No invasiva imágenes ópticas de la vasculatura linfática de un ratón

Published 3/08/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Recientemente desarrollados utilizando técnicas de imagen de fluorescencia en el infrarrojo cercano (NIRF) puede ayudar a dilucidar el papel del sistema linfático juega en la metástasis del cáncer, la respuesta inmune, la reparación de heridas, y otras enfermedades asociadas linfático.

Cite this Article

Copy Citation

Robinson, H. A., Kwon, S., Hall, M. A., Rasmussen, J. C., Aldrich, M. B., Sevick-Muraca, E. M. Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse. J. Vis. Exp. (73), e4326, doi:10.3791/4326 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

El sistema linfático vascular es un componente importante del sistema circulatorio que mantiene la homeostasis de fluidos, proporciona la vigilancia inmune, y media la absorción de grasas en el intestino. Sin embargo, a pesar de su función crítica, existe una comprensión relativamente poco de cómo funciona el sistema linfático se adapta a servir a estas funciones en la salud y la enfermedad 1. Recientemente, hemos demostrado la capacidad de la arquitectura dinámicamente imagen linfático y los ganglios "bombeo" acción en sujetos humanos normales, así como en las personas que padecen disfunción linfática mediante la administración de un rastro en el infrarrojo cercano fluorescente (NIRF) colorante y una costumbre, Gen III- intensificado sistema de imágenes 2-4. NIRF imágenes mostraron cambios dramáticos en la arquitectura linfático y la función con la enfermedad humana. Aún no está claro cómo se producen estos cambios y nuevos modelos animales se están desarrollando para dilucidar su base genética y molecular. En este protocolo, se presenta linfático NIRF, salameda animal de formación de imágenes utilizando 5,6 verde de indocianina (ICG), un colorante que se ha utilizado durante 50 años en los seres humanos 7, y un NIRF marcada con colorante cíclico dominio de unión de albúmina (CABD-IRDye800) péptido que se une preferentemente a la albúmina humana y de ratón 8 . Aproximadamente 5,5 veces más brillante que ICG, Abd-IRDye800 tiene un perfil linfático autorización similar y se puede inyectar en dosis más pequeñas de ICG para lograr suficientes señales NIRF para formación de imágenes 8. Debido a que ambos se unen CABD-IRDye800 ICG a la albúmina y en el espacio intersticial 8, ambas pueden representar el transporte de proteínas en activo y dentro de los vasos linfáticos. Intradérmica (ID) inyecciones (l 5-50) de ICG (645 mM) o CABD-IRDye800 (200 mM) en solución salina y se administra a la cara dorsal de cada pata trasera y / o el lado izquierdo y derecho de la base de la cola de un ratón isoflurano anestesia. La concentración de colorante resultante en el animal es 83-1,250 mg / kg de ICG o 113-1,700 mg / kg paraCABD-IRDye800. Inmediatamente después de las inyecciones, las imágenes linfático funcional se lleva a cabo durante un máximo de 1 h usando un personalizado, un animal pequeño NIRF sistema de formación de imágenes. Resolución espacial Whole animales pueden representar los vasos linfáticos fluorescentes de 100 micrones o menos, y las imágenes de las estructuras de hasta 3 cm de profundidad pueden ser adquiridos 9. Las imágenes se adquieren mediante V + software + y analizados mediante el software ImageJ o MATLAB. Durante el análisis, regiones consecutivas de interés (ROIs) que abarca todo el diámetro del recipiente se dibujan a lo largo de un vaso linfático dado. Las dimensiones de cada retorno de la inversión se mantienen constantes para un buque determinado y la intensidad NIRF se mide para cada ROI para evaluar cuantitativamente "paquetes" de linfa en movimiento a través de los vasos.

Protocol

Todos los estudios con animales se realizaron de conformidad con las normas de la Universidad de Texas Health Science Center (Houston, TX), Departamento de Medicina Comparada, y el Centro de Imagen Molecular después de la revisión y aprobación del protocolo por el cuidado de su respectivo Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) o Animal Welfare Committee (AWC).

1. Preparación de los animales 24 horas antes de la Radiología

Los siguientes pasos se debe hacer (si es necesario) el día antes de exponer linfático lleva a cabo.

  1. Lugar animal en una caja de inducción con isoflurano y sosegado.
  2. Una vez que el animal se encuentra en un estado de anestesia profunda (monitorizado con la maniobra de dedo del pie-pinch), animal sedado lugar en un cojín de pañal / pelusa y la nariz posición en un cono nasal conectada a gas isoflurano.
  3. Clip todo el pelo / piel (si los hay) alrededor de la zona a explorar.
  4. Aplicar agente depilatorio (Nair) a la zona rasurada y se deja on de la piel para un máximo de 3 minutos.
  5. Suavemente limpie todo agente depilatorio con una gasa húmeda y caliente o una toalla de papel.
  6. Lave suavemente la piel con agua tibia y seque suavemente el área con una gasa o toalla de papel.
  7. Deje que los animales puedan recuperarse en una almohadilla eléctrica o bajo una lámpara de calor, y volver a su jaula.

2. Día de Imágenes

  1. Agente de formación de imágenes reconstituir con agua estéril, luego se diluye con estéril, normal (0,85%) de solución salina para alcanzar 645 mM (5 g/10 l) durante ICG o 200 mM (6,8 g/10 l) durante CABD-IRDye800. Mantener las soluciones en la oscuridad condiciones y uso dentro de las 6 horas de la reconstitución.
  2. Lugar animal en una caja de inducción con isoflurano y sosegado.
  3. Una vez que el animal se encuentra en un estado de anestesia profunda (controlado con la maniobra de punta-pinch), animal sedado lugar de costado sobre una plataforma de pañales / pelusa y la nariz posición en un cono de nariz conectada a gas isoflurano.
  4. Apague las luces (por lo que la habitación esoscuro). Si es necesario, una luz de escritorio halógeno pequeña se puede utilizar para una pequeña cantidad de luz para ver inyecciones.
  5. Usando una jeringa de insulina con una aguja de calibre 31-, inyectar ID 5 l a 50 l de ICG o CABD IRDye800-en la cara dorsal de cada pata trasera y / o en el lado izquierdo y derecho de la base de la cola, dependiendo el área de interés (véase la discusión). Cada dosis inyectada puede variar desde 0,083 hasta 1,25 mg / kg (ICG) o 0.113 a 1.7 mg / kg (CABD-IRDye800). Los volúmenes de inyección puede variar con la cepa animal y sitio de la inyección. Para los ratones atímicos, el volumen de inyección puede ser de 5 l (pata trasera) o 10 l (base de la cola). Si el animal no está en el sistema de formación de imágenes para la inyección (s), colocar al animal en el sistema de imágenes inmediatamente después de la inyección (s).
  6. Si no se observa absorción de colorante en los vasos linfáticos, paso 2,5 tendrá que repetirse según sea necesario de acuerdo al protocolo de animales.
  7. Una vez que se observan vasos linfáticos, cubra el sitio de la inyección con cinta eléctrico negro o negro paper.
  8. Adquirir imágenes linfáticos de hasta 1 hora con V + software + y un animal pequeño, NIRF sistema de imágenes. (Los animales son sedados con isoflurano y las respiraciones se supervisan mientras que las imágenes están adquiriendo.) Mientras animal pequeño, generadores de imágenes NIRF están comercialmente disponibles, utilizamos un servicio personalizado, pequeños animales NIRF sistema de imagen que consiste en un diodo láser 785-nm (1005-9mm-78503 , intenso, North Brunswick, NJ) equipado con una lente asférica (C24TME-B, Thorlabs, Newton, NJ), difusor (ED1-C20, Thorlabs) y filtro (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ) para crear un campo de excitación uniforme que ilumina el animal en una tasa de fluencia incidente de menos de 1,4 mW por centímetro cuadrado 10. Un electrón multiplicando dispositivo de carga acoplada (EMCCD, PhotonMax512, Princeton Instruments, Trenton, NJ) sistema de cámara con dos 830-nm filtros (AND11333, Andover Corp., Salem, NH) y una lente de 28-mm Nikkor (1992, Nikon, Melville, NY) se utiliza para capturar imágenes linfáticos con integración times de 200 ms para imágenes dinámicas y estáticas ms 800 para imágenes 5. Véase la figura 1 para la configuración del sistema, la tabla para obtener más detalles de cada componente, y el debate para una breve discusión de las propiedades imager clave.
  9. Deje que los animales puedan recuperarse en una almohadilla eléctrica o bajo una lámpara de calor y volver a su jaula, o la eutanasia.
  10. Analizar imágenes utilizando ImageJ o software MATLAB. Véase la Figura 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ejemplo de imágenes NIRF linfático en ratones

Cuando ICG o CABD IRDye800-ID se inyecta en la base de la cola de un ratón normal, el conjunto de vasos linfáticos entre el sitio de la inyección en la base de la cola y el ganglio linfático inguinal (LN) debe ser visualizado inmediatamente. Poco después de la inyección (unos pocos segundos a minutos), el vaso linfático entre el LN inguinal y el LN axilar debe ser visualizado como se ve en la Figura 2. Dado que los vasos linfáticos en ratones variar de animal a animal como lo hacen en los seres humanos, la variación en la arquitectura entre los animales pueden verse como se muestra en la Figura 3. Cuando ICG o NIRF CABD-ID se inyecta en la cara dorsal de la pata trasera de un ratón normal, dos vasos linfáticos de drenaje puede ser visualizado a la LN poplíteo, como se muestra en la Figura 4. En algunos casos, es difícil distinguir las dos buques debido a su estrecha proximidad entre sí.

A veces, la visualización de los vasos linfáticos se retrasa, más comúnmente debido a la inyección que se administra por vía subcutánea (SC) en lugar de ID. Cuando se dan inyecciones SC, el transporte linfático puede no ser inmediatamente visualizó como se ve en la Figura 5 (a) por el tiempo adicional necesario para el tinte para alcanzar y ser absorbidos por los capilares linfáticos en la piel. Es por esto que es importante inyectar ID en lugar de SC. En ocasiones, los vasos linfáticos anormales se observan, como se ve en la Figura 5 (b), en el área de una herida tal como una mordedura o corte de las cortadoras de cabello / piel. Temperatura corporal del animal debe mantenerse dentro del rango normal, como el cambio de la temperatura del cuerpo puede dar lugar a la función linfática inconsistente. Limitaciones de la técnica incluyen oscurecimiento de los vasos linfáticos fluorescentes por la pigmentación de la piel, la incapacidad de imagen de los conductos linfáticos torácicos profundas debidoa la luz de dispersión en el tejido, y el efecto desconocido de la anestesia en función linfática.

En general, se necesita el depósito de ID de ICG o CABD IRDye800-hasta 2 días para liberar el hígado y la vejiga, y hasta 3 días para despejar el lugar de la inyección. Cuando la señal fluorescente residual ha despejado, el protocolo de formación de imágenes puede ser repetida, permitiendo una imagen linfático longitudinal para evaluar los cambios en la arquitectura o la función de linfa después de algún tipo de intervención.

Análisis de la función linfática

Las imágenes adquiridas se pueden cargar en ImageJ o MATLAB para el análisis de datos. Constant-área, ROIs circular se seleccionan o "dibujado" a lo largo de toda la longitud de los vasos linfáticos fluorescente como se hace para formación de imágenes linfático humano y animal 10 5 como se muestra en las figuras 6 (a) y la Figura 6 (d). El ROIs se seleccionan de tal manera que su diámetro es aproximadamente el diámetro de la imagen de la fluorescenciant recipiente. La intensidad media de fluorescencia dentro de cada ROI se representa gráficamente como una función del tiempo de formación de imágenes para evaluar la velocidad de propulsión y la frecuencia de "paquetes" de colorante cargado de linfa propulsada a lo largo de los vasos linfáticos como se muestra en las figuras 6 (b) y en la Figura 6 (e ). Para evaluar la velocidad de propagación linfática y la frecuencia de propulsión linfático, dos de ROI, con claramente definido máximos o variaciones mínimas de intensidad de marcaje que representan la propagación de paquetes de linfa, se seleccionan y sus perfiles de intensidad de fluorescencia se representan gráficamente como se muestra en las Figuras 6 (c) y 6 (f). La velocidad de propagación se calcula tomando la relación de la distancia entre la ROI de dos y el tiempo de tránsito para un paquete de la linfa se propague entre ellos. Al evaluar el número de impulsos fluorescentes o "paquetes" que llegan a una ROI solo por el tiempo, la frecuencia contráctil se calcula. Aunque esta técnica proporciona el único método para ASSEfrecuencia ss propulsión y velocidad de una linfático propulsión "paquete", otros han evaluado indirectamente el transporte linfático mediante la medición del aclaramiento de depósito de un agente de imagen y por lo tanto el cálculo de las constantes de tasa de remoción 11. En metástasis de cáncer de 10 y la infección temprana, encontramos pérdida de propulsión linfático en animales. Otros reportan cambios en la contractilidad en respuesta a la artritis 12. En los seres humanos, el informe de propulsión aumentado después de los tratamientos, incluyendo el linfedema drenaje compresión neumática 13 y el drenaje linfático manual (masaje) 14.

Figura 1
Figura 1. NIRF El sistema de imagen es hecha a la medida para la imagen pequeña linfático animal. El dispositivo consta de un diodo láser de 785-nm equipado con una lente asférica, Diffuser, y filtros para crear un campo de excitación uniforme que ilumina el animal y una cámara EMCCD, lente de enfoque, y filtros ópticos para capturar imágenes de la linfa fluorescente 10.

Figura 2
Figura 2. Cuando 10 l de ICG o CABD IRDye800-ID se inyecta en la base de la cola de un ratón normal usando una aguja de calibre 31-, el conjunto de vasos linfáticos entre el sitio de la inyección en la base de la cola y el LN linfático inguinal debe ser visualizado inmediatamente. Dinámicas imágenes de fluorescencia se analizan inmediatamente después de la inyección y durante un máximo de 20 minutos después de la inyección. Poco después de la inyección (unos pocos segundos a minutos), los vasos linfáticos entre el sitio de la inyección y el LN inguinal y posteriormente a la región LN axilar se visualizan en la vista lateral. La imagen se muestra en la Figura 2 se tomó 5 min. después de la inyección wi10 º l de ICG ID en la base de la cola. El punto brillante entre las regiones inguinales y axilares es el hígado.

Figura 3
Figura 3. Dado que los vasos linfáticos en ratones variar de animal a animal como lo hacen en los seres humanos, la variación en la arquitectura entre los animales puede ser visto y es estable en el tiempo. Ratón # 124 fue inyectado con ICG en la base de la cola y la imagen inmediatamente en el día 1. El panel superior contiene la imagen obtenida en el día 1, así como una imagen obtenida 2 días más tarde (el día 3) usando el mismo ratón y la inyección / protocolo de formación de imágenes. El panel inferior contiene imágenes obtenidos de otro ratón (# 127) inyectado con ICG y día inmediatamente reflejado 1 y posteriormente la imagen sobre 3 días. Mientras que la arquitectura linfático (el patrón de los vasos linfáticos) varía entre moutilizar # 124 y # 127, las imágenes obtenidas utilizando NIRF son consistentes para cada ratón en los días 1 y 3.

Figura 4
Figura 4. Cuando l 5-10 de ICG o NIRF CABD-ID se inyecta en la cara dorsal de la pata trasera de un ratón normal, dos vasos linfáticos de drenaje debe ser visualizado a la LN poplítea. Dinámicas imágenes de fluorescencia se analizan inmediatamente después de la inyección y durante un máximo de 20 minutos después de la inyección. En algunos casos es difícil distinguir ambos vasos debido a su proximidad como se ilustra en la imagen ampliada, representada por el cuadro de líneas discontinuas. Para el ratón representativo se muestra aquí, 10 l de ICG se inyectó en el aspecto dorsal de la pata izquierda, trasera (sitio de la primera inyección) y en el lado izquierdo de la base de la cola (segundo lugar de la inyección). Esta imagen fue captured aproximadamente 2 a 3 minutos después de la primera inyección y aproximadamente 30 seg - 1 min después de la segunda inyección.

Figura 5
Figura 5. (A) Ocasionalmente visualización de los vasos linfáticos se retrasa o se deterioran, más comúnmente debido a la inyección que se administra SC en lugar de ID. Cuando 10 l de ICG o CABD IRDye800-SC se inyecta en la base de la cola de un ratón normal usando una aguja de calibre 31-, el transporte linfático no será visualizado inmediatamente debido al tiempo adicional requerido para el tinte para alcanzar y ser tomada por los capilares linfáticos en la piel. También, debido a la inyección SC relativamente profunda, puede no haber la absorción linfática y por lo tanto no visualización de los vasos y ganglios linfáticos. En la Figura 5 (a), Un ratón fue inyectado con 10 l de ICG en la base de la cola SC y las imágenes fueron adquiridas 5 min después de la inyección. El medio de contraste en el lugar de inyección pueden ser visualizados y no los vasos linfáticos o ganglios linfáticos pueden ser visualizados. Esta es la razón inyecciones ID son importantes. (B) Visualización de un lado ventral del animal de vasos linfáticos aberrantes resultantes de una herida encontrado un día antes durante la eliminación de piel con una maquinilla (sitio de daño tisular observado en el lado derecho del animal). La imagen fue capturada aproximadamente 5 min después de 10 l de ICG se administró ID en la base de la cola en cada uno de los lados izquierdo y derecho. Por no lesionado (animal de izquierda), el LN inguinal puede ser visualizado como el vaso eferente linfático relativamente recto hasta el drenaje hacia el LNS axilares. En el lado derecho del ratón, sin embargo, la vasculatura linfática normal se interrumpe debido a las heridas y parece aberrante debido a la reparación de tejidos (costras).


Análisis de la Figura 6. Cuantitativa de la función contráctil linfático consiste en seleccionar ROIs a lo largo de los vasos linfáticos que drenan a partir de (a) la LN inguinal a la LN axilar y (d) el lugar de la inyección en el aspecto dorsal de la pata a la LN poplíteo. Una imagen ampliada (inserto en (a)) del rectángulo de trazos roja ilustra la selección de ROI a lo largo del buque fluorescente. Una recopilación de intensidad media de fluorescencia como una función de tiempo para todos ROIs a partir de (a) y (d) se representa por la trama pseudo-color que se muestra en (b) y (e), respectivamente. Las perturbaciones en la intensidad de fluorescencia entre los píxeles representan una linfático "pulso" propagar a través del ROI y are paralelo a las flechas. La intensidad media de fluorescencia para ROIs solo 22 y 45 a partir de (b) se muestran en (c) y la intensidad media de fluorescencia para ROIs solo 18 y 34 a partir de (e) se muestran en (f). Perfiles de intensidad de fluorescencia como una función del tiempo (como se muestra en (c) y (f)) facilitar la identificación de los paquetes de linfa de multiplicación y de la extracción del tiempo de tránsito y la distancia entre dos regiones de interés. El ROIs dos se seleccionan basándose en parte en su ubicación a lo largo de los vasos linfáticos y la claridad con la que los máximos y mínimos que representa la propagación de la linfa se muestran. La velocidad se calcula como la relación de la distancia entre dos regiones de interés y el tiempo de tránsito que se toma entre la intensidad del pico de fluorescencia. Haga clic aquí para ampliar la figura


Figura 7. Para visualizar los vasos linfáticos de drenaje de la región inguinal a la región axilar, inyectar el lado izquierdo o derecho de la base de la cola. En general, para visualizar el lado izquierdo, se inyecta en una ubicación 5, 6, 9, o 10, y para visualizar el lado derecho, se inyecta en una ubicación 7, 8, 11, o 12. Ubicaciones 1 a 4 puede ser demasiado inferior en la cola para la absorción óptima para visualizar el drenaje linfático de la región inguinal a la región axilar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utilizamos una costumbre, un animal pequeño NIRF sistema de imagen para capturar imágenes de los vasos linfáticos marcadas en ratones. Para construir películas de movimiento linfático, 300 o más imágenes se recogen. Para el análisis funcional de los vasos linfáticos de las películas, dos o más regiones de interés son manualmente trazada a lo largo de un vaso linfático. Las dimensiones de las ROIs se mantienen constantes para cada buque y son aproximadamente el diámetro del vaso. Mientras que la resolución espacial de los animales conjunto pueden representar vasos linfáticos fluorescentes de 100 micrómetros o menos, una macrolens para imágenes de resolución más fina se puede emplear 10. Blanco Las imágenes en luz como referencia anatómica también puede ser adquirida mediante una lámpara de bajo consumo. Cabe señalar que si los agentes de formación de imágenes se componen de otros tintes fluorescentes con excitación diferente / espectros de emisión de fluorescencia, a continuación, los filtros descritos anteriormente debe ser alterado para mantener el rendimiento de formación de imágenes, y la dosis de agente puede ser necesario ajustar también. Además, si la longitud de onda de excitación es de Less de 750 nm, entonces autofluorescencia puede resultar, señal de fondo se incrementará, y sensibilidad de imagen disminuirá. Además, la inestabilidad de los agentes en solución puede impedir el uso de algunos de los colorantes NIRF, tales como cianina 7 (Cy7).

La selección del sitio de inyección apropiado dependerá de los vasos linfáticos que están siendo estudiados. Para visualizar los vasos linfáticos de drenaje de la región inguinal a la región axilar, será necesario para inyectar el lado izquierdo o derecho de la base de la cola, como se muestra en la Figura 7. Para visualizar los vasos linfáticos que drenan desde la región palaciego, tendrá que inyectar la cara dorsal de la pata trasera. Es esencial para mantener la temperatura corporal del animal dentro del rango normal, como el cambio de la temperatura del cuerpo puede dar lugar a la función linfática inconsistente. Además, debido a la limitada gama dinámica de la mayoría de los CCDs, los sitios de inyección se deben cubrir con papel negro para bloquear thereb luz fluorescentey permitiendo la visualización de los vasos linfáticos de drenaje atenuador. De imagen se debe realizar en una habitación oscura para reducir las señales de fondo no deseados debido a la emisión de luz en la banda de fluorescencia de las luces de la habitación. El animal también debe de estar tumbado sobre un fondo negro mientras que las imágenes se realiza para reducir la retrodispersión de luz.

Imágenes NIRF linfático puede permitir una mejor comprensión de las enfermedades linfáticas y cómo linfáticos Cambios en la arquitectura y la función con respecto a la enfermedad o lesión. Por ejemplo, el equipo de investigación ha utilizado NIRF formación de imágenes en animales pequeños para proporcionar fenotipificación linfático de animales de 6,15 y para detectar cambios en la función linfática y la arquitectura con metástasis de cáncer 10. En los humanos, la técnica se ha utilizado para detectar signos tempranos de linfedema 2, valorar la respuesta al tratamiento del linfedema 13,14,16, y los miembros de la familia con fenotipo trastornos linfáticos hereditarios. Sin embargo, no invasivo visualization de linfáticos profundos (> 3 cm) en humanos es limitada por la dispersión de luz en el tejido. Las imágenes de las estructuras linfáticas de hasta 3 cm de profundidad se han adquirido en los cerdos 9 y de imagen humana. En los seres humanos, linfoescintigrafía MRI dinámica y se han utilizado para cuantificar el tiempo de tránsito del agente de contraste desde el sitio de la inyección a los ganglios linfáticos en la enfermedad. Sin embargo, carecen de la suficiente resolución temporal y espacial para visualizar los eventos de propulsión linfáticos fácilmente captadas con NIRF. Además, linfáticos sanos no son visualizadas con MRI, debido a la falta de contraste. NIRF formación de imágenes es no invasivo, a diferencia de confocal, microscopía multifotónica, y formación de imágenes intravital. Técnicas de microscopía confocal y multifotónica típicamente utilizar tejido parcialmente o totalmente resecado. Scintographic métodos requieren el uso de radionucleidos y la canulación recipiente veces menor. Otro método para visualizar los vasos linfáticos implica formación de imágenes intravital durante la cual el ratón essacrificados y la dermis se tira hacia atrás después de la inyección ID de colorante azul de Evans. Sin embargo, este método no proporciona imágenes funcionales o longitudinal 17,18. Metástasis de LN se pueden visualizar utilizando un Siemens Inveon PET / CT, sin embargo, esta técnica no permite la visualización de estructura linfática o función 19.

Si bien los autores no recomienda ni sugiere ningún dispositivo específico de imagen comercial, nuestra experiencia indica que la elección de la fuente de luz y filtros de luz puede ser el factor más importante que determina la sensibilidad del dispositivo. Según lo descrito por Zhu et al., Para formación de imágenes con éxito de bajas concentraciones de colorante, debe existir una mínima superposición entre el espectro de emisión de la fuente de luz y el espectro de transmisión de los filtros ópticos 20. Otra consideración importante es el espectro de absorción y emisión del colorante NIRF utilizado. En este documento ICG y CABD IRDye800 espe-tienen similaresctra y así la longitud de onda de láser de diodo descrito y combinaciones de filtros se pueden utilizar para cada uno, sin embargo, si otro colorante se va a utilizar, que no absorba y / o fluorescencia a estas longitudes de onda, la longitud de onda de la fuente de luz y los filtros ópticos debe ser ajustarse en consecuencia. ICG puede ser suficiente para muchas aplicaciones, y ya está aprobada por la FDA. NIRF-CABD no está aprobado por la FDA para uso en seres humanos, pero pueden ser útiles para obtener imágenes de los animales. ICG no tiene residuos de enlace químico para la fijación de restos de direccionamiento, agentes fluorescentes para otros, tales como NIRF-CABD, están siendo desarrollados.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar, pero algunos autores se muestran en una patente.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: a Eva Sevick NIH R01 CA128919 y NIH R01 HL092923.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Indocyanine green (ICG) Patheon Italia S.P.A. NDC 25431-424-02 Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL)
Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) Bachem Custom Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL)
IRDye800 Li-COR IRDye 800CW Reconstitute according to manufacture's instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations
Sterile Water Hospira, Inc., Lake Forest, IL NDC 0409-4887-10
NAIR Church Dwight Co., Inc. Local Stores www.nairlikeneverbefore.com
Imaging System (components below) Center for Molecular Imaging N/A Custom-built in our laboratories.
Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera Princeton Instruments, Trenton, NJ Photon Max 512
Nikon camera lens Nikon Inc., Melville, NY Model No. 1992, Nikkor 28mm
Optical filter Andover Corp., Salem,NH ANDV11333 Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens
785-nm laser diode Intense Ltd, North Brunswick, NJ 1005-9MM-78503 500 mW of optical output
Collimating optics Thorlabs, Newton, NJ C240TME-B Collimates laser output prior to cleanup filter
Clean-up filter Semrock, Inc., Rochester, NY LD01-785/10-25 Removes laser emission in fluorescence band
Optical diffuser Thorlabs, Newton, NJ ED1-C20 Diffuses the laser over the animal
V++ Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand Version 5.0 Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/
Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis
ImageJ National Institutes of Health, Bethesda, MD Most current version available Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks, Natick, MA Version 2008a or later http://www.mathworks.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
  2. Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
  3. Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
  4. Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
  5. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
  6. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
  7. Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
  8. Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. (2011).
  9. Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
  10. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
  11. Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
  12. Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
  13. Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
  14. Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
  15. Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
  16. Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
  17. Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
  18. Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
  19. Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
  20. Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats