Bestemmelse af gas-fase syrer af Oligopeptider

1Department of Chemistry, University of the Pacific
Published 6/24/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Fastsættelsen af ​​gas-fase syrer af cystein-holdige oligopeptider beskrives. Eksperimenterne udføres ved hjælp af en tripel kvadrupol massespektrometer. De relative syrer af peptiderne måles ved hjælp kollision-induceret dissociation eksperimenter, og de kvantitative syrer bestemmes ved hjælp af de udvidede Cooks kinetisk metode.

Cite this Article

Copy Citation

Ren, J., Sawhney, A., Tian, Y., Padda, B., Batoon, P. Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides. J. Vis. Exp. (76), e4348, doi:10.3791/4348 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Aminosyrerester placeret på forskellige positioner i foldede proteiner ofte udviser forskellige grader af syrer. For eksempel er en cysteinrest placeret ved eller nær N-terminalen af en helix ofte mere sure end ved eller nær C-terminalen 1-6. Selv omfattende eksperimentelle undersøgelser af syre-base egenskaber af peptider er blevet foretaget i den kondenserede fase, navnlig i vandige opløsninger 6-8, er resultaterne ofte kompliceret af solventeffekter 7. Faktisk er de fleste af de aktive steder i proteiner placeret nær den indre region, hvor opløsningsmiddel virkninger er blevet minimeret 9,10. For at forstå iboende syre-base egenskaber af peptider og proteiner, er det vigtigt at udføre undersøgelserne i et opløsningsmiddel-frit miljø.

Vi præsenterer en metode til at måle syrer af oligopeptider i gasfase. Vi bruger en cystein-holdige oligopeptid, Ala 3 CysNH 3 CH), som modelforbindelse. Målingerne er baseret på veletablerede udvidet Cooks kinetisk metode (Figur 1) 11-16. Forsøgene udføres under anvendelse af en triple-kvadrupol massespektrometer interface med en elektrospray (ESI) ionkilde (figur 2). For hvert peptid stikprøve flere referencepunkter syrer valgt. Referenceværdierne syrer er strukturelt lignende organiske forbindelser med kendte gas-fase syrer. En opløsning af blandingen af ​​peptidet og en reference syre indføres i massespektrometret, og en gas-fase proton-bundne anioniske klynge af peptid-henvisning Syren dannes. Proton-bundet cluster masse isoleres og efterfølgende fragmenteret via kollision-induceret dissociation (CID) eksperimenter. Det resulterende fragment ion mængderne er analyseret ved en relation mellem syrer og klyngen ion dissociation kinetik. Gasfase-surhedsgrad peptidet er derefter obtaiNed ved lineær regression af termo-kinetiske plots 17,18.

Fremgangsmåden kan anvendes til en bred vifte af molekylære systemer, herunder organiske forbindelser, aminosyrer og deres derivater, oligonukleotider og oligopeptider. Ved at sammenligne gas-fase syrer målt eksperimentelt med disse beregnede værdier for forskellige afarter kan konformationelle virkninger på syrer evalueres.

Introduction

De syrer af aminosyrerester er blandt de vigtigste termokemiske egenskaber, der påvirker strukturer, reaktivitet, og den folde-udfoldning processer af proteiner 9,19. Individuelle aminosyrerester ofte viser forskellige effektive syrer afhængigt af deres placeringer i proteiner. Ofte især resterne placeret på de aktive steder udviser signifikant forstyrret syrer. Et sådant eksempel er cysteinresten bosiddende i de aktive steder af thioredoxin super-familie af enzymer 20,21. Den aktive sted cystein er usædvanligt sure sammenlignet med dem i udfoldede proteiner 3-5. Det er blevet foreslået, at den spiralformede konformation kan have et væsentligt bidrag til den usædvanlige syreindhold. Der er omfattende eksperimentelle undersøgelser af syre-base egenskaber af peptider udføres i opløsninger, især i vandige opløsninger 2,6-8. Resultaterne blev ofte kompliceret af solventeffekter7.. Faktisk er de fleste af de aktive steder i proteiner placeret nær den indre område hvor solventeffekter minimeres 9,10.

For at forstå iboende syre-base egenskaber af peptider og proteiner, er det vigtigt at udføre undersøgelserne i et opløsningsmiddel-frit miljø. Her introducerer vi et massespektrometri-baseret metode til bestemmelse af den gas-fasen surhedsgrad. Den fremgangsmåde er benævnt udvidede Cooks kinetiske metode. Denne metode er blevet anvendt med succes til en bred vifte af kemiske systemer til bestemmelse af forskellige termokemiske egenskaber, såsom gas-fase syreindhold, proton affinitet, metalionen affinitet, elektron affinitet, og ioniseringsenergi 11-15, 22-26. Vi har anvendt denne metode til at bestemme gas-fase syrer af en serie af oligo cysteinholdige polyalanin og cystein-polyglycin peptider 17,18,27. Disse undersøgelser viser, at den N-terminale cystein peptides er betydeligt mere sure end de tilsvarende C-terminale dem. De høje syrer i det tidligere skyldes sandsynligvis de spiralformede konformationelle virkninger hvor thiolat anion kraftigt stabiliseret ved interaktion med helix makro-dipol. På grund af den ikke-flygtige og termisk labile karakter af peptider, er den kinetiske metode den mest praktiske fremgangsmåde til rådighed på nuværende tidspunkt at fremstille rimeligt nøjagtige syre-base termokemiske mængder af peptider 28.

Den generelle opbygning og ligningen forbundet med den kinetiske metode er vist i figur 1.. Bestemmelsen af gas-fasen surhedsgrad et peptid (AH) starter med dannelsen af en række proton-bundne klynge anioner, [A • H • A i] ¯ (eller [A ¯ • H +Ai ¯] ¯), i ionkilden region i massespektrometret, hvor A ¯ og A i ¯ er deprotonerede former af peptidet ogreference syrer, hhv. Referenceværdierne syrer er organiske forbindelser med kendte gas-fase syrer. Referencetallene syrer skal have strukturer, der svarer til hinanden (men ikke nødvendigvis svarer til peptidet). Ligheden mellem strukturer mellem reference-syrer sikrer ligheden mellem de entropier af deprotonation blandt dem. Proton-bundne klynge anioner masse udvalgt og collisionally aktiveret og derefter dissocieret ved hjælp kollision-induceret dissociation (CID) eksperimenter til opnåelse af de tilsvarende monomere anioner, A ¯ og A i ¯, med hastighedskonstanterne for k og k I, henholdsvis, er vist i figur 1a. Hvis sekundære fragmenteringer er ubetydelige, den overflod forholdet mellem CID fragmentioner, [A ¯] / [A i ¯], udgør et omtrentligt mål for forholdet mellem ratekonstanter, k / k I. Under den antagelse, at der ikke er omvendt aktiveretion barrierer for både dissociation kanaler, CID produkt ion forgreningsforhold, ln [A ¯] / [A i. ¯], vil blive lineært korreleret til gasfase-surhed af peptid (Δ syre H) og de ​​af reference-syrer (Δ syre H i), som vist i figur 1b. I denne ligning er Δ acid H avg den gennemsnitlige gas-fase surhedsgrad reference syrer, Δ (Δ S) er den entropi sigt (hvilket kan antages konstant, hvis reference syrer er strukturelt ligner hinanden), R er universel gas konstant, og T eff er den effektive temperatur af systemet. Den effektive temperatur er en empirisk parameter, der afhænger af flere eksperimentelle variabler, herunder kollisionen energi.

Værdien af ​​gasfase-syreindhold bestemmes ved at konstruere to sæt termo-kinetiske plots. Det første sæt er obopretholdt ved at plotte ln ([A ¯] / [A i ¯]) mod Δ acid H i - Δ syre H avg, som vist i figur 4a. Lineær regression vil give et sæt af lige linjer med skråningerne af X = 1 / RT EFF og aflytninger af Y = - [Δ acid H - Δ acid H avg] / RT EFF - Δ (Δ S) / R. Det andet sæt af grunde opnås ved at plotte de resulterende opfanger (Y) fra det første sæt mod de tilsvarende skråninger (X), som vist i figur 4b. Lineær regression producerer en ny linje med en hældning på Δ acid H - Δ acid H avg og en skæring med Δ (Δ S) / R. Værdien af Δ acid H opnås derefter fra hældningen og entropi sigt Δ (Δ S), fås fraskæringspunktet.

Eksperimenterne udføres ved hjælp af en tripel kvadrupol massespektrometer grænseflader til en elektrospray (ESI) ionkilde. En skematisk diagram af massespektrometer er vist i figur 2.. De CID forsøg udføres efter masse at vælge proton-bundne klynge anioner med den første kvadrupol enheden og tillade dem at gennemgå kollisioner med argonatomer lækket ind kollisionen kammer, som holdes ved et tryk på omkring 0,5 mTorr. Dissociationen produkt ioner masse analyseres med den tredje quadrupol enheden. CID spektre optages på flere kollision energier med m / z interval bred nok til at dække alle mulige sekundære fragmenter. CID produkt ionintensiteter måles ved at sætte instrumentet i den valgte reaktion overvågning (SRM) tilstand, hvor scanningen er fokuseret på udvalgte produktområder ioner. CID eksperimenter udføres på fire forskellige kollision energier, svarende tilcenter-of-masse energi (E cm) på 1,0, 1,5, 2,0, og 2,5 eV, hhv. Centrum-of-masse energi beregnes ved ligning: E cm = E lab [m / (M + m)], hvor E lab er kollision energi i laboratoriet rammen, m er massen af argon og M er massen af ​​proton-bundne klynge ion.

I denne artikel bruger vi oligopeptidet Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) som model compound. C-terminalen er amideret, og thiolgruppe (SH) i cysteinresten vil være den sure side. Udvælgelsen af ​​egnede referenceprodukter syrer er afgørende for en vellykket måling af gas-fasen surhedsgrad. Den ideelle reference-syrer er strukturelt ligner (på hinanden) organiske forbindelser med veletablerede gasfaseeksperimenter surhedsgrad værdier. Referenceværdierne syrer skal have surhedsgrad værdier tæt på at af peptider. For peptid A 3 CH, halogenerede seks carboxylic syrer er valgt som reference syrer. De seks referencepunkter syrer er chloreddikesyre (MCAH), bromeddikesyre (MBAH), difluoreddikesyre (DFAH), dichloreddikesyre (DCAH), dibromoacetic syre (DBAH), og trifluoreddikesyre (TFAH). To af dem, vil DFAH og MBAH, anvendes til at illustrere protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Klargøring af prøven Solutions

  1. Først forberede stamopløsninger af peptidet og seks referencepunkter syrer ved hjælp af en blandet opløsningsmiddel af methanol og vand i et 1:1 volumenforhold. Stamopløsningerne bør have en koncentration på ca 10 -3 M.
  2. Afvej 1 mg af den faste peptid prøve, A 3 CH, i et 1,5 ml Eppendorf-rør, og der tilsættes 1,0 ml blandet opløsningsmiddel af methanol og vand, og blandes med en hvirvel.
  3. Afvej 1 mg difluoreddikesyre (DFAH) og tilsæt 1,0 ml af det blandede opløsningsmiddel af methanol og vand, og blandes med en hvirvel.
  4. Brug samme fremgangsmåde til at gøre stamopløsninger for de øvrige fem henvisningen syrer chloreddikesyre (MCAH) bromeddikesyre (MBAH) dichloreddikesyre (DCAH) dibromoacetic syre (DBAH) og trifluoreddikesyre (TFAH).
  5. Trække omkring 50 pi af peptid stamopløsning i en 1,5 ml Eppendorf-rør, og trækker omkring 50 ul af stamopløsning af DFAH i samig Eppendorf-rør. Fortynd den blandede opløsning med 900 ul af blandet opløsningsmiddel af methanol og vand for at opnå en endelig koncentration på omkring 10 -4 M. Denne fortyndede opløsning vil blive brugt som prøveopløsning til massespektrometri målinger. Det faktiske forhold af peptidet til reference syre samt den endelige koncentration af prøveopløsningen vil blive justeret på grundlag af de ionsignalet mængderne observeret i massespektrometeret.
  6. Brug samme fremgangsmåde til fremstilling af prøveopløsninger af peptidet med de andre fem reference-syrer.

2.. Massespektrometri Måling 1: Proton-bundet Cluster Ion Formation

  1. Det første trin af massespektrometri målingen er at generere stabile proton-bundne klynge ioner af peptidet med en henvisning syre.
  2. Sæt instrumentet i negativ ion MS tilstand med ESI nål spænding ved -4.5 kV, den kapillære spænding på omkring -35 V og tørringsgassen temperaturenholdes ved 150 ° C. Indstil Q1 topbredden og Q3 topbredden både kalibreret skala (Toppens bredde er et instrument parameter, der kan bruges til at justere opløsningen af ​​toppene. Den "kalibreret skala" indstillingen gør det muligt at vise smalle toppe for bedre topadskillelse ). Den kapillære spænding og tørregassen temperaturen kan justeres for at forbedre de observerede ion forekomster.
  3. Indgyde omkring 0,5 ml af prøveopløsningen af ​​peptid-DFAH i en 1 ml Hamilton sprøjte og forbind sprøjten med ESI nål indløb ved hjælp PEEK slangen. Derefter placere sprøjten på sprøjten pumpen. Tænd sprøjtepumpen at tilføre prøveopløsningen i ESI nål med strømningshastigheden ved 10 ul / min.
  4. Tænd ESI nål spænding at aktivere ESI processen. Tænd detektoren. En Massespektret display skal overholdes i profilen mode. Hvis displayet er i centroid tilstanden skifte til profilen mode. Se proton-bundet cluster iondannelse ved styre projekng toppen ved m / z 428. Signalet overflod af klyngen ion kan justeres ved finjustering instrumentet. En vigtig parameter er den kapillære spænding. Man kan manuelt ændre den kapillære spænding (typisk i området fra -20 til -50 V) for at maksimere overflod af toppen ved m / z 428.

3.. Massespektrometri Måling 2: CID Bracketing Experiments

  1. Det næste skridt er at udføre CID bracketing eksperiment.
  2. Når den overflod af klyngen ion når den ønskede værdi (omkring 100 mV), skifte instrumentet til MS / MS-tilstand. I denne tilstand,. Q1 fungerer som en masse filter til at isolere klynge ion, Q2 fungerer som kollisionen cellen, og Q3 fungerer som det masseanalysator
  3. Indstil kollisionen gas (argon, i dette tilfælde) tryk ved 0,5 mTorr og kollisionen energi på 17 eV. Tre toppe skal overholdes i massespektret displayvinduet. Toppen ved m / z 428 svarer til klyngen ion, [DFA • H • A 3 CS] ¯. De to toppe ved m / z 332 og m / z 95 svarer til den deprotonerede peptid (A 3 CS ¯) og deprotonerede difluoreddikesyre (DFA ¯), hhv. Den mindre top ved m / z 298 er et sekundært fragment fra deprotonerede peptid. Anskaf en CID frekvenser til 2 min, figur 3a.
  4. Udføre lignende CID eksperimenter og erhverve en CID frekvenser til prøveopløsningen af peptidet med bromeddikesyre (MBAH), figur 3b.
  5. Udføre lignende CID eksperimenter og erhverve CID spektre for testopløsningen af ​​peptidet med alle de andre reference-syrer. Den resulterende CID spektre vil være kvalitativt til figur 3a og 3b, men de m / z-værdier og de ​​relative tophøjder vil være anderledes.

4.. Massespektrometri Måling 3: Kinetic Method

  1. Det sidste trin er at erhverve den SRM spektre.
  2. Skift spektret display tyngdepunkt, og instrumentet indstilles til den valgte reaktion overvågning (SRM) mode. Hold m / z 428, da den isolerede ion af den første kvadrupol (Q1), og udfyld fire masser (masse-til-ladningsforhold), der skal overvåges af den tredje kvadrupol (Q3). De fire Masserne er m / z 428 (klyngen ion), m / z 332 (peptidet ion), m / z 298 (fragmentet af peptidet ion), og m / z 95 (DFA ¯ ion). Hold kollisionen gastryk på 0,5 mTorr.
  3. Sæt kollisionsenergi til 11,7 eV og erhverve spektre for 5 min.
  4. Skift kollisionsenergi til 17,6 eV og erhverve spektre for 5 min.
  5. Skift kollisionsenergi til 23,4 eV, og 29,3 eV, og erhverve de spektre ved begge kollision energier i 5 min.
  6. Udføre lignende målinger til peptidet med alle de andre reference-syrer.

5.. Dataanalyse

  1. Kopier værdierne af de ionintensiteter fra all SRM spektre på et Excel-regneark.
  2. Beregn CID produkt ion forgreningsforhold, ln ([A ¯] / [A i ¯]), målt for alle seks proton-bundne klynger på alle fire kollision energier. Sample værdier er vist i tabel 1..
  3. Afbildes værdier ln ([A ¯] / [A i ¯]) mod de værdier Δ acid H i - Δ acid H avg. Dette vil give fire parceller svarende til de data på fire kollision energier, figur 4a.
  4. Uddrag værdierne af skråninger og aflytninger ved lineær regression af de fire parceller. I dette tilfælde er de skråninger positive værdier og aflytninger er negative værdier. Giv symbolet "X" til pisterne og symbolet "Y" til aflytninger. Resultaterne er vist i tabel 2.. Gang værdier af Y med -1 og bruge symbolet Y 'for at repræsentere de positive værdier (dette giver y-aksen at disspille positive værdier). Bemærk, denne konvertering er valgfri, så længe de tilsvarende værdier bruges til at lave plottet til det næste trin.
  5. Afbildes værdier af Y 'mod de værdier af X, figur 4b. Lineær regression af plottet giver en hældning på 1.706 og en skæring med -0,536. Hældningen svarer til Δ acid H - Δ acid H avg. Værdien af Δ syre H AVG er kendt for at være 330,5 kcal / mol, som bestemmes af det sæt af udvalgte referencepunkter syrer. Værdien af gasfase-surhed af peptidet opnås derefter fra hældningen: Δ acid H (A 3 CH) = 332,2 kcal / mol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

  1. CID bracketing eksperimenter give oplysninger om de relative syrer af peptidet i forhold til de valgte referencestoffer syrer. To repræsentative CID spektre af peptidet (A 3 CH) med to reference syrer, DFAH og MBAH, er vist i figur 3.. I figur 3a ion overflod (tophøjde) af peptidet ion er svagere end DFA ¯, og i figur 3b, ion overflod af peptidet ion er stærkere end MBA ¯. De to spektre tyder på, at gasfase-surhedsgrad peptidet er i intervallet mellem syrer af disse to reference syrer.
  2. Den kvantitative værdi af gasfase-surhed af peptidet bestemmes ud fra de kvantitative CID eksperimenter. Thermo-kinetiske grunde til dissociation af de proton-bundne klynger af peptidet med de seks referencepunkter syrer er vist i figur 4. Lineær regression af parceller i henhold til termo-kinetiske relationship mellem gasfase-surhedsgrad og CID produkt ion forgrening forholdet (figur 1b) giver værdien af gasfase-surhed af peptidet A 3 CH, hvilket er 332,2 kcal / mol. Sampleværdier skråninger og opfanger er vist i tabel 1 og 2..

Figur 1
Figur 1. Den samlede ordning af den udvidede Cooks kinetiske metode. A) Ordningen for proton-bundet cluster ion dissociation. B) thermo-kinetiske forhold mellem gas-fase syrer og CID produkt ion forgrening ratio. I denne ligning er Δ acid H i gas-fasen surhedsgrad værdien af de individuelle referencemængder syrer, Δ acid H avg er enverage gasfase-surhedsgrad reference syrer, Δ syre H er gasfase-surhedsgrad for peptidet, Δ (Δ S) er den entropi sigt, R er den universelle gas konstant, og T eff er den effektive temperatur af systemet .

Figur 2
Figur 2. En skematisk tegning af en triple-kvadrupol massespektrometer. ESI er elektrosprayionisering ionkilde. 1. og 3. kvartal udgør den første og tredje quadrupol enheder, hhv. Ved udførelse CID eksperiment er de proton-bundne klynge ioner masse udvalgt af Q1, og ledes ned i kollision cellen at kollidere med argon (Ar) atomer lækket ind kollisionen celle, og det resulterende fragment-ioner analyseres ved Q3.

Figur 3 Figur 3. Den CID spektre for de proton-bundne klynge ioner af peptidet med to reference syrer, a) [DFA • H • A 3 C] ¯ og b), [MBA • H • A 3 C] ¯. Spektrene plottes som relative ion overflod mod m / z-værdi.

Figur 4
Figur 4.. Thermo-kinetiske grunde til peptidet med seks referencepunkter syrer indsamlet på fire kollision energier a) Handlingen i Y = ln ([A ¯] / [A i ¯]) mod X = Δ acid H i -. Δ acid H avg . b) plot af Y '= [Δ acid H - Δ acid H </ Em> avg] / RT EFF - Δ (Δ S) / R mod X = 1 / RT eff.

Tabel 1. Værdier af CID produkt ion forgreningsforhold, ln ([A ¯] / [A i ¯]) for cluster-ioner af peptidet med DFAH og MBAH.

HA i 11,7 eV 17.6 eV 23.4 eV 29.3 eV
MCAH 3.68 3.50 3,39 3.45
MBAH 2,83 2,65 2,45 2,24
DFAH -0,442 -0,268 -0,0921 0,167
DCAH -2,60 -2.41 -2.22 -2,13
DBAH -2,43 -2,44 -2,49 -2,60
TFAH -5,41 -5,02 -4,71 -4,44
Tabel 2. Værdier af skråningerne (X) og opfanger (Y) som følge af lineær regression af det første sæt termo-kinetiske plots.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den vellykkede måling af gas-fase surhedsgrad af et peptid i høj grad baseret på udvælgelsen af ​​egnede referencepunkter syrer. Den ideelle reference-syrer er strukturelt lignende organiske forbindelser med veletablerede gasfaseeksperimenter surhedsgrad værdier. Referencetallene syrer bør have lignende strukturer til hinanden. Dette vil sikre en tilsvarende entropi deprotonering for hver referenceopløsning syrer i sættet. Referenceværdierne syrer skal have surhedsgrad værdier tæt på de af peptider. For kortere cystein-holdige oligopeptider med amideret C-termini, halogenerede carboxylsyrer er egnede referencepunkter syrer. Et afgørende skridt i retning af en vellykket CID eksperimenter er dannelsen af ​​de stabile proton-bundne klynge ioner med stor rigdom. Stabilitet og overflod i vid udstrækning kan forbedres ved at justere forholdet mellem peptidet til referencen syre, koncentrationen af ​​prøveopløsningen, og de instrumentale forhold (såsom nålen spænding, tørringgastemperatur, og det kapillære spænding). Et afgørende instrumental betingelse er det kapillære spænding (eller kegle spænding for nogle andre typer af instrumenter). Én forsigtighed er at undgå at bruge prøve løsninger, der er alt for koncentreret.

Den beskrevne fremgangsmåde er ikke begrænset til oligopeptider. Fremgangsmåden kan anvendes til en bred vifte af molekylære systemer, herunder polære organiske forbindelser, aminosyrer og deres derivater, organometalliske forbindelser, oligonukleotider og peptid-efterligner polymerer. Ud over at bruge triple-kvadrupol massespektrometer, kan forsøget også udføres under anvendelse ionfælder og Q-TOF massespektrometre.

Peptidet anvendt i dette eksperiment blev syntetiseret i vores laboratorium ved hjælp af standard metode til fastfasepeptidsyntese 29-31. Den Rink amid harpiks blev anvendt som den faste bærer til opnåelse af amid C-terminalen. Fordelen ved Cooks kinetiske metode er, at mindre urenheder i than peptid prøve ikke påvirker surhedsgraden målinger, så længe urenheder ikke har de samme masserne som peptiderne eller referenceniveauer syrer.

De eksperimentelle målinger kan kobles med beregningsmæssige undersøgelser for at undersøge konformationelle virkninger på syrer. Computational undersøgelser giver forudsigelser af konformationer af de peptider, der matcher deres beregnede syrer. Ved at sammenligne syrer målt eksperimentelt med de beregnede værdier, kan konformationer af peptiderne evalueres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ikke noget at afsløre.

Acknowledgements

Materials

E Colli, eV

X

1 / RT eff

Y

- [(Δ acid H - Δ acid H avg) / RT EFF - Δ (Δ S) / R]

11.7 0,744 -0,728
17.6 0.700 -0,665
23.4 0,665 -0,611
29.3 0,645 -0,553
Name Company Catalog Number Comments
Mass Spectrometer Varian 1200 L and 320 L
Chloroacetic acid Sigma-Aldrich 402923
Bromoacetic acid Sigma-Aldrich B56307
Difluoroacetic acid Sigma-Aldrich 142859
Dichloroacetic acid Sigma-Aldrich D54702
Dibromoacetic acid Sigma-Aldrich 242357
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins. Proteins: Struct. Funct. Genet. 48, (2), 388-403 (2002).
  2. Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide. Protein Sci. 2, (10), 1604-1611 (1993).
  3. Takahashi, N., Creighton, T. E. On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin. Biochemistry. 35, (25), 8342-8353 (1996).
  4. Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity. Archives of Biochemistry and Biophysics. 282, (1), 110-115 (1990).
  5. Philipps, B., Glockshuber, R. Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277, (45), 43050-43057 (2002).
  6. Joshi, H. V., Meier, M. S. The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate. J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).
  7. Kortemme, T., Creighton, T. E. Ionization of cysteine residues at the termini of model α-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family. J. Mol. Biol. 253, (5), 799-812 (1995).
  8. Gallo, E. A., Gellman, S. H. Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between α-Helical Turn and β-Turn in a Model Depsipeptide. J. Am. Chem. Soc. 116, (25), 11560-11561 (1994).
  9. Honig, B., Nicholls, A. Classical electrostatics in biology and chemistry. Science. 268, (5214), 1144-1149 (1995).
  10. Warshel, A. Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins. Acc. Chem. Res. 14, (9), 284-290 (1981).
  11. Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. Thermochemical determinations by the kinetic method. Mass Spectrom. Rev. 13, (4), 287-339 (1994).
  12. Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. The kinetic method of making thermochemical determinations. J. Mass Spectrom. 34, (2), 85-92 (1999).
  13. Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides. J. Am. Chem. Soc. 115, (11), 4844-4848 (1993).
  14. Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers. J. Am. Chem. Soc. 118, (47), 11884-11892 (1996).
  15. Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications. Acc. Chem. Res. 31, (7), 379-386 (1998).
  16. Armentrout, P. B. Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11, (5), 371-379 (2000).
  17. Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4. J. Phys. Chem. A. 113, (41), 10903-10912 (2009).
  18. Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21, (4), 603-614 (2010).
  19. Fersht, A. Structure and mechanism in protein science. W.H. Freeman & Co. New York. (1999).
  20. Martin, J. L. Thioredoxin-a fold for all reasons. Structure. 3, (3), 245-250 (1995).
  21. Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 91, (3), 229-248 (2006).
  22. Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method. J. Mass Spectrom. 39, (9), 986-997 (2004).
  23. Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine. J. Phys. Chem. B. 112, (11), 3410-3419 (2008).
  24. Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid. J. Phys. Chem. A. 113, (24), 6666-6676 (2009).
  25. Zheng, X., Cooks, R. G. Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction. J. Phys. Chem. A. 106, (42), 9939-9946 (2002).
  26. Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids. Int. J. Mass Spectrom. 267, (1-3), 54-62 (2007).
  27. Tan, J. P., Ren, J. Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, (2), 188-194 (2007).
  28. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrom. Rev. 16, (4), 201-217 (1997).
  29. Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. Gutte, B. (1995).
  30. Barany, G., Merrifield, R. B. Solid-phase peptide synthesis. The Peptides. 2, Academic Press. New York. 1-284 (1979).
  31. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Chan, W. C., White, P. D. (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats