטי זפיר Workstation נוזלי. צלחות assay מודגרת אז 29 עבור H 1 ° C. טיפול CuSO 4

איור 2
איור 2. . סקירת תמונה של תמונות גולמיות האיור מציג תמונות גולמיות של 4 מטוסים מוקד (Z = 0 - 3) במרחקים של 50 מיקרומטר בערוצי Cy3 (משמאל) GFP (מימין), בהתאמה. חצים (Z = 1,2) עולה neuromasts למופת, ראשי חץ (Z = 1,2) הצבע על leukocytes התקבצו סביב neuromasts.

איור 3
איור 3. מפות דלקת (iMaps) ההצלחה של ניסויים בודדים ניתן להעריכם iMaps המשקפות את התגובה הדלקתית (הנתונים הגולמיים) בקוד צבע: ירוק בהיר. משקף infla ראשונית גבוהה בתגובה mmatory: שחור מציין שאין דלקת iMaps ב timepoint 0 (משמאל) זמן נקודות 5 (מימין) מראים בבירור אם הניסוי יש לכלול עיבוד נתונים נוסף.. בקרות נחושת (שורה 13 ו 24) מופיעים בגוונים שונים של ירוק, ואילו DMSO השליטה בארות (שורה 1 ו 12) מופיעים בצבע ירוק כהה או שחור. בנקודה בזמן 5, דלקת נפתרה כמעט שולטת נחושת, ציין כעת בגוונים כהים של ירוק או שחור. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

איור 4
באיור 4. 2-D שטח תכונה העלילה של 320 תרכובות של ה-FDA אישר ספריית בקרות בהתאמה. כל בארות המתחם ניתן להציג עלילה 2-D שטח תכונה המבוססת על פרמטרים 0 ו 1, שנובעים לא ליניארי רגרסיה הולם (d/4203/4203eq1.jpg "alt =" משוואה 1 "/>) לקראת הדלקת הראשוני. זה חלקת שטח תכונה המאפשרת זיהוי אוטומטי של מועמדים מעניינים השייכים לאחד הבאים 4 modulatory החיסון קטגוריות שעשויים להצביע על התרופות "אופן הפעולה:. אנטי דלקתי (1), נגד ההחלטה (2), הפרו דלקתי (3) ו Pro-רזולוציה (4) לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

Discussion

Disclosures

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethyl sulphoxide Carl Roth GmbH Co KG A994.2
Copper(II) sulphate anhydrous Carl Roth GmbH Co KG PO23.1
FDA approved drug library Enzo Life Sciences BML-2841-0100
384 microwell plate Non-binding, μClear Greiner 781906 black
Olympus scan^R Olympus
Zephyr Compact Liquid Handling Workstation Caliper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterson, R. T., Fishman, M. C. Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish. Methods Cell Biol. 76, (2004).
  2. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).
  3. Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish. J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).
  4. Martin, J. S., Renshaw, S. A. Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease. Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).
  5. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  6. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
  7. Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
  8. D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish. BMC Biol. 8, 151 (2010).
  9. Haas, P., Gilmour, D. Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line. Dev Cell. 10, 673-680 (2006).
  10. Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge. Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).
  11. Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. Harvester': a fast meta search engine of human protein resources. Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics