Bir Mouse Lenfatik damarları Non-invaziv Optik Görüntüleme

Published 3/08/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Yakın kızılötesi floresans (NIRF) kullanarak en son geliştirilen görüntüleme teknikleri lenfatik sistem kanseri metastazı oynadığı rol, immün yanıt, yara onarımı ve diğer lenfatik ilişkili hastalıkların ortaya çıkmasına yardımcı olabilir.

Cite this Article

Copy Citation

Robinson, H. A., Kwon, S., Hall, M. A., Rasmussen, J. C., Aldrich, M. B., Sevick-Muraca, E. M. Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse. J. Vis. Exp. (73), e4326, doi:10.3791/4326 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lenfatik damar sistemi, sıvı dengesinin korur bağırsaktaki immün gözetim ve aracılık yağ emilimini sağlar dolaşım sisteminin önemli bir bileşenidir. Oysa eleştirel fonksiyonuna rağmen, lenfatik sistem sağlığı ve hastalıkları 1 bu işlevlere hizmet adapte nasıl nispeten biraz anlayış vardır. Son zamanlarda, Gen III-, dinamik görüntü lenfatik mimarisi ve lenf gibi iz yakın kızılötesi floresan (NIRF) boya yönetim ve özel kullanarak lenfatik disfonksiyon muzdarip kişilerin yanı sıra normal insan deneklerde "pompalama" işlemi yeteneğini göstermiştir görüntüleme sistemi 2-4 yoğunlaştı. NIRF görüntüleme insan hastalıkları ile lenfatik mimarisi ve işlevi dramatik değişiklikler gösterdi. Bu değişikliklerin ortaya çıkar ve yeni hayvan modelleri kendi genetik ve moleküler temelini gün ışığına geliştirilmektedir nasıl belirsizliğini koruyor. Bu protokol, biz NIRF lenfatik, s sunmakalışveriş hayvan görüntüleme 5,6 green (ICG), insanlarda 7. 50 yıldır kullanılan bir boya ve tercihen fare ve insan albumin 8 bağlayan NIRF boya etiketli siklik albümin bağlanma alanı (cABD-IRDye800) peptid indosiyanin kullanarak . ICG göre yaklaşık 5.5 kat daha parlak, cABD-IRDye800 benzer bir lenfatik açıklık bir profile sahiptir ve görüntüleme 8 için yeterli NIRF sinyal elde etmek için ICG'den daha küçük dozlar halinde enjekte edilebilir. Interstisyel boşluk 8 albümin hem cABD-IRDye800 ve ICG bağlama, her ikisi de içine ve lenfatikler içerisinde aktif bir protein taşıma tasvir edebilir çünkü. İntradermal (ID) ICG enjeksiyonu (5-50 ul) (645 uM) ya da tuzlu su içinde cABD-IRDye800 (200 uM), her bir arka ayak ve / veya tabanının sol ve sağ taraf dorsal ile uygulanırlar Bir izofluran-anestezi fare kuyruğu. Hayvanda çıkan boya konsantrasyonu 83-1,250 ug / kg veya ICG için 113-1,700 mg / kg 'dır içincABD-IRDye800. Hemen enjeksiyonları takiben, fonksiyonel lenfatik görüntüleme özelleştirilmiş, küçük hayvan NIRF görüntüleme sistemi kullanılarak en fazla 1 saat için yapılır. Tüm hayvan uzamsal çözünürlük derinliği 3 cm 9 elde edilebilir yapıların floresan lenfatik 100 mikron veya daha az olan gemiler ve görüntüleri tasvir edebilir. Görüntüleri V + + yazılımı kullanılarak kazanılmış ve ImageJ veya MATLAB yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. Analiz sırasında, tüm damar çapı kapsayan faiz (ROI) ardışık bölgeler belirli bir lenf damar boyunca çizilir. Her bir ROI için ölçüler kantitatif lenf damarları yoluyla hareket "paketleri" değerlendirmek için her bir ROI için ölçülür verilen damar ve NIRF yoğunluğu için sabit tutulur.

Protocol

Bütün hayvan çalışmaları Texas Sağlık Bilimleri Merkezi (Houston, Teksas), Karşılaştırmalı Tıp Anabilim Dalı, inceleme ve kendi Kurumsal Hayvan Bakım tarafından protokol onayından sonra Moleküler Görüntüleme Merkezi Üniversitesi standartlarına uygun olarak gerçekleştirilen ve Kullanım Kurulu yapıldı (IACUC) veya Hayvan Refahı Komitesi (AWC).

1. Görüntüleme öncesinde 24 Hr Hayvanlar hazırlanması

Lenfatik görüntüleme gerçekleşmeden önce aşağıdaki adımları gün (gerektiği gibi) yapılmalıdır.

  1. Sıra bir indüksiyon kutusuna hayvan ve izofluran ile oturaklı.
  2. Hayvan derin anestezi (TEP-tutam manevrası ile izlenmektedir), izofluran gaza bağlı bir burun konisi bir bezi / kabartmak pad ve pozisyon burun üzerinde yer sedasyon hayvan bir devlet olduğunu bir kez.
  3. Görüntülenecek alanı çevresinde tüm saç / kürk (varsa) klipsleyin.
  4. Kırpılan alana tüy dökücü ajan (Nair) yağlayın ve o bırakınn 3 dakikaya kadar için cilt.
  5. Yavaşça sıcak, nemli gazlı bez veya kağıt havlu ile tüm dökücü ajan siliniz.
  6. Nazikçe ılık su ile cildi yıkayın ve yavaşça gazlı bez veya kağıt havlu ile kurulayın.
  7. Hayvanlar bir ısıtma yastığı veya bir ısı lambası altında kurtarmak ve kendi kafesine geri dönmek için izin ver.

2. Görüntüleme Günü

  1. Steril su ile sulandırın görüntüleme ajanı, ardından cABD-IRDye800 için ICG veya 200 uM (6.8 μg/10 ul) için 645 uM (5 μg/10 ul) elde etmek için steril, normal (% 0,85) salin ile seyreltin. Karanlıkta çözümleri tutun koşulları ve sulandırma 6 saat içinde kullanılmak.
  2. Sıra bir indüksiyon kutusuna hayvan ve izofluran ile oturaklı.
  3. Hayvan derin anestezi (TEP-tutam manevrası ile izlenmektedir), izofluran gaza bağlı bir burun konisi bir bezi / kabartmak pad ve pozisyon burun üzerinde yan yeri sedasyon hayvan bir devlet olduğunu bir kez.
  4. (Yani oda ışıkları kapatınkoyu). Gerekirse, küçük bir masa halojen ışık enjeksiyon görmek için ışık küçük bir miktar için de kullanılabilir.
  5. Bir 31 gauge iğne ile bir insülin şırıngası kullanılarak bağlı olarak, her bir arka ayak ve / dorsal olarak ya da kuyruk tabanının sol ve sağ tarafında ICG veya cABD-IRDye800 50 ul ID 5 ul enjekte ilgi alanı (Tartışma bakın). Her bir dozu enjekte 0,083 ila 1,25 mg / kg (ICG) ya da 0,113-1,7 mg / kg (cABD-IRDye800) kadar değişebilir. Enjeksiyon hacmi hayvan zorlanma ve enjeksiyon yeri ile değişecektir. Atimik fareler için, enjeksiyon hacmi 5 ul (arka pençe) veya 10 ul (kuyruk baz) olabilir. Hayvan püskürtme (ler) i için görüntüleme sistemi altında değilse, sonra hemen görüntüleme sistemi altında hayvan yerleştirmek enjeksiyon (ler).
  6. Hiçbir boya alımı lenfatiklerde görülürse hayvan protokol başına gerektiği gibi, adım 2.5 tekrarlanması gerekir.
  7. Bir kez lenfatikler görülen, siyah elektrik bandı veya siyah pa ile enjeksiyon yerinde kapağıbaşına.
  8. Kadar kullanarak 1 saat için lenfatik görüntüleri Edinme V + + yazılım ve küçük bir hayvan, NIRF görüntüleme sistemi. (Hayvanlar izofluran ile uyuşturulmuş edilir ve görüntüler elde edilir sırasında solunum izlenir.) Küçük bir hayvan da, NIRF görüntüleyiciler ticari olarak temin edilebilir, bir 785-nm lazer diod oluşan bir özel, küçük hayvan NIRF görüntüleme sistemi (1005 9mm-78503 kullanmak , Yoğun, Kuzey bir asferik lens (C24TME-B, Thorlabs, Newton, NJ), difüzör (ED1-C20, Thorlabs) ile donatılmış Brunswick, NJ) ve filtre (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ) santimetrekare başına 10 daha az 1,4 mW bir olay fluence oranda hayvan aydınlatan bir üniforma uyarım alan oluşturmak için. Bir elektron, iki 830-nm filtreler (AND11333, Andover Corp, Salem, NH) ve 28 mm Nikkor lens (1992, Nikon, kamera sistemi şarj çiftli aygıt (EMCCD, PhotonMax512, Princeton Instruments, Trenton, NJ) çarpılması Melville, NY) entegrasyon tim ile lenfatik görüntü yakalamak için kullanılırstatik görüntüleme 5 için dinamik görüntüleme ve 800 msn için 200 msn es. Sistem yapılandırması, her bileşenin ek ayrıntılar için Tablo ve anahtar görüntüleyici özellikleri kısa bir tartışma için Tartışma için Şekil 1'e bakınız.
  9. Hayvanlar bir ısıtma yastığı veya bir ısı lambası altında kurtarmak ve kendi kafesine geri dönmek, ya da ötenazi için izin ver.
  10. ImageJ veya MATLAB yazılımı kullanarak görüntüleri analiz edin. Şekil 6'ya bakınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Farelerde NIRF Lenfatik Görüntüleme Örneği

ICG veya cABD-IRDye800 normal bir fare kuyruk dibinde kimlik enjekte, kuyruk dibinde enjeksiyon yeri ve kasık lenf düğümü (LN) arasındaki lenfatik damar hemen görüntülenmiştir olmalıdır. Kısa bir süre sonra, enjeksiyon (birkaç saniye dakika), kasık LN ve koltuk altı LN arasında lenf damarı olarak, Şekil 2'de görüldüğü görselleştirilmiş olmalıdır. Insanlarda olduğu gibi farelerde lenfatik hayvandan hayvana değişiklik gösterdiğinden, Şekil 3'te gösterildiği gibi, hayvanlar arasındaki mimari varyasyon görülebilir. ICG veya NIRF-cABD normal bir farenin arka pençesinin dorsal kimlik enjekte edildiğinde, iki lenfatik damarların Şekil 4'te gösterildiği gibi popliteal LN drene görselleştirilebilir. Bazı durumlarda, birbirleri ile nedeniyle yakın her iki damar ayırmak zordur.

Zaman zaman, lenfatik görüntüleme en yaygın olarak yerine ID subkutan olarak uygulanmıştır olan enjeksiyonla (SC) bağlı olarak, gecikmeli edilir. SC enjeksiyonları uygulanmıştır zaman, lenfatik taşıma hemen çünkü ulaşmak için ve cilt lenfatik kılcal tarafından içeri alınabilir boya için gerekli ek zaman, (a), Şekil 5'te görüldüğü görselleştirilmiş olabilir. Yerine SC ID enjekte önemli olmasının nedeni budur. Bazı durumlarda, anormal lenfatik damarların, örneğin saç / kürk kesicilerden bir lokma ya da kesik gibi bir yara alanında, Şekil 5 (b) 'de görüldüğü gibi, görülmüştür. Hayvanın vücut sıcaklığı vücut sıcaklığı değişen tutarsız lenfatik işlev neden olabilir gibi, normal sınırlar içinde tutulmalıdır. Tekniğin sınırlamaları deri pigmentasyonu floresan lenf damarları kararma, görüntü yetersizlik nedeniyle derin göğüs lenf kanalları dahildokuda saçılma ışık ve lenfatik fonksiyon anestezi bilinmeyen etkisi.

Genellikle, enjeksiyon yeri temizlemek için karaciğer ve mesane temizlemek için 2 gün öncesine kadar ICG veya cABD-IRDye800 ID si depo alır, ve en fazla 3 gün. Rezidüel floresan sinyalinin silinmesinin zaman, görüntüleme protokolü boyuna lenfatik görüntüleme bazı müdahale sonrası mimarisi veya lenf fonksiyonu değişiklikleri değerlendirmek için izin, tekrar edilebilir.

Lenfatik Fonksiyon Analizi

Elde edilen görüntü veri analizi için ImageJ veya MATLAB yüklenebilir. Sabit bölge, dairesel ROI seçilir ya da Şekiller 6 (a) ve Şekil 6 (D) 'de gösterildiği gibi 10 insan ve hayvan 5 lenfatik görüntüleme için yapıldığı gibi floresan lenf damarı uzunluğunun tamamı boyunca "çekilmiş". ROI, çapları yaklaşık olarak flüorışı imajının çapı olan bu tür seçilmektedirnt damar. Her bir ilgi alanı içindeki ortalama floresan yoğunluğu, Şekil 6 (b), Şekil 6'da gösterildiği gibi, (e lenfatik damarların boyunca hareketli boya yüklü lenf "paketleri" itici hızı ve frekans değerlendirmek için görüntüleme zamanın bir fonksiyonu olarak çizilmiştir ). Lenfatik tahrik lenfatik yayılma hızı ve frekans değerlendirmek için, iki ROI, net bir şekilde tanımlanmış maksimum ya da lenf ve paketleri yayılma gösteren minimum floresan yoğunluğu varyasyonları ile seçilmiş ve floresan yoğunluğu profilleri Şekiller 6 (c) 'de gösterildiği gibi çizilen ve edilir 6 (f). Yayılma hızı aralarında yaymak için lenf bir paket için iki ROI ve transit zamanı arasındaki mesafe oranı alınarak hesaplanır. Floresan darbeler veya saat başına tek bir ROI gelen "paketler" sayısını değerlendirerek, kasılma frekansı hesaplanır. Bu teknik Asse için tek yöntem sağlarkenss tahrik frekans ve itmeli lenfatik dolaşım hızı "paket", diğerleri dolaylı bir görüntüleme ajanı depo klirensi ölçülerek lenfatik transport değerlendirilir ve böylece kaldırma oranı sabitleri 11 hesaplama var. 10 ve erken enfeksiyon kanser metastazları, biz hayvanlarda lenfatik tahrik kaybı bulabilirsiniz. Diğer artrit 12 yanıt olarak kontraktilite değişiklikleri rapor etmişlerdir. İnsanlarda, biz pnömatik kompresyon drenaj 13 ve manuel lenf drenajı (masaj) dahil olmak üzere 14 lenfödem tedavisi sonrasında tahrik arttı rapor.

Şekil 1
Şekil 1. NIRF görüntüleme sistemi küçük hayvan lenfatik görüntüleme için özel yapılmış olduğunu. Cihaz bir asferik lens, yaydıkları ile donatılmış bir 785-nm lazer diyot oluşurer ve filtreler hayvan ve EMCCD kamera aydınlatan bir üniforma uyartım alan oluşturmak için, odaklama lens ve optik filtreler floresan lenf 10 görüntülerini yakalamak için.

