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Durchführen Vaginal Lavage, Kristallviolettfärbung und Vaginal zytologische Beurteilung für Maus Zyklusstand Staging Identification

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Summary

Hier beschreiben wir, wie auf der Bühne des murinen reproduktiven (Proöstrus Brunst, Metöstrus oder Diöstrus) durch einfache, nicht-invasive Erfassung und zytologische Beurteilung der vaginalen Abstrich Proben zu identifizieren. Wir beschreiben weiterhin, wie Vaginalzytologie zirkulierenden Hormonspiegel zugrunde liegenden Übergang durch die murine reproduktiven Zyklus widerspiegelt.

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McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389, doi:10.3791/4389 (2012).

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Abstract

Ein schnelles Mittel zur Bewertung Reproduktionsstatus bei Nagern dient nicht nur bei der Untersuchung von reproduktiven Funktionsstörungen, sondern auch für die Herstellung von neuen Mausmodellen von Krankheiten und Untersuchungen über die hormonelle Regulation der Gewebedegeneration (oder Regeneration) nach pathologischen Herausforderung erforderlich. Proöstrus Brunst, Metöstrus und Diöstrus: Der murine reproduktiven (oder Östrus-Zyklus) ist in 4 Stufen aufgeteilt. Definierte Schwankungen der zirkulierenden Spiegel der ovariellen Steroide 17-β-Östradiol und Progesteron, luteinisierendes die Gonadotropine und Follikel-stimulierende Hormone, und die luteotropic Hormons Prolaktin Signalwechsel durch diese reproduktiven Stadien. Änderungen in der Zelle Typologie im murinen Vaginalkanals spiegeln diese zugrunde liegenden endokrinen Veranstaltungen. Täglich Beurteilung des relativen Verhältnisses der kernhaltige Epithelzellen, verhornten Plattenepithelzellen und Leukozyten in Vaginalabstrichen kann zum murinen Östrus identifizierenStufen. Der Grad der Invasivität jedoch beim Sammeln diese Proben können Reproduktionsstatus verändern und eine entzündliche Reaktion hervorzurufen, die zytologische Beurteilung der Abstriche verwirren können eingesetzt. Hier beschreiben wir eine einfache, nicht-invasive Protokoll, das verwendet, um die Phase des Östrus Zyklus von einer weiblichen Maus ohne Änderung ihrer reproduktiven Zyklus zu bestimmen. Wir beschreiben, wie zwischen den vier Stufen des Östrus Zyklus durch Sammlung und Analyse der vorherrschenden Zelle Typologie Vaginalabstrichen und wir zeigen, wie diese Änderungen gegenüber endokrinen Status interpretiert werden können differenzieren.

Protocol

Ein. Herstellung von Reagenzien

  1. Für sterile vaginalen Lavage, autoklavieren doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O) und an einem fest verschlossenen Behälter bei Raumtemperatur bis benötigt.
  2. Für zytologische Beurteilung mit 0,1 g Kristallviolett Pulver zu 100 ml ddH 2 O. Gut mischen. Kristallviolett Fleck (0,1%) in einem dicht verschlossenen Behälter bei Raumtemperatur gelagert werden, bis sie benötigt.

2. Sammeln Vaginal Cells (Vaginal Lavage)

  1. Legen Sie eine Latexball am Ende einer sterilen 200 ul Spitze und erarbeiten rund 100 ul sterilem ddH 2 O mit den Abstufungen an der Spitze als Volumen Leitlinie.
  2. Heben Sie die Maus aus ihrem Käfig und platzieren Sie sie auf dem Käfig Trichter (Deckel) mit ihren Hinterbeinen / Heck zu Ihnen.
  3. Fassen Sie den Schwanz und heben das Heck. Die Maus wird jetzt nur noch ihren Vorderpfoten Ergreifen des Trichters. An diesem Punkt der Maus kann urinieren. Falls ja, Bis Wasserlassen Haltestellen warten. Sollte es Urin bei der Einfahrt zum Vaginalkanals übrig sein, können Sie die Öffnung mit einem Überschuss ddH2O mit einem separaten Spitze (dh, nicht Ihre Probenentnahme Spitze) spülen.
  4. Legen Sie das Ende des ddH 2 O gefüllten Spitze an der Öffnung des Vaginalkanals darauf achten, dass nicht durch die Öffnung als vaginale (und Gebärmutterhalskrebs) Stimulation kann Scheinträchtigkeit bei Ratten 1,2 induzieren. Jüngste Berichte deuten Mäuse sind weniger anfällig für diesen Effekt jedoch darauf geachtet werden sollte, um den Grad der Invasivität in wiederholten Analysen 3 zu minimieren.
  5. Vorsichtig drücken Sie die Lampe, um ein Viertel bis die Hälfte des Volumens von Wasser (~ 25-50 ul) bei der Eröffnung der vaginalen Kanal zu vertreiben. Die Flüssigkeit wird spontan in den Kanal absaugen ohne Spitze Insertion. Langsam den Druck auf den Kolben ausgeübt wird. Die Flüssigkeit wird sich zurückziehen wieder in die Spitze. Vermeiden Druckentlastung zu schnell, um eine Aspiration von Flüssigkeit zu verhindernin den Kolben. Eine gefilterte Spitze kann für diesen Zweck nützlich.
  6. Wiederholen der vorhergehenden Schritt 4-5 mal mit der gleichen Spitze, Birne, und Fluid, um eine ausreichende Anzahl von Zellen in einer einzelnen Probe zu erhalten.
  7. Legen Sie die Flüssigkeit auf Objektträger aus Glas, und lassen Sie die Schmierschicht vollständig bei Raumtemperatur trocknen. Nach dem Trocknen können diese Östrus Abstriche sofort gefärbt oder gespeichert werden und gefärbt zu einem späteren Zeitpunkt.

3. Zytologische Färbung mit Kristallviolett * 4

  1. Setzen Sie den trockenen Folie in einer Coplin (oder andere vergleichbare Färbung Gefäß) mit dem Kristallviolett für 1 min färben.
  2. Entfernen Sie mit einem zweiten Glasküvette mit ddH 2 O. Waschen Sie den Schlitten mit ddH 2 O für 1 min. Wiederholen.
  3. Entfernen Sie das überschüssige ddH 2 O von den Rändern der Folie mit einem leichten Gewebe Scheibenwischer, Vermeidung von Kontakt mit dem gefärbten Abstrich.
  4. Pipette etwa 15 ul von Glycerin auf der Schmierschicht und Deckelrutschen. Alternativ können auch andere Reagenzien histologischen Montage genutzt werden, um eine dauerhafte, nicht-diffundierenden Farbstoff erhalten.

* Die Färbung hier beschriebenen Verfahren ist die einfachste Verfahren, das in jedem Labor durchgeführt werden kann. Andere Methoden können zusätzliche Details. Zum Beispiel, mit Papanicolaou-Färbung, kann die Laufzeit von kernhaltige Epithelzellen mit weniger reifen Zellen gefärbt Türkis und reiferen Zellen pink-oder orange-gefärbten unterschieden werden. Diese Unterschiede können verwendet werden, um früh oder spät Proöstrus inszenieren. 4

4. Vaginalzytologie

  1. Untersuchen Sie die Schmierschicht unter dem Lichtmikroskop zu bestimmen Zelltypen vor. Die mikroskopische Untersuchung sollte sofort nach der Färbung als die Kristallviolett wird von den Zellen im Laufe der Zeit diffundieren bei Verwendung von Glycerin zum Eindecken durchgeführt werden. Mikrofotografien sollten zum Zeitpunkt der Analyse entnommen werden zur Zytologie dokumentieren.
  2. Beginnen Sie mit der Überprüfung der entire-Abstrich bei einer niedrigeren Vergrößerung. Wählen Sie einen repräsentativen Bereich und auf eine höhere Vergrößerung. Sie werden sehen, verhornten Plattenepithel Epithelzellen, Leukozyten und / oder kernhaltige Epithelzellen (repräsentative Ergebnisse, 1A-C). Das Verhältnis der vorhandenen Zellen ermöglicht es Ihnen, die Östrus Stadium der Maus zum Zeitpunkt der Probennahme (repräsentative Ergebnisse, 1D-G) und ihre unmittelbaren hormonellen Status (Diskussion, Abbildung 2) zu bestimmen.

5. Repräsentative Ergebnisse

Zytologie: Drei primäre Zelltypen in Vaginalabstrich Proben nachgewiesen werden: (1) kernhaltige Epithelzellen (Abbildung 1A), (2) verhornten Plattenepithel Epithelzellen (Abbildung 1B), und (3) Leukozyten (1C). Kernhaltige Epithelzellen haben einen leicht gefärbten Zytoplasma, dunkler gefärbten Plasmamembran, und einen ovalen Kern ( (1B). Polymorphkernigen Leukozyten aus Epithelzellen durch ihre unregelmäßige Form, dunkel gebeizt polymorphe Kerne, und die geringe Größe (1C, schwarze Pfeile) unterschieden werden. Sollte Urin Verunreinigung der Schmierschicht sein werden Harnsäurekristallen leicht durch ihre kristalline Strukturen unähnlich alle erwarteten Zelltypen (Abbildung 3) detektiert. Sollte dies geschehen, und obskuren Erfassung der vorherrschenden Zelltyp, sollte der Abstrich verworfen und nicht für die Inszenierung verwendet.

Inszenierung: Das relative Verhältnis von Zelltypen in Schlieren beobachtet werden verwendet, um die Phase des Östrus-Zyklus der Maus am Tag der Probennahme (1D-G) zu identifizieren. Während Proöstrus sind Zellen fast ausschließlichCluster von runden, wohlgeformten kernhaltige Epithelzellen (1D, repräsentative Zelle durch weißen Pfeil angedeutet). Während Brunst, werden die Zellen überwiegend Plattenepithelzellen, in dicht gepackten Clustern (1E, repräsentative Zelle durch Pfeilspitze angezeigt) verhornten. Während Metöstrus überwiegen kleine dunkel gefärbte Leukozyten (1F, repräsentative Zelle durch schwarzen Pfeil angedeutet). Verhornten Plattenepithelzellen kann beobachtet werden, oft in Fragmente, (1F, repräsentative Zelle durch schwarze Pfeilspitze angegeben). Während Diöstrus, seltene verhornten Plattenepithel Epithelzellen noch vorhanden sein können (Abbildung 1G, repräsentativen Zelle durch schwarze Pfeilspitze angezeigt), aber Leukozyten noch überwiegen (1G, repräsentative Zelle durch schwarzen Pfeil angedeutet). Metöstrus aus Diöstrus durch das Auftreten von kernhaltige Epithelzellen in Diöstrus (unterschieden werden g> 1G, angegeben repräsentativen Zelle weißer Pfeil).

Abbildung 1
Abbildung 1. Zytologische Beurteilung Vaginalabstrichen kann zur Östrus Stufe identifizieren Drei Zelltypen sind in Vaginalabstrich Proben nachgewiesen:. (A) kernhaltige Epithelzellen, (B) verhornten Plattenepithelzellen und (C) Leukozyten. Das Verhältnis dieser Zelltypen in der Schmierschicht verwendet, um Mäuse in (D) Proöstrus, (E) Östrus, (F) Metöstrus, oder (G) wie in Diöstrus repräsentative Ergebnisse beschrieben identifizieren. Schwarze Pfeilspitzen in E, F und G-Punkt repräsentativ verhornten Plattenepithel Epithelzellen. Schwarze Pfeile in C, F und G-Punkt repräsentativ leykocytes. Weiße Pfeile in D und G Highlight repräsentativen kernhaltige Epithelzellen.

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Abbildung 2. Vaginal-Abstrich Zytologie spiegelt zugrunde liegenden endokrinen Veranstaltungen. Details sind auch in der Diskussion zur Verfügung gestellt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 3
Abbildung 3. Harnsäurekristallen vorliegen können folgende Kristallviolettfärbung von Urin kontaminierten Proben sein. (A) Kristalle transparent sind und in verschiedenen Größen (Pfeile und verpackt Region (B) vergrößert) sein. Keine Zellen vorhanden sind in diesem Bereich. Sollte Harnsäure Kristall Kontamination innerhalb der Felder für die zytologische Färbung verwendet vorhanden sein, kann es schwierig sein, genau zu identifizieren Zelltypen vorhanden und der Abstrich sollte verworfen werden. Maßstabsbalken = 50 um.

Discussion

Diese Veränderungen in der Zelle Typologie sind indikativ der zugrunde liegenden endokrinen Veranstaltungen. Die Phase des Proöstrus Östrocyclus entspricht der menschlichen follikulären Phase des Menstruationszyklus 5 und wird durch einen präovulatorischen Erhöhung des zirkulierenden 17-β-Estradiol Ebenen 6, sowie einem kleinen Anstieg der Prolaktin 7 (Abbildung 2 definiert, Proöstrus, links). Die Zunahme der 17-β-Estradiol stimuliert indirekt Gonadotropin-Releasing-Hormon-Neuronen im Hypothalamus und Septum, das wiederum aktivieren reagierenden Zellen im Hypophysenvorderlappen zu Luteinisierungshormon und Follikel-stimulierendes Hormon in den Kreislauf 8,9 freisetzen (Abbildung 2 , Proöstrus, links). In Vaginalabstrichen von Tieren in Proöstrus genommen, sind die Zellen fast ausschließlich oval kernhaltige Epithelzellen (1D, Bild 2, Proöstrus, rechts). Der Peak im Follikel-stimulierendes HORMein Ebenen-Signale Eisprung und Eintrag in die Brunst 10,11. Während Brunst, 17-β-Östradiol Niedergang und Prolaktinspiegel peak 6,7 (Abbildung 2, Estrus, links). Vaginalabstrichen werden von fast ausschließliche Detektion von unregelmäßig geformten verhornten Plattenepithel Zellen oft in Klumpen (1E, Bild 2, Estrus, rechts) gekennzeichnet. Einstieg in Metöstrus fällt mit einem kontinuierlichen Anstieg der Progesteron Hormonspiegel 6 und entspricht dem Beginn der menschlichen Lutealphase 12 (Abbildung 2, Metöstrus, links). Da Progesteron beginnen zu steigen, und es gibt eine kleine Zunahme der 17-β-Estradiol in Reaktion auf Gelbkörper Aktivierung 6,13,14 (Abbildung 2, Metöstrus, links). Die Zelltypen in Vaginalabstrichen während dieser Phase sind fragmentiert, verhornten Epithelzellen und kleinere dunklere Flecken Leukozyten (Figure 1F, Bild 2, Metöstrus, rechts). Schließlich tritt Eintritt in Diöstrus in Mäusen und Zirkulieren Progesteronspiegel Peak 6, entsprechend dem menschlichen späten Lutealphase 12. Regression des Corpus luteum führt zu einer weiteren starken Rückgang der Progesteron-Spiegel 15,16 (Abbildung 2, Diöstrus, links). Leukozyten überwiegen in Abstrichen beim Diöstrus. Die Häufigkeit von verhornten Epithelzellen verringert und kernhaltige Epithelzellen beginnen, unmittelbar vor dem Übergang zu Proöstrus (Figur 1G, Bild 2, Diöstrus, rechtes Feld) detektiert werden.

Zusammenfassend kann diese einfachen, routinemäßigen Protokoll zur täglichen hormonelle Schwankungen schätzen und zu etablieren Östrus Bühne in Versuchsmäusen ohne Änderung reproduktiven Status, wenn die folgenden Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden. Die Probenahme sollte nicht mehr als einmal täglich mit dem nicht-invasiven Protokoll desc durchgeführt werdenhier wiederholt das Eindringen des Vaginalkanals, Aspiration, und Agitation gegenüber ribed. Dies kann dazu führen, vaginale Reizung was zu einer entzündlichen Reaktion resultierende 17 in Leukozyten und anderen Zelltypen vorhanden sein, die in Abstrichen zytologische Beurteilung verwirren kann. Außerdem, selbst in Kolonie untergebracht Weibchen, ist es normal, erweiterte Diöstrus und Östrus Stufen in verschiedenen Mäusen sowie Induktion von Anöstrus 18 und diese Identifikation ist nützlich bei der Interpretation der hormonelle Auswirkungen im Bereich der reproduktiven, Geschlecht und Krankheit Studien zu sehen. Variabilität in der Zykluslänge wird auch mit dem Alter und vom Gehäuse Unterschiede innerhalb Kolonien (Einzelperson oder Gruppe-Gehäuse) der Frauen 7,19-21 eingeführt. Frauen in nur weibliche Kolonien untergebracht aufhören kann Radfahren und in einen Zustand der längeren Diöstrus 18,22,23 obwohl Radfahren kann durch die Einwirkung von Käfigen vorbehandelt mit männlichen Urin zum Radfahren 24,25 entlocken wieder eingesetzt werden. Somit festzustellen individual Zykluslängen für eine bestimmte Maus, ist es empfehlenswert, dass die nicht-invasive Beurteilung hier beschriebenen täglich durchgeführt werden, mit Sorgfalt, bis zwei komplette Zyklen beobachtet werden.

Disclosures

Die Autoren erklären, keinen Interessenkonflikt. Alle Experimente an Tieren wurden in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der University of Ottawa Animal Care Committee und des Canadian Council on Animal Pflegeset durchgeführt.

Acknowledgments

Wir möchten Marc Leonard von der Carleton Immersive Media Studio danken für kompetente technische Unterstützung bei der Video-Produktion und-Bearbeitung und Dr. Martin Bertrand von der Carleton Immersive Media Studio / Neural Regeneration Labor für visuelle Modell Unterstützung. Die Autoren danken der Sachverständigengutachten von Dr. Marilyn Keaney und alle ihre engagierte Mitarbeiter an der University of Ottawa Animal Care und Veterinärwesen. Diese Arbeit wurde von der kanadischen Institute of Health Research (CIHR, MOP 62826) um SALB, der CIHR Institute of Aging and Strategic Training Initiative in Health Research / CIHR Training Program in Neurodegenerative Lipidomics (TGF 96.121) an SALB und SF, Canadian Foundation finanziert für Innovation zu SF, Ontario Innovation Trust SF und Autodesk Forschung zur SF. ACM erhält eine CIHR Banting und Best Promotion Award. NV erhält eine post-professionellen Stipendium Institute of Aging und CIHR Training Program in Neurodegenerative Lipidomics.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 200 μl pipette tips Diamed E340901
Latex bulb (1 ml) Fisher 03-488-21
Glass microscope slides Fisher 12-550-15
Crystal Violet stain (25 g) Fisher C581-25
Light-duty Tissue Wipers VWR 82003-820
Glycerol Fisher BP229-1
Microscope Cover Glass (22x30) Fisher 12-544A

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References

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