Análise e construção de estruturas de Ácido Nucleico com 3DNA

Biology

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Summary

O pacote de software 3DNA é uma ferramenta de bioinformática popular e versátil, com a capacidade de analisar, construir e visualizar as estruturas de ácidos nucleicos tridimensionais. Este artigo apresenta os protocolos detalhados para um subconjunto dos novos e populares recursos disponíveis no 3DNA, aplicáveis ​​a ambas as estruturas e conjuntos de estruturas relacionadas individuais.

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Colasanti, A. V., Lu, X. J., Olson, W. K. Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA. J. Vis. Exp. (74), e4401, doi:10.3791/4401 (2013).

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Abstract

O pacote de software 3DNA é uma ferramenta de bioinformática popular e versátil, com a capacidade de analisar, construir e visualizar as estruturas de ácidos nucleicos tridimensionais. Este artigo apresenta os protocolos detalhados para um subconjunto dos novos e populares recursos disponíveis no 3DNA, aplicáveis ​​a ambas as estruturas e conjuntos de estruturas relacionadas individuais. Protocolo 1 apresenta o conjunto de instruções necessárias para baixar e instalar o software. Isto é seguido, o protocolo 2, por meio da análise de uma estrutura de ácido nucleico, incluindo a atribuição de pares de bases e a determinação de parâmetros de corpo rígido que descrevem a estrutura e, no Protocolo 3, por uma descrição da reconstrução de um atómica modelo de uma estrutura a partir de seus parâmetros de corpo rígido. A versão mais recente do 3DNA, versão 2.1, tem novos recursos para a análise e manipulação de conjuntos de estruturas, tais como aqueles deduzida a partir de ressonância (RMN), as medições magnéticos nucleares e dinâmica molecular (MDSimulações), esses recursos são apresentados em Protocolos 4 e 5. Além do pacote de software stand-alone 3DNA, o servidor web w3DNA, localizada na http://w3dna.rutgers.edu , fornece uma interface amigável para as características selecionadas do software. Protocolo 6 demonstra uma característica inovadora do local para a construção de modelos de moléculas de DNA de comprimento decorada com proteínas ligadas em locais especificados pelo usuário.

Introduction

Compreendendo as estruturas tridimensionais de DNA, RNA e seus complexos com proteínas, medicamentos e outros ligandos, é crucial para decifrar as suas diversas funções biológicas, e para permitir que o desenho racional de terapêutica. Exploração de tais estruturas compreende três componentes separados, mas intimamente relacionados: análise (para extrair padrões de formas e interações), modelagem (para avaliar energética e dinâmica molecular), e visualização. Análise estrutural e construção do modelo são, essencialmente, duas faces da mesma moeda, e visualização complementa ambos.

A suíte 3DNA de programas de computador é um conjunto de ferramentas de bioinformática estrutural cada vez mais popular com recursos para analisar, construir e visualizar estruturas de ácidos nucleicos tridimensionais. Publicações anteriores delineou as capacidades do software 1, desde receitas a realizar tarefas selecionadas 2, introduziu a interface baseada na webde características populares do software 3, apresentou bases de dados de características estruturais coletados por meio de 3DNA 4, 5 e ilustrado a utilidade do software para a análise de DNA e RNA estruturas 6, 7.

O objetivo deste artigo é trazer o kit de software 3DNA para os cientistas de laboratório e outros com interesses e / ou necessidades para investigar DNA e RNA organização espacial com ferramentas computacionais state-of-the-art. Os protocolos aqui apresentados incluem instruções passo-a-passo (i) para fazer o download e instalar o software em um sistema Mac OS X, (ii-iii) para analisar e modificar estruturas de DNA no nível das etapas de pares de bases que constituem, ( iv-v) para analisar e alinhar conjuntos de estruturas de DNA relacionadas, e (vi) para a construção de modelos de cadeias de DNA em proteínas decorado com a interface web amigável w3DNA. O software tem a capacidade de analisar as estruturas individuais resolvidos utilizando métodos de cristalografia de raios-X, bem como grandeconjuntos de estruturas determinadas com os métodos de ressonância magnética nuclear (RMN) ou gerados por técnicas de simulação por computador.

As estruturas aqui examinadas incluem: (i) a estrutura cristalina de alta resolução do DNA ligada à proteína de Borrelia burgdorferi HBB 8 (a bactéria por carrapatos que causa a doença de Lyme em seres humanos 9, 10), (ii) a dois grandes conjuntos de sequencialmente As moléculas de DNA relacionados produzidos com simulações moleculares 11 - 4500 instantâneos de GGCAAAATTTTGCC (d) 2, d (CCGTTTTAAAACGG) 2 recolhidos em incrementos de 100 PSEC durante os cálculos, e (iii) um pequeno conjunto de estruturas com base em RMN do operador ADN O3 ligado aos capacetes da Escherichia coli Lac proteína repressora 12. As instruções abaixo incluem informações sobre como acessar os arquivos de coordenadas atômicas associados a cada uma dessas estruturas, bem como a forma de usar 3DNA (a cópia desse arquivo é encontradono fórum 3DNA em http://forum.x3dna.org/jove ) para examinar e modificar essas estruturas.

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Protocol

1. Instalação do pacote de software

  1. Conecte-se ao site 3DNA em http://x3dna.org e clique no link para o Fórum 3DNA. Dentro do Fórum selecione o link "cadastro" e siga as instruções para criar uma nova conta.
  2. A seguir detalhadamente as instruções de instalação do software em um computador Macintosh baseado em OS X com um shell default 'bash'. O procedimento para sistemas Linux ou Windows (Cygwin, MinGW / MSYS) com conchas comumente utilizados (incluindo 'tcsh') encontra-se no âmbito do Fórum 3DNA.
  3. Depois de ter estabelecido um nome de usuário e senha, entrar no fórum. Selecione o link 'Downloads' na seção de boas-vindas e na nova página escolha '3 DNA download '. Isso o levará para a página de download 3DNA onde várias versões do software pode ser baixado.
  4. Selecione o OS X ligação Intel Mac para baixar um arquivo tar compactado (tar.gz) contendo o software.
  5. Duplo click no arquivo (tar.gz) para criar uma pasta chamada x3dna-v2.1. Essa pasta, que contém o conjunto de software 3DNA, pode ser movido para qualquer local. Para os fins desta receita, nós arraste e solte-os para o diretório "Aplicativos". Nesta fase você terminar com o arquivo tar.gz e pode excluí-lo.
  6. Abra o aplicativo Terminal, tipicamente encontrado em "Utilities", e mude para o diretório x3dna-v2.1 criado na Etapa 5, utilizando o seguinte comando (terminou aqui e em todas as instruções abaixo por um retorno de carro):
    cd / Applications/x3dna-v2.1
  7. Execute o script de configuração necessária para 3DNA para funcionar corretamente, digitando:
    ./bin/x3dna_setup
  8. Copie as configurações de exportação de duas linhas impressas em Passo 7. Se o usuário colocou o software no diretório 'Aplicativos', as duas linhas devem aparecer da seguinte forma:
    exportação X3DNA = / Applications/x3dna-v2.1
    export PATH = / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH
    A outra palavra além de "Aplicativos" vai Appear no comando de exportação, caso o usuário tenha optado por instalar o software em um diretório diferente. Este nome do diretório alternativo irá substituir 'Aplicativos' nos dois comandos acima. Note que se o shell padrão é 'tcsh' em vez de 'bash', o conteúdo das duas linhas seria: setenv X3DNA / Applications/x3dna-v2.1 e setenv PATH / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH.
  9. Confira em 'Localizador' para ver se um arquivo chamado '. Bashrc' já existe no seu computador.
  10. Abra o aplicativo TextEdit encontrado no diretório 'Aplicações' e selecione 'Make Plain Text "no menu" Format ".
  11. Se o arquivo '. Bashrc' de Passo 9 existe, abrir o arquivo no editor de texto e cole as configurações de exportação de Passo 8 até o fim do arquivo. Se não ". Bashrc" arquivo de saídas, cole as configurações de exportação de Passo 8 em um arquivo em branco e salvar com o nome do arquivo '. Bashrc' em seu diretório home. (O diretório home é indicado por um ícone de 'casa' no Macintosh).
  12. Para que as novas configurações para be disponíveis, você deve executar o arquivo recém-salvo 'bashrc. usando o seguinte comando dentro do programa Terminal:
    source ~ /. bashrc
  13. A suíte 3DNA agora está instalado em seu sistema e você pode executar protocolos 2-5 dentro do programa Terminal. Protocolo 6 é realizada utilizando w3DNA, uma interface web para as características selecionadas do software 3DNA.

2. Análise de uma estrutura de cristal

  1. Nós ilustram a análise de uma estrutura de ácido nucleico usando o DNA ligado à proteína de Borrelia burgdorferi HBB 8. O arquivo de coordenadas atómicas associados com esta estrutura pode ser encontrada no Protein Data Bank 13 (APO; http://www.rcsb.org ), onde é atribuído o identificador 2np2 estrutural. Os dados suplementares anexas incluem uma cópia desse arquivo, que também pode ser encontrado no Fórum 3DNA em http://forum.x3dna.org/jove.
  2. O primeiro passo na análise 3DNA da estrutura é a criação de um ficheiro que lista todas as bases emparelhadas. Isso é feito com o programa 'find_pair ", digitando o seguinte:
    find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
    Aqui 2np2.pdb é o arquivo de entrada de coordenadas atômicas descritos acima e 2np2.bps é o arquivo de texto de saída que contém as informações de emparelhamento de bases. O arquivo base-pair último pode ser examinado e editado pelo usuário, se necessário.
  3. O passo seguinte na análise é o de determinar os parâmetros geométricos que caracterizam a estrutura. Estes incluem ângulos padrão de torção químicos 14, ângulos pseudorotação que descrevem o franzido do anel de açúcar 15, os parâmetros de corpo rígido que especificar as modalidades de bases e pares de bases sucessivas de 16, e outras medidas de estrutura química tridimensional. O comando 'analisar' toma como entrada o arquivo de pares de bases gerado na Etapa 2 e cria vários UOarquivos tput, que aparecem no diretório de trabalho atual. Estes valores são calculados, digitando o seguinte comando:
    analisar 2np2.bps
    Os arquivos de saída usados ​​aqui incluem 2np2.out, que contém um resumo dos parâmetros calculados, e bp_step.par, que contém uma lista dos corpos rígidos parâmetros descritos acima. O último arquivo pode ser lido facilmente em um programa de planilha para análise e plotagem. Veja resultados representativos (Figura 1) para um exemplo.

3. Construção de uma estrutura de DNA a partir de parâmetros de corpo rígido

  1. Em adição à análise de uma estrutura de ácido nucleico, o software 3DNA fornece a capacidade para construir um modelo estrutural a partir de parâmetros de corpo rígido utilizando o comando "reconstrução". No presente Protocolo, mostramos como construir dois modelos helicoidais de DNA, o primeiro a utilizar os parâmetros de corpo rígido do complexo HBB-DNA calculado em Protocol 2 e, em seguida, usando um conjunto de alterações de parâmetros em which ângulos de rolo selecionados são alteradas. O ângulo de rolamento mede o grau de flexão de pares de bases consecutivos dentro das ranhuras 16 do ADN. Os valores positivos de rolo estão associados com o estreitamento da ranhura maior e valores negativos com o estreitamento do sulco menor. O quadro de referência padrão 17 aprovada pelo software de análise 3DNA e outros populares ácido nucleico, por exemplo, Curves + 18, garante a consistência numérica dos parâmetros calculados de pares de bases de Watson-Crick.
  2. Por padrão, a função 3DNA 'Reconstrução' irá criar modelos atômicos exatos que contenham apenas as coordenadas dos átomos nas bases nitrogenadas. A fim de criar um modelo atômico aproximado, o que inclui as coordenadas de ambos backbone e os átomos de base, digite o seguinte comando:
    x3dna_utils cp_std bDNA
    Este comando instrui 3DNA introduzir uma conformação normal a estrutura B-DNA para a construção de modelos de parâmetros de corpo rígido.
  3. Para build um modelo de dupla hélice com os parâmetros rígidos de corpo encontradas na estrutura HBB-DNA, digite o seguinte:
    reconstruir-atômica bp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
    Aqui está-atômica 'especifica a construção de um modelo de todos os átomos com coordenadas atômicas de todos os átomos pesados ​​(não-hidrogênio),' bp_step.par 'é o arquivo gerado no passo 3 do Protocolo 2, que contém os parâmetros de corpo rígido inseridos e '2 np2_rbld_org.pdb 'é o arquivo de saída com as coordenadas atômicas da estrutura criada. O último arquivo é formatado de acordo com as especificações do PDB e, assim, termina com ". Pdb.
  4. Arquivo 'bp_step.par' pode ser editado para gerar uma estrutura modificada. Em um Macintosh, as mudanças podem ser realizadas utilizando o aplicativo TextEdit, conforme descrito no Protocolo 1 Passo 10.
  5. Aqui nós modificar os ângulos extremos rolo formados nos dois locais de maior curvatura. Os valores, expressos em graus, são alteradas a zero a partir de valores de 64.95 em linha 17 e 600,93 na linha 26. Nós salvamos o arquivo modificado com um novo nome, "bp_step_roll0.par ', e feche o programa TextEdit.
  6. Nós construímos a estrutura, como no Passo 3, com o conjunto de alterações de parâmetros passo que o arquivo de entrada, digitando:
    reconstruir-atômica bp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
  7. Os dois modelos podem ser visualizados em um visualizador molecular padrão, como PyMOL ( www.pymol.org ), usando os arquivos de coordenadas gerados (. APO) como entrada. Veja resultados representativos (Figura 2) para as imagens das estruturas reconstruídas.

4. Análise de arquivos de estrutura Multi-modelo

  1. Em contraste com o protocolo 2, no qual analisamos uma única estrutura de ácido nucleico contendo, aqui vamos mostrar como analisar um grande conjunto de estruturas. Analisamos a variação ao longo do tempo dos parâmetros de rigidez do corpo ao longo de uma série de cadeias de DNA de 14 pares de bases obtido a partir de dinâmica molecular (MD), 11 simulações http://forum.x3dna.org/jove .
  2. O primeiro passo na análise é a mesma que a realizada no Protocolo 2, a identificação das bases emparelhados, executando o programa 'find_pair'. Uma vez que todo o conjunto de estruturas compartilha o mesmo esquema de emparelhamento de bases é preciso correr 'find_pair' apenas uma vez em um arquivo representante. Aqui podemos escolher a estrutura de 1001 na simulação de cadeias de DNA contendo uma central a passo, com o nome do arquivo md_AT_set1.pdb.1001. Os seguintes géneros instruçãotes as informações de emparelhamento de bases e as armazena em md_AT_set1.bps os arquivos:
    find_pair md_AT_set1.pdb.1001 md_AT_set1.bps
    O usuário pode examinar a base identificado aparas e fazer alterações manuais no arquivo com base no conhecimento da estrutura.
  3. O passo seguinte é o de determinar os parâmetros geométricos de todo o conjunto de estruturas utilizando o 'x3dna_ensemble analisar' comando. O programa utiliza como entrada o arquivo de pares de bases gerado no Passo 2 (md_AT_set1.bps), bem como um ficheiro contendo uma listagem das estruturas a serem analisadas. O último arquivo, aqui chamado md_AT_set1.list, contém os 4.500 arquivos a serem analisados, com os nomes de arquivos inseridos em linhas individuais na ordem gerada pela simulação MD. Uma cópia desse arquivo está incluído no material suplementar e também ofereceu no Fórum 3DNA. O usuário deve ser avisado, por causa do grande número de arquivos, que o tempo computacional pode ser longo (~ 20 min por 1.000 arquivos em um processador AMD Phenom II X4 965). Thcomando e é executado digitando o seguinte:
    x3dna_ensemble analisar-b md_AT_set1.bps-l md_AT_set1.list-o md_AT_set1.out
    No exemplo acima refere-se '-B' para o arquivo de pares de bases criado no passo 2, '-l' especifica que uma lista de arquivos é dado, e '-o' permite que o usuário atribua um nome para o arquivo de saída. Existem várias opções que podem ser usados ​​em conjunção com o «x3dna_ensemble analisar 'comando, como a selecção de modelos específicos. O usuário pode digitar 'x3dna_ensemble analisar-h' para obter mais informações sobre estas opções.
  4. O próximo passo é extrair os parâmetros desejados de corpo rígido a partir do arquivo de saída descrição, md_AT_set1.out, gerada na etapa 3. Isto é executado utilizando o comando "extracto x3dna_ensemble '. A lista de parâmetros geométricos disponíveis podem ser encontradas digitando 'x3dna_ensemble extrato-l'. Aqui vamos extrair os ângulos de rolo e criar um arquivo de texto separado por vírgulas (CSV) dos ângulos de rolo com o seguinte comando:
    x3dna_ensemble extrato-proll-s,-f md_AT_set1.out-o md_AT_set1_roll.csv
    O 'roll-p' neste comando especifica o parâmetro a ser extraído, o 's' significa um arquivo separado por vírgulas, o '-f' denota o arquivo de saída obtido a partir do conjunto de comando analisar, e '-o 'permite ao usuário o nome do arquivo de saída CSV de ângulos de rolo ao longo do DNA em todas as estruturas analisadas. Este arquivo pode ser lido em outros programas para análise e plotagem. Veja resultados representativos (Figura 3) para a análise da variação do rolo nos dois conjuntos de dados MD gerados descritos acima eo Fórum 3DNA para o script MATLAB usado para gerar essas imagens.

5. Superposição de Estruturas multi-modelo para um quadro de referência comum

  1. A versão mais recente do 3DNA (versão 2.1) tem um novo recurso que permite ao usuário a olhar para várias estruturas a partir de uma perspectiva comum. O 'x3dna_ensemble reorientar' comando sobrepõe uma coleção de estruturação relacionadoses em um par de base comum ou passo de pares de bases. O protocolo a seguir aplica-se essa capacidade das estruturas de RMN derivados do operador O3 DNA ligado aos capacetes do Lac proteína repressora 12. Estas estruturas são armazenadas no APO sob a 2kek identificador num ficheiro estrutural multi-modelo, que contém todos os modelos de estrutura em um único arquivo, em oposição aos ficheiros separados, como as usadas para cada um dos modelos de 4500 em Protocolo 4. Os dados suplementares anexas incluem uma cópia desse arquivo, que também pode ser encontrado no Fórum 3DNA em http://forum.x3dna.org/jove .
  2. Tal como nos protocolos anteriores, o primeiro passo é calcular o emparelhamento de bases do ADN com o programa "find_pair '. Neste caso, usamos como entrada o arquivo kek.pdb '2 'e digite o seguinte:
    find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
    O emparelhamento de base é gerada utilizando o primeiro modelo no PDB. Correções manuais para o b outputtedarquivo ase-pair, kek.bps '2 ', pode ser feita com base no conhecimento da estrutura.
  3. O programa 'x3dna_ensemble reorientar' irá alinhar os modelos individuais em uma estrutura multi-modelo em um quadro de referência comum. Este programa requer o PDB eo arquivo de emparelhamento de bases da etapa anterior como entrada e é executado com o seguinte comando:
    x3dna_ensemble reorientar-b 2kek.bps-f 1-e 2kek.pdb-o 2kek_fr1.pdb
    Aqui a opção '-b' especifica o arquivo de emparelhamento de bases, a '-f 1' indica o par de bases em que todas as estruturas estão alinhados, neste caso, um par de bases na extremidade 5 'da cadeia de sequência de rolamento, o '-e' especifica o arquivo de conjunto de entrada, eo '-o' permite que o usuário fornecer um nome de arquivo de saída, neste caso kek_fr1.pdb '2 '. Mais informações sobre as opções de comando pode ser obtido digitando 'x3dna_ensemble reorientar-h'. Veja resultados representativos (Figura 4) para a discussão das estruturas alinhadas.

6. Construcção de uma proteína-decorado molécula de DNA

  1. A interface web w3DNA inclui alguns recursos interessantes do pacote de software 3DNA. Aqui chamamos a atenção para a capacidade de construir modelos tridimensionais de DNA em proteínas decorado com o servidor web. Os fragmentos de DNA ligados adotar os parâmetros de corpo rígido dos complexos DNA-proteína selecionados, aqui os valores do DNA ligado à proteína HBB analisada no protocolo 2. As regiões não ligadas de DNA pode adotar uma das três formas helicoidais selecionados pelo usuário (A, B, ou C). O A, B e C referem-se a três modelos canónicos de ADN, obtidas a partir de experiências precoces de difracção de fibras, respectivamente com 11, 10 e 9 pares de base por volta da hélice dupla 19-21.
  2. O primeiro passo na construção de um modelo de DNA em proteínas decorado é visitar o site da w3DNA localizado na http://w3dna.rutgers.edu . Seleção de "reconstrução" do menu na parte superior do lado esquerdo da página de activates on-line as capacidades de construção de modelos.
  3. O próximo passo é selecionar o link "modelo de proteína-DNA Bound 'encontrado na caixa sombreada levemente no meio da nova página. Esta seleção irá ativar um menu pull-down, que permite que o usuário especifique o número de proteínas ligadas. Aqui nós selecionamos duas proteínas ligadas e clique no botão "Continuar". Note-se que os modelos estão limitados no tamanho a 1000 pares de bases, ou 2000 nucleótidos, e trinta e proteínas ligadas.
  4. A selecção do número de proteínas ligadas leva a uma página especificação semelhante ao mostrado na Figura 5. Esta página permite ao utilizador especificar a sequência de DNA, a forma helicoidal do ADN não ligado, e as identidades e localizações das proteínas ligadas.
  5. O usuário digita ou pastas na sequência desejada na caixa de texto no meio da página de especificações (Figura 5, Etiqueta 1). Observe que apenas os resíduos padrão - A, T, C, G e L - são aceites. Aqui entramos um 81 hom base-pairopolymer, composto inteiramente de um · pares T com o A na vertente seqüência de rolamento.
  6. Há um menu pull-down (Figura 5, Etiqueta 2), abaixo da caixa de texto, selecione a conformação helicoidal das regiões não ligadas de DNA. Neste exemplo, vamos escolher a conformação da forma B.
  7. Existe uma caixa de texto na parte inferior da página de especificação para introduzir a posição de ligação (ões) e nome de ficheiro (s) da proteína ligada (s) (figura 5, para a etiqueta 3). A posição de ligação especifica a localização do centro do fragmento de proteína ligada na sequência de ADN. Se o ADN ligado contém um número ímpar de pares de bases, tal como na estrutura do ADN-HBB, a posição de ligação indica a localização do meio de pares de bases do fragmento. No caso de ADN HBB ligado, este par de bases do meio é uma T · T mispair. Neste exemplo, onde se ligam duas cópias da proteína HBB ao molde do ADN, o T · par T é colocado nas posições 20 e 63 dos 81 pares de bases de DNA sicia. Note-se que a sequência do fragmento ligado não tem que coincidir com a que entrou no Passo 5. Se a região ligado à proteína contém um número par de pares de bases, a posição de ligação indica a localização do passo de pares de bases do meio no ADN. Ou seja, o passo do fragmento ligado de pares de base central é colocado entre pares de base n e n +1, onde n é o número especificado ao longo do segmento. Além disso, note que o usuário pode decorar do DNA com qualquer proteína, desde que a estrutura do seu complexo com ADN é conhecido e armazenado em formato padrão APO 13.
  8. Na parte inferior da página de especificação existe uma caixa que permite ao utilizador gerar uma visualização do DNA ligado às proteínas (Figura 5, Etiqueta 4). Aqui podemos verificar que a caixa e clique no botão "Continuar". Essa ação gera uma página de revisão listando os parâmetros selecionados, bem como quaisquer erros que possam ter surgido a partir da sobreposição dos sítios de ligação selecionados. O usuário pode seleccionar no botão "Voltar" se as alterações precisam ser no botão "Construir" para prosseguir feito ou.
  9. A próxima página mostra uma imagem estática do complexo DNA-proteína em seu arranjo mais alargada e permite a visualização interativa on-line via Jmol e Webmol. O usuário também pode fazer download de um arquivo de coordenadas (. APO) que está formatado de acordo com as especificações do PDB. Isso é feito selecionando o 'Faça o download do arquivo PDB reconstruída' link abaixo a imagem gerada. O último arquivo pode ser lido facilmente em um programa gráfico molecular para posterior visualização. Veja resultados representativos (Figura 6) para exemplos do DNA HBB decorados descrito acima e uma corrente um pouco mais (86 base-par), com o HBB centrado nas posições 20 e 67.

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Representative Results

As ferramentas de software 3DNA são rotineiramente usados ​​para analisar as estruturas de ácido nucleico. Por exemplo, as identidades de pares de bases e os parâmetros de corpo rígido que caracterizam os arranjos de bases em fragmentos de dupla hélice de DNA e RNA são estruturas automaticamente calculado e armazenado para cada nova entrada na base de dados de ácido nucleico de 22, um repositório de mundial informação estrutural do ácido nucleico. Os valores dos parâmetros de corpo rígido determinados com o Protocolo 2 revelam facilmente distorções na estrutura tridimensional, tal como os dois sítios de DNA no extremo dobra sulco maior, com grandes ângulos positivos rolo (64,95 ° C e 60,93 °), encontrado em · AT AT etapas 13 e 22 no complexo de cristal com a Borrelia burgdorferi proteína HBB 8 (Figura 1).

A capacidade do software para reconstruir as estruturas dessas quantidades com o Protocolo 3 torna possível determinar como abase de indivíduo e os passos de pares de base contribuir para a dobra molecular geral. Tal como ilustrado na Figura 2, a dobragem global de DNA induzidos por HBB reflete mais do que os dois extremos do rolo distorções acima referido. Ou seja, o ADN permanece curvo quando reconstituída com estes passos de pares de bases esticado, ou seja, com os ângulos de rolo nulos nos dois locais. A mesma técnica revelou previamente as contribuições de passos de pares de bases e deformações específicas para o campo superhelical do ADN envolvida na superfície da partícula de núcleo nucleossoma 6 e com a largura do sulco menor do ADN ligado para o nucleóide-bacteriano Fis proteína associada 23.

A nova capacidade em 3DNA, descrito no Protocolo 4, para analisar um grande número de estruturas relacionadas torna possível extrair tanto a sequência de padrões e dependentes do tempo nos arranjos espaciais de ADN e moléculas de ARN simulado. Por exemplo, o (amarelo) colou codificante do rolo entre os ângulos sucessivos pares de bases em dois grandes conjuntos de estruturas de DNA simulados 11 revela a dobragem preferencial destas moléculas em passos de pares de bases de purina-pirimidina (Figura 3). Os valores mais elevados de rolo, descritas no vermelho, que persistem por períodos curtos nas extremidades do ADN são sugestivos de fusão localizada e recombinação da estrutura helicoidal dupla. Os padrões variacionais de outros parâmetros de corpo rígido, como os ângulos e distâncias entre as bases complementares, pode ajudar a decifrar as distorções estruturais precisas.

A capacidade do software 3DNA, apresentado no Protocolo n º 5, de reorientar moléculas relacionadas em um quadro de referência comum, revela características da estrutura geral escondidos em muitos dos arquivos armazenados no PDB. Por exemplo, o alinhamento convencional de estruturas relacionadas na base de um ajuste de raiz quadrada média de átomos correspondentes produz uma série de vias espaciais semelhantes tchapéu sobrepor aproximadamente uns sobre os outros, aqui os dez modelos baseados em RMN do operador O3 DNA ligado aos capacetes da proteína do repressor Lac 12 (Figura 4, à esquerda). A superposição das mesmas estruturas em um sistema de coordenadas comum no par de bases 5'-terminal de cada duplex revela distorções consideráveis ​​de estrutura global, no qual as moléculas flex sensivelmente diferentes direções (Figura 4 à direita). A variabilidade estrutural pode influenciar a facilidade com que a Escherichia coli, a proteína do repressor Lac liga-se O3 e induz um laço entre O3 e operadores sequencialmente distantes do operão lac 24.

As etapas descritas no Protocolo no 6, para a construção de modelos de fragmentos de DNA de comprimento decorados em locais arbitrários com proteínas e outros ligantes, acrescenta uma nova perspectiva sobre a organização de conjuntos macromoleculares grandes. Tais modelos ajudam a entender como os complexos multi-molecularesinteragem durante o processamento biológico. Tal como ilustrado na Figura 6, o posicionamento preciso de uma proteína de arquitectura como HBB pode ter um efeito dramático sobre a dobragem geral de ADN. Se duas cópias da estrutura de alta resolução conhecido 8 estão separados por 43 pares de bases, um fragmento de ADN de 81 pares de bases fecha numa configuração apertada, quase fechada. Se as duas proteínas são separadas por um período adicional de cinco pares de bases, o ADN segue um, sinuosos via aberta. Os diferentes arranjos do decorados proteína mostram duplex como o espaçamento de proteínas de arquitetura podem afetar a ciclização ou looping de DNA 25, 26.

Figura 1
Figura 1. Variação do ângulo de rolagem entre pares de bases sucessivas (ver inserção de representação visual) ao longo do DNA chaem ligado à proteína HBB de Borrelia burgdorferi 8. valores obtidos utilizando o comando 'analisar' de 3DNA e os dados estruturais descritas no Protocolo 2. Observe os valores extremos de rolo no AT passos que suporte o terço central da estrutura.

Figura 2
Figura 2. Modelos atômicos aproximados de DNA construído utilizando a função 'reconstruir' de 3DNA e rendido em PyMOL com átomos codificados por cores (C-cyan, N-azul, O-vermelha; P-ouro). Modelos baseados em (esquerda) os parâmetros da proteína e HBB (direita) de um conjunto de parâmetros modificados passo, onde os dois maiores valores de rolo foram definidos a zero passo de corpo rígido. Veja Protocol 3 para obter instruções passo-a-passo . Observe o desdobramento do DNA induzidos pelas mudanças impostas no rolo.


Figura 3. Mosaico de imagens dos ângulos de rolo ao longo do DNA em dois conjuntos de estruturas simuladas 11. Valores de rolo, extraídos usando o protocolo 4, são codificados por cores de azul para vermelho sobre o intervalo [-5 °, 20 °]. Observe a ordem inversa de bases e grandes valores de rolo, com destaque para as colunas amarelos / vermelhos, que ocorrem em etapas pirimidina-purina nas duas seqüências de 14 pares de bases auto-complementares.

Figura 4
Figura 4. Imagens dos desenhos animados dos modelos de DNA encontrados nas estruturas de RMN derivados do operador ADN O3 com as proteínas repressor lac capacetes 12 ilustrativos das capacidadesdos "x3dna_ensemble reorientar 'comando. imagens renderizadas em PyMOL (backbones mostrar como tubos de ouro e bases como varas azuis) e alinhadas usando (à esquerda) as coordenadas na entrada do PDB (2kek) e (direita) a superposição estrutural apresentada no protocolo 5 . Observe as grandes diferenças entre as estruturas a serem colocados numa estrutura de referência comum no par de base 5'-terminal.

Figura 5
Figura 5. Screen shot do servidor web w3DNA ilustrando as especificações da seqüência de DNA (etiqueta 1), a forma helicoidal do DNA livre (etiqueta 2), as posições e identidades de proteínas (etiqueta 3), e na caixa de seleção imagem de visualização (etiqueta 4) descrito no Protocolo 6. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 6
Figura 6. Modelos atômicos aproximados de duas proteínas HBB oito ligados a um fragmento de DNA de comprimento. Estruturas criadas com o servidor web w3DNA conforme descrito no Protocolo 6 e rendido em PyMOL. As cadeias de proteínas são show como fitas violeta, enquanto o DNA é de cor-codificado por tipo de átomo (C-cyan, N-azul, O-vermelha; P-ouro). A par de todos os sites de ligação proteica base central está fixado em posições (esquerda) 20 e 62 ao longo da cadeia de DNA de pares de bases e 81 (direita) de 20 e 67 junto a 86 pares de bases da cadeia de DNA. Note-se a grande mudança na dobragem das estruturas associadas com o aumento (cinco pares de bases) de deslocamento das duas proteínas.

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Discussion

O conjunto de protocolos apresentados neste artigo apenas abordar as capacidades da suíte 3DNA de programas. As ferramentas podem ser aplicados a estruturas de ARN para identificar pares de bases não canónicas, para determinar os contextos estruturais secundárias em que tal ocorre o emparelhamento, para quantificar a disposição espacial dos fragmentos helicoidais, para medir a sobreposição de bases ao longo da cadeia principal, etc O comando de reconstrução permite ao usuário construir representações bloco simples e informativo das bases e pares de bases como o mostrado na inserção a figura 1. As ferramentas de construção também incluem recursos para 'rosca' sequências diferentes em um determinado modelo estrutural, para gerar modelos de numerosas estruturas de DNA de dupla, tripla, e quatro-stranded, para orientar as modelos em uma direção específica, etc Finalmente, 3DNA tem desempenhado um papel importante em uma série de outros projetos, tais como: o serviço de web solvation SwS de ácidos nucléicos 27, o servidor web para ARTSalinhando RNA estruturas terciárias 28, a ferramenta web-based MDDNA para a análise dos resultados da dinâmica molecular e previsão de estrutura 29, a informação HADDOCK-driven DNA-proteína método de ancoragem 30, o servidor SARA para função de anotação de estruturas do RNA 31, o 3D DART servidor modelar a estrutura do ADN 32, a base de dados 3D de rodapé para a análise estrutural de complexos proteína-ADN 33, a base de dados de RNA FRABASE 2.0 para a identificação de fragmentos tridimensionais dentro de estruturas de RNA 34, o servidor da web e Setter dos comparativos emparelhados de estruturas de RNA 35. Para o melhor de nosso conhecimento, não há atualmente nenhum outro pacote de software de estrutura de ácido nucleico com uma ampla combinação de características comparáveis ​​eo registro do desempenho robusto de 3DNA.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

Somos gratos ao Patrocinador Jiří para compartilhar as coordenadas de hélices duplas de DNA gerados em simulações de dinâmica molecular. Também reconhecemos Nada Spackova de assistência em baixar essas estruturas. Apoio a este trabalho através de USPHS Bolsas de Investigação GM34809 e GM096889 é reconhecido agradecimento.

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