Şekil 2,
Şekil 2. ICG veya cABD-IRDye800 10 ml bir 31-gauge iğne, kuyruk dibinde enjeksiyon yeri ve kasık lenf LN arasında lenfatik damar kullanılarak, normal bir fare kuyruk dibinde kimlik enjekte edildiğinde hemen görüntülenmiştir olmalıdır. Dinamik floresans görüntüleri hemen enjeksiyondan sonra ve 20 dk aşağıdaki enjeksiyon için elde edilir. Kısa bir süre enjeksiyon sonrası (birkaç saniye dakika), enjeksiyon yeri ve inguinal LN ve sonradan aksiller LN bölgeye arasındaki lenfatik damarların lateral görüntüsü üzerinde görüntülenmiştir. Şekil 2 'de gösterilen görüntü 5 dk alınmıştır. enjeksiyon wi sonrakuyruk dibinde kimlik ICG inci 10 ul. Inguinal ve aksiller bölgeler arasında parlak nokta karaciğerdir.

Şekil 3
Insanlarda olduğu gibi farelerde lenfatiklerin hayvandan hayvana değişir beri Şekil 3., Hayvanlar arasındaki mimari farklılıklar görülür ve zamanla stabil olabilir. Mouse # 124 kuyruk dibinde ICG enjekte ve 1. günde hemen görüntülendi. Üst panelde günde 1 hem de aynı fare ve enjeksiyon / görüntüleme protokolü kullanılarak 2 gün sonra elde edilen bir görüntü (3. gün) elde görüntüsü içerir. Alt paneli ICG ve hemen görüntülü gün 1 ve daha sonra 3. günde imaged enjekte başka bir fare (# 127) elde edilen görüntüler içerir. Lenfatik mimarisi (lenfatik damarların desen) mo arasında değişirken# 124 ve # 127 kullanın NIRF kullanılarak elde edilen görüntülerin gün 1 ve 3 her fare için tutarlıdır.

Şekil 4,
Şekil 4. ICG veya NIRF-cABD 5-10 ul normal bir fare arka pençenin dorsalinde Kimlik enjekte edildiğinde, iki lenf damarları popliteal LN boşaltmadan görselleştirilebilir edilmelidir. Dinamik floresans görüntüleri hemen enjeksiyondan sonra ve 20 dk aşağıdaki enjeksiyon için elde edilir. Bazı durumlarda, kesik çizgili kutu ile temsil edilen büyütülmüş bir görüntü de gösterildiği gibi yakınlıkları nedeniyle her iki damar ayırmak zordur. Temsilcisi fare burada görüldüğü için, ICG 10 ul sol, arka pençe (ilk enjeksiyon yerinde) dorsalinde ve kuyruk tabanı (ikinci enjeksiyon yerinde) sol tarafına enjekte edildi. Bu görüntü ca olduİlk enjeksiyondan sonra 3 dakika ve yaklaşık 30 sn - - ikinci enjeksiyonu takiben 1 dk yaklaşık 2 ptured.

Şekil 5,
Şekil 5,. (A) lenfatiklerin Bazen görselleştirme gecikmeli ya da en yaygın olarak yerine ID SC yönetilen enjeksiyon dolayı bozulur. ICG veya cABD-IRDye800 10 ml bir 31 gauge iğne kullanılarak, normal bir fare kuyruk dibinde SC enjekte, lenfatik taşıma ulaşmak için boya için gereken ek bir süre hemen görüntülemeyceği ve alınabilir up cilt lenfatik kılcal damarlar ile. Ayrıca, nispeten derin sc enjeksiyonu yüzünden, herhangi bir yöne alımını ve dolayısıyla damar ve lenf düğümleri hiçbir görsel olabilir. Şekil 5 (a In), Bir fare enjeksiyondan sonra 5 dakika elde edildi kuyruk SC ve görüntülerin tabanında ICG 10 ul enjekte edildi. Enjeksiyon yerinde boya görüntülendi olabilir ve hiçbir lenf damarlarının ya da lenf düğümleri canlandırılabilir. Bu kimlik enjeksiyonlar önemli nedeni budur. (B) bir yara kaynaklanan anormal lenfatik damarların hayvanın ventral tarafında Görselleştirme makası ile kürk kaldırılması (doku yaralanması sitenin hayvanın sağ tarafında belirtildiği gibi) sırasında bir gün önce karşılaştı. Görüntü ICG 10 ul sonra yaklaşık 5 dakika yakalandığı her sol ve sağ tarafında kuyruk dibinde kimlik uygulanmıştır. Non-yaralı (hayvanın sol) tarafta, kasık LN görselleştirildiği gibi koltuk altı LN yukarı doğru tahliye nispeten düz efferent lenf damarı olabilir. Farenizin sağ tarafında ise, normal lenf damar yaralanması nedeniyle kesintiye ve doku onarımı (kabuklanma) nedeniyle anormal görünür oldu.


Lenfatik kontraktil fonksiyonun Şekil 6.. Nicel analizi koltuk altı LN (a) kasık LN ve popliteal LN pençe dorsal (d) enjeksiyon bölgesinden tahliye lenfatik damarların boyunca ROI seçme oluşur. Kırmızı kesikli dikdörtgen büyütülmüş bir fotoğraf ((a) inset) floresan damar boyunca ROI seçimi göstermektedir. (A) ve (d) (b) ve (e) 'de sırasıyla gösterilen sahte renk arsa ile temsil edilir, tüm kontrol bölgeleri için zamanın bir fonksiyonu olarak ortalama floresan yoğunluğu bir derleme. Pikseller boyunca floresans yoğunluğu tedirginlikler bir lenfatik ROI'ler ve ar ile yayılmakta "darbe" temsilokları ile paralel e. (B) tek bir kontrol bölgeleri 22 ve 45 için ortalama floresan yoğunluğu (c) ve ikinci bir kontrol bölgeleri 18 ve 34 için ortalama floresan yoğunluğu (e) (f) 'de gösterilmiştir gösterilmiştir. Zamanın bir fonksiyonu yayma lenf ve iki kontrol bölgeleri arasındaki geçiş zaman ve mesafe ekstraksiyon paketlerinin sicil kolaylaştırmak ((c) ve (f) 'de gösterildiği gibi) olarak floresans yoğunluğunu profilleri. İki ROI'ler onların lenf damarı boyunca konumu ve maksimum ve minimum temsil lenf yayılımı gösterilmektedir hangi netlik dayanmaktadır seçilir. Velocity iki ROI'ler ve pik floresans yoğunluğu arasındaki alınır transit zamanı arasındaki mesafe oranı olarak hesaplanır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın


Şekil 7. Inguinal bölgeden aksiller bölgeye drene lenfatikler görselleştirmek için, kuyruk tabanı sol veya sağ tarafına enjekte. Genel olarak, sol yan görselleştirmek için, konum 5, 6, 9, 10 ya da enjekte ve sağ yan görselleştirmek için, konum 7'de 11, ya da 12 8 enjekte edilir. 4 aracılığıyla Mekanlar 1 aksiller bölgeye inguinal bölgeden lenfatik drenaj görselleştirmek için optimum alımı için kuyruk üzerinde çok daha alt düzeyde olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz farelerde etiketli lenf damarlarının görüntüleri yakalamak için özel, küçük hayvan NIRF görüntüleme sistemi kullanın. Lenf dolaşımı filmleri oluşturmak için, 300 veya daha fazla görüntü alınır. Filmlerde lenfatiklerin fonksiyonel analizi için, iki veya daha fazla ROI'ler manuel lenf damarı boyunca çizilir. İB'nin boyutları her bir kap için sabit tutulur ve yaklaşık olarak damar çapı vardır. Bütün hayvanlar uzaysal çözünürlüğü 100 mikron veya daha az olan floresan lenfatik damarların tasvir de, daha ince çözünürlükte görüntü için bir macrolens 10 uygulanabilir. Anatomik referans için beyaz ışık görüntüleri aynı zamanda düşük güç lambası kullanılarak elde edilebilir. Bu görüntüleme ajanları sonra farklı uyarma / floresan emisyonu spektrumları, yukarıda tarif edilen filtre ile başka bir floresan boyalar oluşmaktadır ise görüntü performansı sağlamak için değiştirilmiş olması gerekir, ve ajan da dozaj olarak ayarlanması gerekebilir not edilmelidir. Ayrıca, eksitasyon dalga boyu le olup olmadığını750 nm den ss, ardından otofloresans, neden olabilir arka plan sinyali artacaktır, ve görüntüleme duyarlılığı azaltacaktır. Buna ek olarak, çözelti içinde ajanlar dengesizlik böyle siyanin 7 (Cy7) gibi bazı NIRF boyalar kullanımını engelleyebilir.

Uygun enjeksiyon yeri seçimi lenfatik damarların çalışılmaktadır hangi bağlıdır. Şekil 7 'de gösterildiği gibi kasık bölgesinden koltuk altında tahliye lenfatik görselleştirmek için, bir kuyruk tabanının sol veya sağ tarafına enjekte etmek gerekir. Saray bölgeden tahliye lenfatikler görselleştirmek için, arka pençe dorsalinde enjekte etmek gerekir. Vücut ısısı değişen tutarsız Lenfatik fonksiyonu neden olabilir gibi, normal sınırlarda hayvanın vücut sıcaklığı tutmak için önemlidir. Ayrıca, çünkü çoğu CCD sınırlı dinamik aralık, enjeksiyon siteleri floresan ışık thereb engellemek için siyah kağıt ile kaplı olmalıdıry lenf damarları drene dimmer görselleştirme sağlayan. Görüntüleme odasında ışıkları floresan bandında ışık emisyonu nedeniyle istenmeyen arka plan sinyallerini azaltmak için karanlık bir odada yapılmalıdır. Görüntüleme ışığı geri yansıma azaltmak için yapılırken hayvan da siyah bir arka plan üzerinde yatan gerekir.

NIRF lenfatik görüntüleme lenfatik hastalıklar ve hastalık veya yaralanma bakımından nasıl lenfatik mimari ve fonksiyon değişiklikleri daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir. Örneğin, araştırma ekibi hayvanların 6,15 lenfatik fenotipleme sağlamak ve kanser metastazları 10 ile lenfatik fonksiyon ve mimari değişiklikleri algılamak için küçük hayvanlarda NIRF görüntüleme kullandı. İnsanlarda, tekniği, lenfödem 2 erken belirtilerini saptamaya lenfödem tedavisi 13,14,16 ve kalıtsal lenfatik bozukluklar fenotipi aile üyeleri tepki değerlendirmek için kullanılır olmuştur. Ancak, non-invaziv vİnsanlarda derin lenfatik (> 3 cm) isualization doku içinde ışık yayılımı ile sınırlıdır. Derinliği 3 cm kadar lenfatik yapıların Görüntüleri domuz 9 ve insan görüntüleme elde edilmiştir. İnsanlarda, MRG ve dinamik lenfosintigrafi enjeksiyon sitesinden hastalığı lenf düğümlerine kontrast madde transit zamanı ölçmek için kullanılmıştır. Ancak, onlar kolayca NIRF ile görüntülenebilir lenfatik tahrik olayları görselleştirmek için yeterli zamansal ve uzamsal çözünürlük eksikliği. Buna ek olarak, sağlıklı lenfatiklerin kontrast eksikliği MRG nedeniyle ile görüntülenebilmektedir değildir. NIRF görüntüleme konfokal, multiphoton mikroskopi ve intravital görüntüleme aksine, non-invaziv. Genellikle konfokal ve multiphoton mikroskopi teknikleri kısmen veya tamamen rezeke edilen doku kullanmaktadır. Scintographic yöntemleri radyonüklidler ve bazen küçük damar kanülasyon kullanımını gerektirmektedir. Lenfatikler görselleştirmek için başka bir yöntem fare sırasında intravital görüntüleme içerirötenazi ve dermis Evans mavisi boyasının ID enjeksiyonu takiben geri çekilir. Bununla birlikte, bu yöntem ya da işlevsel uzunlamasına görüntüleme 17,18 sağlamaz. LN metastazı Siemens Inveon PET / BT kullanılarak görüntülenebilir, ancak bu tekniği lenfatik yapı veya işlev 19 görüntülenmesine izin vermez.

Yazarların tavsiye ne de herhangi bir özel ticari görüntüleme cihazı onaylamaz yok iken, bizim deneyim ışık kaynağı ve optik filtre seçimi cihazın hassasiyetini belirler tek ve en önemli faktör olabileceğini gösterir. Gibi Zhu ve ark., Boya, düşük yoğunlukta başarılı bir şekilde görüntülenmesi için, ışık kaynağı ile optik filtreler 20 transmisyon spektrumu emisyon spektrumunu arasında minimum çakışma olması gerekir. Bir başka önemli bir göz ikinci NIRF boya absorpsiyon ve emisyon spektrumudur. Bu yazıda ICG ve cABD-IRDye800 benzer SPE varctra ve böylece tarif edilen dalga boyu lazer diyodu ve filtre kombinasyonları her biri için kullanılabilir, başka bir boya emmek ve / veya bu dalga boyunda floresan neden olan kullanılacaksa Bununla birlikte, ışık kaynağının dalga boyu ve optik filtreler olmalıdır ICG birçok uygulama için yeterli olabilir. buna göre ayarlanır, ve zaten FDA onaylı olduğunu. NIRF-cABD İnsanlarda kullanım için FDA onaylı değil, hayvan görüntüleme için yararlı olabilir. ICG hedefleme kısımlara bağlanması için kalıntılar bağlayan kimyasal içermiyor gibi NIRF-cABD şekilde diğer floresan ajanların, geliştirilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var, ama bazı yazarlar bir patent listelenir.

Acknowledgements

NIH R01 CA128919 ve NIH R01 HL092923: Bu çalışma Eva Sevick için aşağıdaki bağışları ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Indocyanine green (ICG) Patheon Italia S.P.A. NDC 25431-424-02 Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL)
Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) Bachem Custom Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL)
IRDye800 Li-COR IRDye 800CW Reconstitute according to manufacture's instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations
Sterile Water Hospira, Inc., Lake Forest, IL NDC 0409-4887-10
NAIR Church Dwight Co., Inc. Local Stores www.nairlikeneverbefore.com
Imaging System (components below) Center for Molecular Imaging N/A Custom-built in our laboratories.
Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera Princeton Instruments, Trenton, NJ Photon Max 512
Nikon camera lens Nikon Inc., Melville, NY Model No. 1992, Nikkor 28mm
Optical filter Andover Corp., Salem,NH ANDV11333 Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens
785-nm laser diode Intense Ltd, North Brunswick, NJ 1005-9MM-78503 500 mW of optical output
Collimating optics Thorlabs, Newton, NJ C240TME-B Collimates laser output prior to cleanup filter
Clean-up filter Semrock, Inc., Rochester, NY LD01-785/10-25 Removes laser emission in fluorescence band
Optical diffuser Thorlabs, Newton, NJ ED1-C20 Diffuses the laser over the animal
V++ Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand Version 5.0 Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/
Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis
ImageJ National Institutes of Health, Bethesda, MD Most current version available Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks, Natick, MA Version 2008a or later http://www.mathworks.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
  2. Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
  3. Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
  4. Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
  5. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
  6. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
  7. Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
  8. Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. (2011).
  9. Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
  10. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
  11. Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
  12. Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
  13. Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
  14. Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
  15. Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
  16. Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
  17. Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
  18. Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
  19. Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
  20. Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats