Het analyseren en opbouwen nucleinezuurstructuren met 3DNA

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

De 3DNA softwarepakket is een populaire en veelzijdige bioinformatica tool met mogelijkheden om te analyseren, construeren, en drie-dimensionale nucleïnezuur structuren te visualiseren. Dit artikel presenteert gedetailleerde protocollen voor een subset van nieuwe en populaire functies die beschikbaar zijn in 3DNA, van toepassing op zowel individuele structuren en ensembles van verwante structuren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Colasanti, A. V., Lu, X. J., Olson, W. K. Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA. J. Vis. Exp. (74), e4401, doi:10.3791/4401 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De 3DNA softwarepakket is een populaire en veelzijdige bioinformatica tool met mogelijkheden om te analyseren, construeren, en drie-dimensionale nucleïnezuur structuren te visualiseren. Dit artikel presenteert gedetailleerde protocollen voor een subset van nieuwe en populaire functies die beschikbaar zijn in 3DNA, van toepassing op zowel individuele structuren en ensembles van verwante structuren. Protocol 1 bevat de set van instructies die nodig zijn om de software te downloaden en te installeren. Dit wordt gevolgd in Protocol 2, door de analyse van een nucleïnezuurstructuur, inclusief het ontwikkelen van basenparen en de bepaling van starre lichamen parameters die de structuur beschreven en in Protocol 3, met een beschrijving van de reconstructie van een atomaire model van een structuur van de starre lichamen parameters. De meest recente versie van 3DNA, versie 2.1, heeft nieuwe functies voor de analyse en manipulatie van ensembles van structuren, zoals die afgeleid uit nucleaire magnetische resonantie (NMR) metingen en moleculaire dynamische (MD) Simulaties; deze functies worden in protocollen 4 en 5. Naast de 3DNA stand-alone softwarepakket, de w3DNA webserver bij http://w3dna.rutgers.edu , verschaft een gebruikersvriendelijke interface om geselecteerde functies van de software. Protocol 6 toont een nieuw kenmerk van de site voor het bouwen van modellen van lange DNA-moleculen versierd met gebonden eiwitten op door de gebruiker opgegeven locaties.

Introduction

Inzicht in de driedimensionale structuur van DNA, RNA en hun complexen met eiwitten, geneesmiddelen en andere liganden, is cruciaal voor het ontcijferen van de diverse biologische functies, en om het rationeel ontwerpen van geneesmiddelen. Verkenning van dergelijke structuren bestaat uit drie afzonderlijke, maar nauw verbonden onderdelen: analyse (om patronen uit te pakken in de vormen en interacties), modellering (op energetica en moleculaire dynamica te beoordelen), en visualisatie. Structurele analyse en modelbouw zijn in wezen twee kanten van dezelfde medaille, en visualisatie vult beiden.

De 3DNA suite van computerprogramma's is een steeds populairder wordende structurele bio toolkit met mogelijkheden om te analyseren, construeren, en visualiseer driedimensionale nucleïnezuur structuren. Eerdere publicaties schetste de mogelijkheden van de software 1, mits recepten om geselecteerde taken uit te voeren 2, introduceerde de webgebaseerde interfacenaar populaire functies van de software 3, gepresenteerd databases van structurele kenmerken verzameld met behulp van 3DNA 4, 5 vlak en de bruikbaarheid van de software in de analyse van zowel DNA en RNA structuren 6, 7.

Het doel van dit artikel is om de 3DNA software kit te brengen naar het laboratorium wetenschappers en anderen met belangen en / of behoeften aan DNA en RNA ruimtelijke organisatie met state-of-the-art computationele gereedschappen te onderzoeken. De protocollen die hier voorgesteld zijn stap-voor-stap instructies (i) om de software te downloaden en te installeren op een Mac OS X-systeem, (ii-iii) om DNA te analyseren en aan te passen op het niveau van de samenstellende stappen base-pair, ( iv-v) te analyseren en af ​​te stemmen sets van verwante DNA-structuren, en (vi) de modellen van de eiwit-versierde DNA-ketens met de gebruiksvriendelijke w3DNA webinterface te bouwen. De software heeft de mogelijkheid om te analyseren individuele structuren opgelost met behulp van X-ray kristallografische methoden als groteensembles structuren bepaald met nucleaire magnetische resonantie (NMR) methode of gegenereerd door computer-simulatietechnieken.

De hier onderzochte structuren omvatten (i) de hoge-resolutie kristalstructuur van DNA gebonden aan de HBB eiwit van Borrelia burgdorferi 8 (de tick-borne bacterie die ziekte veroorzaakt Lyme bij mensen 9, 10), (ii) twee grote sets opeenvolgend Verwante DNA-moleculen geproduceerd moleculaire simulaties 11 - 4500 snapshots van d (GGCAAAATTTTGCC) 2 en d (CCGTTTTAAAACGG) 2 tijdens de berekeningen op 100 psec stappen verzameld, en (iii) een klein ensemble van NMR gebaseerde structuren van de O3 DNA operator gebonden aan de hoofddeksels van de Escherichia coli Lac repressor eiwit 12. De onderstaande instructies bevatten informatie over hoe u toegang tot de bestanden van atoomcoördinaten geassocieerd met elk van deze structuren, alsook hoe 3DNA (een kopie van dit bestand wordt gevonden gebruikenop de 3DNA forum op http://forum.x3dna.org/jove ) om deze structuren te onderzoeken en aan te passen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. De installatie van het softwarepakket

  1. Aansluiten op de 3DNA website op http://x3dna.org en klik op de link om de 3DNA Forum. Binnen het Forum selecteer de 'registreer' link en volg de instructies om een ​​nieuwe account te maken.
  2. De volgende instructies detail installatie van de software op een OS X-gebaseerde Macintosh-computer met een standaard 'bash' schil. De procedure voor Linux of Windows (Cygwin, MinGW / MSYS) systemen met veelgebruikte schelpen (inclusief 'tcsh') wordt gevonden binnen de 3DNA Forum.
  3. Zodra je een gebruikersnaam en wachtwoord hebt ingesteld, inloggen op het forum. Selecteer de link 'Downloads' in het gedeelte Welkom en op de nieuwe pagina kiezen '3 DNA download '. Dit brengt u naar de 3DNA downloadpagina waar verschillende versies van de software kan worden gedownload.
  4. Selecteer de Mac OS X Intel link naar een gecomprimeerd tar bestand (tar.gz) met de software te downloaden.
  5. Dubbele click op de (tar.gz) bestand naar een map met de naam x3dna-v2.1 creëren. Deze map, die de 3DNA software suite bevat, kan worden verplaatst naar een locatie. Voor de toepassing van dit recept, we slepen en neerzetten in de map 'Programma's'. In dit stadium u klaar bent met het tar.gz bestand en kan deze verwijderen.
  6. Open het programma Terminal, doorgaans te vinden onder 'Hulpprogramma's', en ga naar de x3dna-v2.1-map gemaakt in stap 5 met het volgende commando (hier en in alle van de onderstaande instructies door een harde return afgelopen):
    cd / Applications/x3dna-v2.1
  7. Voer het setup script nodig voor 3DNA goed te laten functioneren door te typen:
    ./bin/x3dna_setup
  8. Kopieer de twee-lijn export instellingen gedrukt in Stap 7. Als de gebruiker de software heeft geplaatst in de directory van de 'Applications', moeten de twee lijnen als volgt:
    export X3DNA = / Applications/x3dna-v2.1
    export PATH = / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH
    Een ander woord naast 'Toepassingen' zal appear in het commando export als de gebruiker heeft gekozen om de software te installeren in een andere map. Deze alternatieve directory naam 'Applications' in de bovenstaande twee commando's te vervangen. Merk op dat als de standaard shell is 'tcsh' in plaats van 'bash', de inhoud van de twee lijnen zou zijn: setenv X3DNA / Applications/x3dna-v2.1 en setenv PATH / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH.
  9. Check in 'Finder' om te zien of een bestand genaamd '. Bashrc' al bestaat op uw computer.
  10. Open de TextEdit toepassing gevonden in de directory 'Toepassingen' en selecteer 'Make Plain Text' onder het menu 'Format'.
  11. Als de '. Bashrc' bestand van stap 9 bestaat, opent u het bestand in TextEdit en plak de uitvoer instellingen van Stap 8 tot het einde van het bestand. Als er geen '. Bashrc' file verlaat, plak de uitvoer instellingen van Stap 8 in een leeg bestand en sla met de bestandsnaam '. Bashrc' in je home directory. (De home directory wordt aangeduid met een 'huis' icoon op de Macintosh.)
  12. Om de nieuwe instellingen te be beschikbaar zijn, moet u de zojuist opgeslagen '. Bashrc' bestand uit te voeren met behulp van het volgende commando in de Terminal-programma:
    bron ~ /. bashrc
  13. De 3DNA suite is nu geïnstalleerd op uw systeem en u kunt Protocollen 2-5 voeren binnen het Terminal-programma. Protocol 6 is uitgevoerd met behulp w3DNA, een webinterface aan geselecteerde kenmerken van de 3DNA software.

2. Analyse van een Crystal Structure

  1. We illustreren de analyse van een nucleïnezuur structuur met het DNA gebonden aan de HBB eiwit van Borrelia burgdorferi 8. Het bestand van atoomcoördinaten geassocieerd met deze structuur is te vinden op de Protein Data Bank 13 (VOB; http://www.rcsb.org ), waar het de structurele identifier 2np2 wordt toegewezen. De begeleidende aanvullende gegevens zijn een kopie van dit bestand, die ook te vinden op de 3DNA forum op http://forum.x3dna.org/jove.
  2. De eerste stap in de 3DNA analyse van de structuur is het creëren van een bestand dat alle van de gepaarde basen bevat. Dit wordt gedaan met de 'find_pair' programma door het volgende te typen:
    find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
    Hier 2np2.pdb is de input file van hierboven beschreven atoomcoördinaten en 2np2.bps is de output tekstbestand dat de base-paring informatie bevat. De laatste baseparen bestand kan worden bekeken en bewerkt door de gebruiker indien nodig.
  3. De volgende stap in de analyse van de geometrische parameters die de structuur karakteriseren bepalen. Deze omvatten standaard chemische torsiehoeken 14, pseudorotation hoeken die beschrijven het rimpelen van de suiker ring 15, starre-lichaam parameters die de regelingen van de bases en de opeenvolgende basenparen 16, en andere maatregelen van de drie-dimensionale chemische structuur te geven. Het commando 'analyseren' neemt als input het bestand base-pair gegenereerd in stap 2 en creëert verschillende output bestanden, die in de huidige werkdirectory verschijnen. Deze waarden worden berekend door het intikken van de volgende opdracht:
    analyseren 2np2.bps
    De output bestanden die hier gebruikt behoren 2np2.out, waarin een overzicht van de berekende parameters bevat, en bp_step.par, die een lijst van de starre-lichaam parameters hierboven beschreven bevat. Deze laatste bestand kan eenvoudig worden ingelezen in een spreadsheet programma voor verdere analyse en plotten. Zie Representatieve resultaten (figuur 1) voor een voorbeeld.

3. Bouw van een DNA-structuur van Rigid-body Parameters

  1. In aanvulling op de analyse van een nucleïnezuur structuur, 3DNA software biedt de mogelijkheid om een ​​structuurmodel opgebouwd uit starre lichamen parameters met de opdracht 'verbouwing'. In dit protocol laten we zien hoe de bouw van twee DNA-helix-modellen, eerst met behulp van de starre-lichaam parameters van de HBB-DNA-complex zoals berekend in Protocol nr. 2 en vervolgens met behulp van een aangepaste set parameters in which geselecteerde roll hoeken worden veranderd. De rolhoek meet de mate van buiging van opeenvolgende basenparen in de groeven van het DNA 16. Positieve waarden van rollen worden geassocieerd met de vernauwing van de grote groef en negatieve waarden met de vernauwing van de kleine groef. De standaard referentiekader 17 door 3DNA en andere populaire nucleïnezuur analyse software aangenomen, bijvoorbeeld Curves + 18, verzekert numerieke consistentie in de berekende parameters van Watson-Crick baseparen.
  2. Standaard zal de 3DNA 'rebuild' functie exacte atoommodellen dat alleen de coördinaten van de atomen in de stikstofbasen bevatten. Om een ​​benaderende atoom-model, dat de coördinaten van zowel ruggengraat en de basis atomen bevat, typt u de volgende opdracht:
    x3dna_utils cp_std bDNA
    Deze opdracht 3DNA een standaard B-DNA backbone conformatie te introduceren in de bouw van modellen uit starre-lichaam parameters.
  3. Om Build van een dubbele-helix model met de starre-lichaam parameters gevonden in de HBB-DNA-structuur, typt u het volgende:
    herbouwen-atomaire bp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
    Hier-atomaire 'specificeert de bouw van een all-atoom-model met atoomcoördinaten voor alle zware (niet-waterstof) atomen,' bp_step.par 'is het bestand gegenereerd in stap 3 van het Protocol nr. 2 die de ingevoerde starre-lichaam parameters bevat en '2 np2_rbld_org.pdb 'is het output bestand met de atomaire coördinaten van de geschapen structuur. Dit laatste bestand is opgemaakt in overeenstemming met de specificaties van de VOB en dus eindigt met '. Pdb'.
  4. De 'bp_step.par' bestand kan worden bewerkt tot een gewijzigde structuur te genereren. Op een Macintosh, kunnen de veranderingen worden uitgevoerd met de TextEdit toepassing zoals beschreven in protocol 1 Stap 10.
  5. Hier passen we de extreme roll hoeken gevormd op de twee locaties van de grootste buiging. De waarden die worden uitgedrukt in graden, worden veranderd naar nul uit waarden van 64,95 in de lijn 17 en 600,93 in lijn 26. We redden het gewijzigde bestand met een nieuwe naam, 'bp_step_roll0.par', en sluit het programma Teksteditor.
  6. Wij bouwen de structuur, zoals in stap 3, met de gewijzigde set van stap parameters als de input bestand door te typen:
    herbouwen-atomaire bp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
  7. De twee modellen kunnen worden bekeken in een standaard moleculaire kijker, zoals PyMOL ( www.pymol.org ), met behulp van de gegenereerde coördinaat bestanden (. pdb) als input. Zie Representatieve resultaten (figuur 2) voor afbeeldingen van de herbouwde structuren.

4. Analyse van de Multi-model Structuur Files

  1. In tegenstelling tot Protocol nr. 2, waarin analyseren we een nucleïnezuur bevattende structuur, hier laten we zien hoe je een groot ensemble van structuren te analyseren. We onderzoeken de variatie in de tijd van de starre-lichaam parameters langs een reeks van 14 baseparen DNA-ketens verkregen van moleculaire-dynamica (MD) simulaties 11 http://forum.x3dna.org/jove .
  2. De eerste stap in de analyse is dezelfde als die uitgevoerd in protocol 2, identificatie van de gepaarde basen door uitvoering van de "find_pair" programma. Aangezien de gehele set van structuren deelt dezelfde baseparende regeling moet men 'find_pair' run slechts een keer op een representatief bestand. Hier kiezen we de 1001-structuur in de simulatie van DNA-ketens die een centrale AT stap, met de bestandsnaam md_AT_set1.pdb.1001. De volgende instructie generates de baseparende informatie en slaat deze op in het bestand md_AT_set1.bps:
    find_pair md_AT_set1.pdb.1001 md_AT_set1.bps
    De gebruiker kan het geïdentificeerde base paring onderzoeken en handmatige wijzigingen in het bestand op basis van kennis van de structuur.
  3. De volgende stap is de geometrische parameters van het geheel van structuren gebruiken "x3dna_ensemble analyseren 'commando bepalen. Het programma gebruikt als input het bestand basenparen gegenereerd bij stap 2 (md_AT_set1.bps) en een bestand met een lijst van de structuur te analyseren. Het laatste bestand, hier genoemd md_AT_set1.list, bevat de 4500-bestanden te analyseren, met de bestandsnamen ingevoerd op afzonderlijke regels in de volgorde die door de MD simulatie. Een kopie van dit bestand is opgenomen in het aanvullende materiaal en bood ook aan de 3DNA Forum. De gebruiker moet worden gewaarschuwd, vanwege het grote aantal bestanden, die de rekentijd kan lang (~ 20 min per 1000 bestanden op AMD Phenom II X4 965 processor). The opdracht wordt uitgevoerd door het volgende te typen:
    x3dna_ensemble analyseren-b md_AT_set1.bps-l md_AT_set1.list-o md_AT_set1.out
    In het bovenstaande voorbeeld '-b' heeft betrekking op de basis-pair-bestand gemaakt in stap 2, '-l' geeft aan dat een lijst met bestanden wordt gegeven, en '-o' kan de gebruiker een naam toewijzen aan de output file. Er zijn vele opties die kunnen worden gebruikt in combinatie met de opdracht 'x3dna_ensemble analyseren, zoals selectie van specifieke modellen. De gebruiker kan typen 'x3dna_ensemble analyseren-h' voor meer informatie over deze opties te verkrijgen.
  4. De volgende stap is om de gewenste starre lichamen te extraheren uit het overzicht uitvoerbestand md_AT_set1.out, geproduceerd in stap 3. Dit wordt uitgevoerd met de opdracht 'x3dna_ensemble extract'. Een overzicht van de beschikbare geometrische parameters kunnen worden gevonden door te typen 'x3dna_ensemble extract-l'. Hier halen we de roll hoeken en een door komma's gescheiden tekstbestand (CSV) van de roll hoeken met het volgende commando:
    x3dna_ensemble extract-proll-s,-f md_AT_set1.out-o md_AT_set1_roll.csv
    De '-p roll' in deze opdracht specificeert de parameter die moet worden onttrokken, de '-s, "betekent een door komma's gescheiden bestand, de'-f 'staat voor de output file verkregen van het ensemble te analyseren commando, en de'-o 'kan de gebruiker het CSV output file van rolhoeken naam langs DNA in alle geanalyseerde constructies. Dit bestand kan worden gelezen in andere programma's voor verdere analyse en plotten. Zie Representatieve resultaten (figuur 3) voor de analyse van de variatie van rollen in de twee hierboven beschreven MD-gegenereerde datasets en de 3DNA Forum voor de MATLAB script gebruikt om deze beelden te genereren.

5. Superpositie van Multi-model Structures naar een Common Reference Frame

  1. De meest recente versie van 3DNA (versie 2.1) heeft een nieuwe functie waarmee de gebruiker om te kijken naar meerdere structuren vanuit een gemeenschappelijk perspectief. De opdracht 'x3dna_ensemble heroriënteren' superponeert een verzameling van gerelateerde structures op een gemeenschappelijke basis pair of stap base-paar. Het volgende protocol geldt deze mogelijkheid om de NMR-afgeleide structuren van het O3 DNA operator gebonden aan de hoofddeksels van de Lac-repressor-eiwit 12. Deze structuren worden opgeslagen in het VOB onder identifier 2kek in een multi-model structurele file, waarin alle structuurmodellen in een bestand, in plaats van afzonderlijke bestanden zoals die voor elk van de 4500 modellen in Protocol 4 bevat. De begeleidende aanvullende gegevens zijn een kopie van dit bestand, die ook te vinden op de 3DNA forum op http://forum.x3dna.org/jove .
  2. Zoals in eerdere protocollen, de eerste stap is om de baseparing van de DNA berekenen met de 'find_pair "programma. In dit geval gebruiken we als input het bestand '2 kek.pdb 'en typ het volgende:
    find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
    De baseparing wordt gegenereerd met behulp van het eerste model in de pdb bestand. Handmatige correcties op de uitgestuurde base-pair bestand kek.bps '2 ', kan worden gebaseerd op kennis van de structuur.
  3. Het programma 'x3dna_ensemble heroriënteren' zal lijn de individuele modellen in een multi-modelstructuur op een gemeenschappelijk referentiekader. Dit programma vereist zowel het pdb bestand en de base-paring bestand uit de vorige stap als input en wordt uitgevoerd met het volgende commando:
    x3dna_ensemble heroriënteren-b 2kek.bps-f 1-e 2kek.pdb-o 2kek_fr1.pdb
    Hier optie '-b' geeft de basenparing file, de "-f 1" geeft de basenparen waarop alle structuren zijn uitgelijnd, in casu basenpaar 1 aan het 5'-uiteinde van de sequentie-dragende streng, de '-e' specificeert de ingang ensemble-bestand, en de '-o' kan de gebruiker een output bestandsnaam te voorzien, in dit geval '2 kek_fr1.pdb '. Meer informatie over de opties van de opdracht kan worden verkregen door te typen 'x3dna_ensemble heroriënteren-h'. Zie Representatieve resultaten (figuur 4) voor bespreking van de aangepaste structuren.

6. Constructie van een eiwit-versierde DNA Molecule

  1. De w3DNA webinterface bevat enkele populaire functies van de 3DNA softwarepakket. Hier vestigen wij de aandacht op de mogelijkheid om driedimensionale modellen van eiwit-versierd DNA-construct met de webserver. De gebonden DNA-fragmenten neemt de starre lichamen parameters van het geselecteerde eiwit-DNA-complexen, hier de waarden van het DNA gebonden aan de HBB eiwit geanalyseerd Protocol 2. De ongebonden DNA gebieden kan een van drie door de gebruiker geselecteerde spiraalvormige vormen (A, B of C) vast. De A, B en C verwijzen naar drie canonieke modellen van DNA, verkregen van vroege vezel diffractie experimenten, respectievelijk 11, 10 en 9 baseparen per winding van een dubbele helix 19-21.
  2. De eerste stap in het bouwen van een eiwit-versierde DNA-model is aan de w3DNA website op bezoek http://w3dna.rutgers.edu . Selectie van de 'Wederopbouw' uit het menu aan de linker kant van de pagina activeert het online model-gebouw mogelijkheden.
  3. De volgende stap is het "Gebonden eiwit-DNA template 'link' in de licht gearceerde box in het midden van de nieuwe pagina. Deze selectie zal een pull-down menu, waarmee de gebruiker om het aantal gebonden eiwitten te specificeren activeren. Hier twee gebonden eiwitten selecteren we en klik op de knop 'Doorgaan'. Merk op dat de modellen beperkt in grootte tot 1.000 basenparen, of 2000 nucleotiden, en dertig gebonden eiwitten.
  4. Selectie van het aantal gebonden eiwitten leidt tot een specificatiebladzijde soortgelijk aan die getoond in figuur 5. Op deze pagina kan de gebruiker de DNA-sequentie, de schroefvorm van het ongebonden DNA en de identiteit en locatie van de gebonden eiwitten te specificeren.
  5. De gebruiker typt of pasta's in de gewenste volgorde in het tekstvak in het midden van de pagina met specificaties (figuur 5, Label 1). Opmerking alleen standaard residuen - A, T, C, G, en U - worden geaccepteerd. Hier betreden we een 81 basenpaar homopolymer, geheel samengesteld uit A · T paren met de A in de sequentie-dragende streng.
  6. Er is een pull-down menu (Figuur 5, Label 2), onder het tekstvak, de helix conformatie van de ongebonden gebieden van DNA te selecteren. In dit voorbeeld kiezen we voor het B-formulier conformatie.
  7. Er is een tekstvak in de buurt van de onderkant van de pagina met specificaties om de binding positie (s) en de bestandsnaam (en) van het gebonden eiwit (s) (Figuur 5, Label 3) in te voeren. De bindpositie geeft de locatie van het centrum van het eiwit-fragment gebonden aan de DNA-sequentie. Als het gebonden DNA een oneven aantal basenparen, zoals in de HBB-DNA-structuur, de bindpositie geeft de locatie van het midden van de basepaar fragment. Bij HBB-gebonden DNA, dit middelpunt basenpaar is een T · T mispair. In dit voorbeeld, waar we binden twee exemplaren van de HBB eiwit aan de DNA-template, is het T · T pair geplaatst op posities 20 en 63 van de 81 base-paren DNA seQuence. Merk op dat de sequentie van het fragment gebonden niet samen te vallen met die in stap 5 opgenomen. Als het eiwit-gebonden gebied bevat een even aantal baseparen, de bindpositie geeft de locatie van de middelste stap basenpaar op DNA. Dat wil zeggen de centrale basenpaarstap van de gebonden fragment geplaatst tussen baseparen n en n +1, waarbij n het gespecificeerde nummer en het segment. Merk ook op dat de gebruiker kan de DNA versieren met een eiwit is, zolang de structuur van het complex met DNA is bekend en opgeslagen in standaard PDB format 13.
  8. Aan de onderkant van de pagina met specificaties is er een doos waarmee de gebruiker om een voorbeeld van de proteïne-gebonden DNA (Figuur 5, Label 4) te genereren. Hier checken we dat vak en klik op de knop 'Doorgaan'. Deze actie genereert een review pagina met een overzicht van de geselecteerde parameters alsmede eventuele fouten die zijn ontstaan ​​uit de overlapping van de geselecteerde bindingsplaatsen. De gebruiker kan seteer de 'Back' knop wanneer er veranderingen moeten worden aangebracht of de 'Build' knop om verder te gaan.
  9. De volgende pagina toont een statisch beeld van de DNA-eiwit complex in zijn meest uitgebreide regeling en zorgt voor on line interactieve visualisatie via Jmol en Webmol. De gebruiker kan ook een coördinaat (. Pdb) bestand dat is opgemaakt in overeenstemming met de specificaties van de VOB te downloaden. Dit wordt gedaan door de 'Download de herbouwde pdb bestand "link onder de gegenereerde afbeelding te selecteren. Deze laatste bestand kan eenvoudig worden ingelezen in een moleculaire grafisch programma voor verdere visualisatie. Zie Representatieve resultaten (Figuur 6) voor voorbeelden van de HBB ingerichte DNA bovenbeschreven en iets langer (86 baseparen) keten met HBB gecentreerd op posities 20 en 67.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De 3DNA software tools worden routinematig gebruikt om nucleïnezuur structuren te analyseren. Bijvoorbeeld, worden de identiteit van basenparen en starre lichamen parameters die de regeling van basen in de dubbele helix-fragmenten van DNA en RNA structuren karakteriseren automatisch berekend en opgeslagen voor elke nieuwe invoer in het Nucleic Acid database 22, een wereldwijde repository van nucleïnezuur structurele informatie. De waarden van de starre lichamen parameters bepaald protocol 2 gemakkelijk blijkt verstoringen in de driedimensionale structuur, zoals de twee gebieden van extreme buiging in de grote groef, met grote positieve rolhoeken (64,95 ° en 60,93 °), op site · AT AT stappen 13 en 22 in het kristal complex met de Borrelia burgdorferi HBB eiwit 8 (figuur 1).

Het vermogen van de software om structuren bouwen van deze hoeveelheden Protocol 3 maakt het mogelijk te bepalen hoe individu base en base-pair stappen bijdragen tot de algemene moleculaire vouw. Zoals geïllustreerd in figuur 2, de globale buigen van DNA veroorzaakt door HBB weerspiegelt meer dan twee extreme roll verstoringen hierboven vermeld. Dat is, het DNA blijft zeer gebogen wanneer gereconstrueerd deze basenpaar stappen rechtgetrokken, dwz met null rolhoeken op twee locaties. Dezelfde techniek is reeds gebleken dat de bijdrage van specifieke basenpaar stappen en vervormingen superhelische de toonhoogte van het DNA gewikkeld op het oppervlak van het kerndeeltje nucleosoom 6 en de breedte van de kleine groef van DNA gebonden aan het bacteriële Nucleoid- geassocieerd eiwit 23 Fis.

De nieuwe mogelijkheid in 3DNA, in Protocol 4 beschreven, grote aantallen verwante structuren onderzoeken maakt het mogelijk om zowel sequentie-en tijdsafhankelijke patronen extract in de ruimtelijke schikking van gesimuleerde DNA en RNA-moleculen. Bijvoorbeeld, de (gele) colof-codering van de rol hoeken tussen opeenvolgende basenparen in twee grote groepen van gesimuleerde DNA structuren 11 laat de voorkeurbuigzones van deze moleculen op pyrimidine-purine stappen basenparen (Figuur 3). De hogere waarden van schermen, afgebeeld in rood, die blijven bestaan ​​gedurende korte tijd aan de uiteinden van de DNA suggereren gelokaliseerde smelten en opnieuw annealen van de dubbele helixstructuur. De variationele patronen van andere starre lichamen parameters, zoals de hoeken en afstanden tussen complementaire basen, helpen ontcijferen van de precieze structurele vervormingen.

Het vermogen van de 3DNA software, gepresenteerd in Protocol 5, om verwante moleculen te heroriënteren in een gemeenschappelijk referentiekader, onthult kenmerken van algehele structuur verborgen in veel van de bestanden die zijn opgeslagen in het VOB. Bijvoorbeeld, conventionele afstemmen van verwante structuren op basis van een wortel-gemiddelde kwadraten van overeenkomstige atomen produceert een reeks soortgelijke ruimtelijke trajecten thoed ruwweg superponeren op elkaar, hier de tien NMR-gebaseerde modellen van de O3 DNA operator gebonden aan de hoofddeksels van de Lac-repressor-eiwit 12 (figuur 4 links). De superpositie van dezelfde structuren op een gemeenschappelijk coördinatenstelsel aan de 5'-terminale base paar van elk duplex onthult aanzienlijke vervalsing van de globale structuur, waarbij de moleculen buigen in verschillende richtingen aanzienlijk (figuur 4 rechts). De structurele variabiliteit kan het gemak waarmee de Escherichia coli Lac repressor eiwit bindt O3 en induceert een lus tussen O3 en achtereenvolgens ver operators in het lac operon 24 beïnvloeden.

De in Protocol 6 stappen, voor het bouwen van modellen van lange DNA-fragmenten ingericht op willekeurige sites met proteïnen en andere liganden, voegt een nieuw perspectief op de organisatie van grote macromoleculaire assemblages. Dergelijke modellen helpen om te begrijpen hoe de multi-moleculaire complexeninteractie tijdens de biologische verwerking. Zoals geïllustreerd in figuur 6, kan de precieze plaatsing van een architectonisch eiwitachtige HBB een dramatisch effect op de algemene vouwing van DNA hebben. Indien twee exemplaren van de bekende hoge-resolutie structuur 8 worden gescheiden door 43 basenparen, een 81 baseparen DNA fragment sluit in een strakke, bijna gesloten configuratie. Als de twee eiwitten worden gescheiden door een extra vijf basenparen, het DNA is een open, meanderende traject. De zeer verschillende regelingen van de eiwit-ingerichte maisonnette tonen hoe de afstand tussen architectonische eiwitten kan invloed hebben op de cyclisatie of de looping van DNA 25, 26.

Figuur 1
Figuur 1. Variatie van de roll hoek tussen opeenvolgende basenparen (zie kader voor visuele voorstelling) langs de DNA-chain gebonden aan de HBB-eiwit van Borrelia burgdorferi 8. Waarden verkregen met behulp van het 'analyseren' commando van 3DNA en de structurele gegevens in Protocol nr. 2 beschreven. Noteer de uiterste waarden van rollen op het AT stappen bracket het centrale derde van de structuur.

Figuur 2
Figuur 2. Geschatte atoommodellen van DNA gebouwd met behulp van de 'wederopbouw' functie van 3DNA en teruggegeven in PyMOL met kleurgecodeerde atomen (C-cyaan, N-blauw; O-rood; P-goud). Modellen op basis van (links) de starre-lichaam stap parameters van de HBB eiwit en (rechts) een gewijzigde set van stap parameters, waar de twee grootste waarden van rollen zijn ingesteld op nul. Zie Protocol nr. 3 voor de stap-voor-stap instructies . Let op het ontvouwen van DNA geïnduceerd door de opgelegde veranderingen in de rol.


Figuur 3. Mozaïek beelden van de roll hoeken langs het DNA in twee sets van de gesimuleerde structuren 11. Waarden van roll, gewonnen met behulp van Protocol nr. 4, hebben een kleurcode van blauw naar rood over het bereik [-5 °, 20 °]. Op het tegengestelde basenvolgorde en grote waarden van rollen hoogtepunt geel / rood kolommen, die optreden met pyrimidine-purine stappen in de twee 14 baseparen zelf-complementaire sequenties.

Figuur 4
Figuur 4. Cartoon beelden van de DNA-modellen gevonden in de NMR-afgeleide structuren van het O3 DNA-operator met de Lac-repressor-eiwit hoofddeksels 12 illustratief voor de mogelijkhedenvan de 'x3dna_ensemble heroriënteren' commando. Images gesmolten in PyMOL (backbones zien zijn als goud buizen en basen zoals blauwe stokken) en uitgelijnd met behulp van (links) de coördinaten in het VOB invoer (2kek) en (rechts) de structurele superpositie gepresenteerd in Protocol nr. 5 . Let op de grote verschillen tussen de structuren wanneer geplaatst in een gemeenschappelijke referentie frame op de 5'-terminale base paar.

Figuur 5
Figuur 5. Schermafdruk van de w3DNA webserver ter illustratie van de specificaties van de DNA-sequentie (Label 1), de spiraalvormige vorm van ongebonden DNA (Label 2), de posities en identiteiten van eiwitten (Label 3), en de preview-beeld selectievakje (Label 4) beschreven in protocol 6. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 6
Figuur 6. Geschatte atoommodellen van twee HBB eiwitten 8 gebonden aan een lange DNA-fragment. Structuren gemaakt met de w3DNA webserver zoals beschreven in Protocol 6 en teruggegeven in PyMOL. De eiwitketens zijn show als violet linten, terwijl het DNA is gekleurd-gecodeerd voor atoom-type (C-cyaan, N-blauw; O-rood; P-goud). De centrale basenparen van elk eiwit-bindende plaatsen is ingesteld op posities (links) 20 en 62 langs de 81 baseparen DNA-keten en (rechts) 20 en 67 langs de 86 baseparen DNA-keten. Let op de grote verandering in de vouwen van de structuren in verband met de verhoogde (vijf baseparen) verplaatsing van de twee eiwitten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De set van protocollen die in dit artikel alleen ingaan op de mogelijkheden van de 3DNA suite van programma's. Het gereedschap kan worden toegepast op RNA structuren die niet-canonieke basenparen identificeren, de secundaire structurele contexten waarin deze koppeling optreedt bepalen de ruimtelijke dispositie schroeflijnvormige fragmenten kwantificeren, de overlap van basen meten langs de keten ruggengraat, etc. De ombouw commando kan de gebruiker eenvoudig en informatieve blok weergegeven van de bases en basenparen te construeren zoals die getoond op de inzet van figuur 1. De bouwhulpmiddelen ook functies om 'thread' verschillende sequenties op een bepaalde structurele sjabloon, om modellen van talrijke dubbele, drievoudige en vier DNA-structuren te genereren, te oriënteren modellen in een bepaalde richting, etc. Tenslotte heeft 3DNA speelde een belangrijke rol in een aantal andere projecten, zoals: de SwS solvatering webdienst voor nucleïnezuren 27, de ARTS webserver vooruitlijnen RNA tertiaire structuren 28, de MDDNA web-based tool voor het analyseren van moleculaire dynamica resultaten en structuurvoorspelling 29; de SCHELVISSEN informatiegestuurde eiwit-DNA-docking methode 30; de SARA-server voor de functie annotatie van RNA structuren 31, de 3D- DART DNA structuur modeling server 32 het 3D-footprint databank voor de structurele analyse van proteïne-DNA complexen 33, de RNA FRABASE 2.0-database voor de identificatie van driedimensionale fragmenten in RNA structuren 34, en de SETTER webserver voor paarsgewijze vergelijking RNA structuren 35. Om het beste van onze kennis, is er momenteel geen ander nucleïnezuur structuur softwarepakket met een vergelijkbare brede combinatie van functies en de robuuste prestaties verslag van 3DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

Wij zijn dankbaar dat Jiří Sponsor voor het delen van de coördinaten van de dubbele DNA-helices gegenereerd in moleculaire dynamica simulaties. Wij erkennen ook Nada Spackova voor hulp bij het downloaden van deze structuren. Ondersteuning van dit werk door USPHS Onderzoek Subsidies GM34809 en GM096889 is dankbaar erkend.

References

  1. Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNA: a software package for the analysis, rebuilding, and visualization of three-dimensional nucleic acid structures. Nucleic Acids Res. 31, 5108-5121 (2003).
  2. Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNA: a versatile, integrated software system for the analysis, rebuilding, and visualization of three-dimensional nucleic-acid structures. Nature Protocols. 3, 1213-1227 (2008).
  3. Zheng, G., Lu, X. -J., Olson, W. K. Web 3DNA-a web server for the analysis, reconstruction, and visualization of three-dimensional nucleic-acid structures. Nucleic Acids. Res. 37, W240-W246 (2009).
  4. Xin, Y., Olson, W. K. BPS: a database of RNA base-pair structures. Nucleic Acids Res. 37, D83-D88 (2009).
  5. Zheng, G., Colasanti, A. V., Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNALandscapes: a database for exploring the conformational features of DNA. Nucleic Acids Res. 38, 267-274 (2010).
  6. Tolstorukov, M. Y., Colasanti, A. V., McCandlish, D., Olson, W. K., Zhurkin, V. B. A novel 'roll-and-slide' mechanism of DNA folding in chromatin. Implications for nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 371, 725-738 (2007).
  7. Lu, X. -J., Olson, W. K., Bussemaker, H. J. The RNA backbone plays a crucial role in mediating the intrinsic stability of the GpU dinucleotide platform and the GpUpA/GpA miniduplex. Nucleic Acids Res. 38, 4868-4876 (2010).
  8. Mouw, K. W., Rice, P. A. Shaping the Borrelia burgdorferi genome: crystal structure and binding properties of the DNA-bending protein Hbb. Mol. Microbiol. 63, 1319-1339 (2007).
  9. Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J. P. Lyme disease-a tick-borne spirochetosis? Science. 216, 1317-1319 (1982).
  10. Benach, J. L., Bosler, E. M., Hanrahan, J. P., Coleman, J. L., Habicht, G. S., Bast, T. F., Cameron, D. J., Ziegler, J. L., Barbour, A. G. Spirochetes isolated from the blood of two patients with Lyme disease. N. Engl. J. Med. 308, 740-742 (1983).
  11. Lankaš, F., Špačková, N., Moakher, M., Enkhbayar, P., Šponer, J. A measure of bending in nucleic acids structures applied to A-tract DNA. Nucleic Acids Res. 38, 3414-3422 (2010).
  12. Romanuka, J., Folkers, G. E., Biris, N., Tishchenko, E., Wienk, H., Bonvin, A. M. J. J., Kaptein, R., Boelens, R. Specificity and affinity of Lac repressor for the auxiliary operators O2 and O3 are explained by the structures of their protein-DNA complexes. J. Mol. Biol. 390, 478-489 (2009).
  13. Berman, H. M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Weissig, H., Shindyalov, I. N., Bourne, P. E. The Protein Data Bank. Nucleic Acids. Res. 28, 235-242 (2000).
  14. Joint, I. U. P. A. C. -I. U. B. Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) Abbreviations and symbols for the description of conformations of polynucleotide chains. Eur. J. Biochem. 131, 9-15 (1983).
  15. Altona, C., Sundaralingam, M. Conformational analysis of the sugar ring in nucleosides and nucleotides. A new description using the concept of pseudorotation. J. Am. Chem. Soc. 94, 8205-8212 (1972).
  16. Dickerson, R. E., Bansal, M., Calladine, C. R., Diekmann, S., Hunter, W. N., Kennard, O., von Kitzing, E., Lavery, R., Nelson, H. C. M., Olson, W. K., et al. Definitions and nomenclature of nucleic acid structure parameters. J. Mol. Biol. 205, 787-791 (1989).
  17. Olson, W. K., Bansal, M., Burley, S. K., Dickerson, R. E., Gerstein, M., Harvey, S. C., Heinemann, U., Lu, X. -J., Neidle, S., Shakked, Z., et al. A standard reference frame for the description of nucleic acid base-pair geometry. J. Mol. Biol. 313, 229-237 (2001).
  18. Lavery, R., Moakher, M., Maddocks, J. H., Petkeviciute, D., Zakrzewska, K. Conformational analysis of nucleic acids revisited: Curves+. Nucleic Acids Res. 37, 5917-5929 (2009).
  19. Franklin, R. E., Gosling, R. G. Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature. 171, 740-741 (1953).
  20. Watson, J. D., Crick, F. H. C. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
  21. Marvin, D. A., Spencer, M., Wilkins, M. H. F., Hamilton, L. D. A new configuration of deoxyribonucleic acid. Nature. 182, 387-388 (1958).
  22. Berman, H. M., Olson, W. K., Beveridge, D. L., Westbrook, J., Gelbin, A., Demeny, T., Hsieh, S. -H., Srinivasan, A. R., Schneider, B. The Nucleic Acid Database: a comprehensive relational database of three-dimensional structures of nucleic acids. Biophys. J. 63, 751-759 (1992).
  23. Stella, S., Cascio, D., Johnson, R. C. The shape of the DNA minor groove directs binding by the DNA-bending protein Fis. Genes Dev. 24, 814-826 (2010).
  24. Swigon, D., Coleman, B. D., Olson, W. K. Modeling the Lac repressor-operator assembly: the influence of DNA looping on Lac repressor conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 9879-9884 (2006).
  25. Czapla, L., Swigon, D., Olson, W. K. Effects of the nucleoid protein HU on the structure, flexibility, and ring-closure properties of DNA deduced from Monte-Carlo simulations. J. Mol. Biol. 382, 353-370 (2008).
  26. Czapla, L., Peters, J. P., Rueter, E. M., Olson, W. K., Maher, L. J. 3rd Understanding apparent DNA flexibility enhancement by HU and HMGB proteins: experiment and simulation. J. Mol. Biol. 409, 278-289 (2011).
  27. Auffinger, P., Hashem, Y. SwS: a solvation web service for nucleic acids. Bioinformatics. 23, 1035-1037 (2007).
  28. Dror, O., Nussinov, R., Wolfson, H. J. The ARTS web server for aligning RNA tertiary structures. Nucleic Acids Res. 34, 412-415 (2006).
  29. Dixit, S. B., Beveridge, D. L. Structural bioinformatics of DNA: a web-based tool for the analysis of molecular dynamics results and structure prediction. Bioinformatics. 22, 1007-1009 (2006).
  30. de Vries, S. J., van Dijk, M., Bonvin, A. M. The HADDOCK web server for data-driven biomolecular docking. Nat. Protoc. 5, 883-897 (2010).
  31. Capriotti, E., Marti-Renom, M. A. SARA: a server for function annotation of RNA structures. Nucleic Acids Res. 37, 260-265 (2009).
  32. van Dijk, M., Bonvin, A. M. 3D-DART: a DNA structure modelling server. Nucleic Acids Res. 37, W235-W239 (2009).
  33. Contreras-Moreira, B. 3D-footprint: a database for the structural analysis of protein-DNA complexes. Nucleic Acids Res. 38, D91-D97 (2010).
  34. Popenda, M., Szachniuk, M., Blazewicz, M., Wasik, S., Burke, E. K., Blazewicz, J., Adamiak, R. W. RNA FRABASE 2.0: an advanced web-accessible database with the capacity to search the three-dimensional fragments within RNA structures. BMC Bioinformatics. 11, 231 (2010).
  35. Čech, P., Svozil, D., Hoksza, D. SETTER: web server for RNA structure comparison. Nucleic Acids Res. (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics