Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

Published 10/05/2012
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Biology

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Summary

Beschrieben wird ein zweistufiges Verfahren unter Verwendung Kennzeichnung β-Glucosyltransferase (β-GT), um ein Azid-Glukose zu 5-HMC übertragen, gefolgt von Klickchemie einen Linker Biotin für die einfache und dichteunabhängigen Anreicherung zu übertragen. Dieses effiziente und spezifische Kennzeichnung Methode ermöglicht die Anreicherung von 5-HMC mit extrem niedrigen Hintergrund und hohem Durchsatz epigenomischen Mapping über Next-Generation-Sequenzierung.

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Li, Y., Song, C. X., He, C., Jin, P. Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA. J. Vis. Exp. (68), e4441, doi:10.3791/4441 (2012).

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Abstract

5-Methylcytosin (5-mC) bildet ~ 2-8% der gesamten Cytosine in humanen genomischen DNA und beeinflusst ein breites Spektrum an biologischen Funktionen, einschließlich Genexpression, die Aufrechterhaltung der Genom Integrität, elterliche Prägung, X-Chromosom-Inaktivierung, die Regulierung des Entwicklung, Alterung und Krebs 1. Kürzlich wurde die Anwesenheit eines oxidierten 5-mC, 5-Hydroxymethylcytosin (5-HMC), in Säugerzellen entdeckt, insbesondere in embryonalen Stamm (ES)-Zellen und neuronalen Zellen 2-4. 5-HMC wird durch Oxidation von 5-mC katalysiert durch TET Familie Eisen (II) / α-Ketoglutarat-abhängige Dioxygenase 2, 3 erzeugt. 5-HMC wird vorgeschlagen, bei der Aufrechterhaltung der embryonalen Stamm (mES) Zelle, normale Hämatopoiese und Tumore und Zygote Entwicklung 2, 5-10 beteiligt sein. Zum besseren Verständnis der Funktion von 5-HMC, ist eine zuverlässige und einfache Sequenzierung von wesentlicher Bedeutung. Traditionelle Bisulfit-Sequenzierung kann nicht unterscheiden, 5-HMC von 5-mC 11 12.

Hier beschreiben wir eine einfache Zwei-Schritt-Verfahren zur selektiven chemischen Kennzeichnung der 5-HMC. Im ersten Markierungsschritt wird 5-HMC in genomischer DNA mit einem 6-Azid-Glucose katalysiert durch β-GT, eine Glucosyltransferase aus Bakteriophagen T4 bezeichnet, in einer Weise, die das 6-Azid-Glucose überträgt 5-HMC vom modifiziertes Cofaktor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). Im zweiten Schritt, Biotinylierung wird ein Disulfid Biotin Linker an die Azidgruppe durch Klickchemie befestigt. Beide Schritte sind hoch spezifisch und effizient, was zu vervollständigen Kennzeichnung unabhängig von der Fülle der 5-HMC in der genomischen Regionen und geben extrem geringe Hintergrund. Nach Biotinylierung von 5-HMC, die 5-HMC-enthaltende DNA-Fragmente werden dann selektiv eingefangenmit Streptavidin-Kügelchen in einer Dichte-unabhängige Weise. Die daraus resultierenden 5-HMC-angereicherte DNA-Fragmente konnten für nachgelagerte Analysen, einschließlich der nächsten Generation Sequenzierung verwendet werden.

Unsere selektive Markierung und Capture-Protokoll überträgt hohe Empfindlichkeit auf jede Quelle der genomischen DNA mit variablem / diverse 5-HMC Häufigkeiten. Obwohl der Hauptzweck dieses Protokolls ist seine nachgeordneten Anwendung (dh. Der nächsten Generation Sequenzierung Karte aus dem 5-HMC Verteilung im Genom), ist es kompatibel mit Einzel-Molekül-, real-time SMRT (DNA)-Sequenzierung, das ist der Lage ist, single-base Auflösung Sequenzierung von 5-HMC.

Protocol

Ein. Genomic DNA-Fragmentierung

Fragment genomischer DNA unter Verwendung von Ultraschallbehandlung auf einen gewünschten Größenbereich für das Genom-weite Sequenzierplattform geeignet. (Wir gehen normalerweise in ~ 300 bp beschallen.) Überprüfen Sie die Größenverteilung der fragmentierten genomischen DNA auf einem 1% Agarosegel (Abbildung 1).

2. DNA-Präparation

Bestimmen Sie die Ausgangs-DNA Mengen auf die Fülle der 5-HMC in genomischer DNA. Da 5-HMC Ebenen sind in den einzelnen Gewebearten hängen Ausgangs-DNA Mengen auf den 5-HMC Pegeln der Abtastwerte. Siehe Tabelle 1 für Beispiele.

3. β-GT katalysierte Reaktion (Glucose-Transfer-Reaktions)

  1. Mischung durch Pipettieren der Mischung, wie in Tabelle 2 und inkubieren in einem 37 ° C Wasserbad für 1 Stunde.
  2. Nach der Inkubation bereinigen die Reaktion mit QIAquick Nucleotide Removal Kit mit 10 ug DNA proSpalte. Eluieren mit 30 ul Wasser pro Spalte und kombinieren.

4. Biotinylierungsreaktion (Klick-Chemie)

  1. Hinzufügen DBCO-SS-PEG3-Biotin-Konjugat-Arbeitslösung (1 mM) in der eluierten DNA-Lösung (aus Stufe 3) bis zu einer Endkonzentration von 150 pM (dh 5 ul Arbeitslösung pro 30 ul DNA-Lösung).
  2. Mix durch Pipettieren und inkubieren in einem 37 ° C warmen Wasserbad für 2 Stunden.
  3. Reinigen Sie die Reaktion mit QIAquick Nucleotide Removal Kit. Die ideale insgesamt Elutionsvolumen beträgt 100 ul.
  4. Quantifizierung der gewonnenen DNA Menge mit Mikrolitermaßstab Spektralphotometer (zB., NanoDrop).

5. Erfassen von 5-HMC-haltige DNA

  1. Waschen 50 ul Dynabeads MyOne Streptavidin C1 3-mal mit 1 ml 1X B & W-Puffer nach den Anweisungen des Herstellers. Trennen Sie die Perlen mit einem Magnetfuß.
  2. Hinzufügen identischen Volumen von 2X B & W-Puffer zu dem wiedergewonnenen biotinylierten DNA (100 ul) zu den gewaschenen Perlen.
  3. Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur unter leichtem Drehung auf einem Rotator.
  4. Trennen Sie die Perlen mit einem Magnetfuß und waschen die Kügelchen 3-mal mit 1 ml 1X B & W-Puffer.
  5. Eluieren der DNA durch Inkubation der Kügelchen in 100 ul frisch hergestellten 50 mM DTT für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Drehung auf einem Rotator.
  6. Trennen Sie die Perlen mit einem Magnetfuß. Absaugen Elutionsmittel und Last auf eine Bio-Micro Spin 6 Kolonne nach der Herstellung aus, damit die DTT entfernen. Die Ziel-DNA in der Lösung bekommen.
  7. Reinige das eluierte DNA aus dem vorherigen Schritt von Qiagen MinElute PCR Purification Kit und eluieren DNA in 10 ul Puffer EB. Quantifizierung DNA mit Qubit Fluorometer oder NanoDrop, wenn die Konzentration höher als 20 ng / ul. Die DNA ist bereit für nachgeschaltete genomweite Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung.

6. Repräsentative Ergebnisse

Wenn die Qualität of genomische DNA ist hoch, sind typische Ausbeuten der Gewinnung nach dem β-GT und Biotinylierung Reaktionen ~ 60-70%. Allerdings variieren die Gefangennahme Effizienz deutlich mit verschiedenen Gewebearten abhängig von den 5-HMC Ebenen der Proben. Typischerweise ist der Abscheidegrad für Gehirn genomische DNA ~ 4-9%, und in einigen extremen Fällen kann der Wirkungsgrad bis zu 12%. Für ES-Zellen, ist die durchschnittliche Einfangeffizienz ~ 2-4%, im Gegensatz zu ~ 0,5% für neurale Stammzellen. Die geringste Effizienz bisher gesehen war für genomische DNA von Krebszellen. Alle angereicherte DNA ist bereit für Standard der nächsten Generation Bibliothek Vorbereitung Protokolle. Darüber hinaus kann das eingefangene DNA auch als Matrize für die Echtzeit-PCR, um die Anreicherung von einigen Fragmenten im Vergleich zum Ausgangs-DNA, erkennen, ob die entsprechenden Primer vorhanden sind, verwendet werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Beschallte humanen genomischen DNA-Fragmente in1% Agarosegel. 10 ug genomischer DNA aus humanen iPS Zellen in 120 ul TE Puffer 1X isoliert wurde beschallt Verwendung einer Ultraschallbehandlung Vorrichtung (Covaris). Nach der Beschallung wurden 2 ul der beschallten DNA auf 1% Agarosegel geladen mit 100 bp DNA-Marker, um die Größen der DNA-Fragmente beschallte vergleichen.

Komponente Volumen Endkonzentration
Wasser _ Ul
10 X β-GT Reaction Buffer 2 ul X 1
Bis zu 10 ug genomische DNA _ Ul Bis zu 500 ng / ul
UDP-6-N 3-Glc (3 mM) 0,67 ul 100 uM
β-GT (40 uM) 1 ul 2 uM
Gesamtvolumen 20 ul

i) Für das Tissue genomische DNA (high 5-HMC-Gehalt> 0,1%)

Komponente Volumen Endkonzentration
Wasser _ Ul
10 X β-GT Reaction Buffer 10 ul X 1
Bis zu 20 ug genomische DNA _ Ul Bis zu 500 ng / ul
UDP-6-N3-Glc (3 mM) 1,33 ul 100 uM
β-GT (40 uM) 2 ul 2 uM
Gesamtvolumen 40 ul

ii) für die Stammzellenforschung genomische DNA (Median 5-HMC-Gehalt ~ 0,05%)

Komponente Volumen Endkonzentration
Wasser _ Ul
10 X β-GT Reaction Buffer 10 ul X 1
Bis zu 50 ug genomische DNA _ Ul Bis zu 500 ng / ul
UDP-6-N3-Glc (3 mM) 3,33 ul 100 uM
β-GT (40 uM) 5 ul 2 uM
Gesamtvolumen 100 ul

iii) Für Krebszelle genomische DNA (low 5-HMC-Gehalt ~ 0,01%)

Tabelle 1. Beispiele für Mengen von Input-DNA und Kennzeichnung Reaktionen unter Verwendung der Proben mit verschiedenen 5-HMC Ebenen durch die selektive chemische Markierung Methode.

Probe 5-HMC-Ebene Ausgangs-DNA (ug) Erholung nach Kennzeichnung (Eingang an Kügelchen) (ug) Rückgewinnungsausbeute Pull-Down-DNA (ng) Pull-Down-Ausbeute
Adulten Maus Kleinhirns 0,4% 10 7,5 75% 236 3,1%
Postnatalen Tag 7 Maus Kleinhirns 0,1% 11 9 82% 140 1,6%
Maus-ES-Zellen E14 0,05% 60 42 70% 350 0,8%

Tabelle 2. Repräsentative Ergebnisse aus Maus Hirngewebe und ES-Zellen.

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Discussion

5-Hydroxymethylcytosin (5-HMC) ist ein kürzlich identifizierten epigenetische Veränderung in erheblichen Mengen in bestimmten Säugetieren Zelltypen. Das hier vorgestellte Verfahren ist für die Bestimmung der genomweiten Verteilung der 5-HMC. Wir verwenden T4 Bakteriophagen β-glucosyltransferase zur Erzeugung eines manipulierten Glucose-Rest enthaltend eine Azidgruppe auf die Hydroxylgruppe von 5-HMC übertragen. Die Azidgruppe kann chemisch mit Biotin werden zur Feststellung, Affinitätsanreicherung und Sequenzierung von 5-HMC-enthaltende DNA-Fragmente in Säugergenomen modifiziert. Dieses Protokoll hat Vorteile gegenüber 5-HMC Antikörper-basierte hydroxymethylierten DNA Immunopräzipitation (hMeDIP-Seq) 13-15, obwohl die hMeDIP ist einfach, es eine starke Tendenz in Richtung High-Density-5-HMC Regionen hat und in der Regel gibt inkonsistente Ergebnisse von unabhängigen Pull -downs. Unsere Methode würde nicht vorstellen wie Bias.

Es gibt jedoch zwei mögliche Bedenken in Bezug auf unsere Kennzeichnung und mich gefangenThSB. Die erste Sorge konnte die Spezifität der Kennzeichnung und zu erfassen. Da ein aktueller Bericht angedeutet, dass 5-Hydroxymethyluracil (5-HMU) kann auch als ein Substrat der β-GT dienen könnte falsch-positive Signale eingeführt, was zu angereicherten Fragmente, die unspezifische bis 5-HMC-Bezogenheit 16 sind. Diese Sorge könnte unbegründet, obwohl, da hochaktiven 5-Hydroxymethyluracil-DNA Glycosylasen ständig Entfernen dieser DNA-Schäden, die sich im Wesentlichen nicht nachweisbar 5-HMU in Säugetiergenoms 17,18. Das zweite Problem ist die Effizienz der Markierung und die Gefangennahme. Da 5-HMC Spiegel signifikant variieren in verschiedenen Geweben und Zellen, die von 0,5% im Hirngewebe zu 0,05% in mES Zellen und 0,01% in Krebszellen ist es wesentlich, dass unser Verfahren anwendbar auf allen diesen Geweben sein im Hinblick auf die nachgeschalteten Anwendungen des markierten und gefangen genomischer DNA. Unsere Erfahrung zeigt, dass die hier beschriebenen Methoden tatsächlich empfindlich und spezifisch sindgenug, um alle diese Gewebe zum Zweck der Quantifizierung entweder basierenden Vergleich der 5-HMC Pegeln aus den Geweben oder für Downstream-Anwendungen, wie beispielsweise tief-Sequenzierung, um die Verteilung der 5-HMC im Genom 19-21 abzubilden analysieren.

Der Schlüssel zu unserem Verfahren ist die Verwendung einer geeigneten Menge an Ausgangsmaterial genomischer DNA. Wenn die genomische DNA-Konzentration zu niedrig ist, wird die Effizienz und Spezifität Kennzeichnung entsprechend abnehmen. Basierend auf unserer Erfahrung, auch wenn die Fülle der 5-HMC ist hoch genug DNA aus Hirngewebe, wenn die Konzentration unter 25 ng / ul in 20 ul Reaktion, die Kennzeichnung und Erfassung Effizienz, sowie die Spezifität, werden deutlich reduziert. Für den Tief-Abundanz DNA-Proben, die neben der Konzentration Anforderung ist die Gesamtmenge von DNA wesentlichen um hohe und spezifische Einfangeffizienz. Daher muss, obwohl man nur 25 ng von 5-HMC-angereicherte DNA-Fragmenten für die nachgeschaltete stAndard Bibliothek Generation Protokolle der nächsten Generation Sequenzierung Plattformen eingesetzt werden, sollte der Grundbetrag von genomischer DNA aus Hirngewebe nicht weniger als 2 ug (und der ideale Ausgangspunkt beträgt 5-10 ug). Durch Versuch und Irrtum, haben wir die Ausgangsmenge von genomischer DNA aus unterschiedlichen Geweben mit variabler 5-HMC Häufigkeiten optimiert, um hohe Kennzeichnung Effizienz und Spezifität zu erhalten, wie in Tabelle 2 aufgeführt.

Zusammenfassend ist unsere Methode qualifiziert genau beschriften genomische 5-HMC und speziell erfassen die 5-HMC-haltige Fragmente, so dass es ein erfolgreiches Protokoll in Bezug auf Sensitivität und Spezifität für nachgeschaltete nächsten Generation Sequenzierung Assays.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Diese Studie wurde zum Teil durch die National Institutes of Health (GM071440 nach CH und NS051630/MH076090/MH078972 PJ) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
5M Sodium chloride (NaCl) Promega V4221
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Promega V4231
1M Trizma base (Tris) pH7.5 Invitrogen 15567-027)
HEPES 1M, pH7.4 Invitrogen 15630
Magnesium chloride (MgCl2) 1M Ambion AM9530G
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418
Tween 20 Fisher BioReagents BP337-100
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate Click Chemistry Tools A112P3
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure Invitrogen 15508-013
QIAquick Nucleotide Removal Kit Qiagen 28304
Micro Bio-Spin 6 Column Bio-Rad 732-6222
Dynabeads MyOne Invitrogen 650-01
Streptavidin C1
Qiagen MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004
UltraPure Agarose Invitrogen 16500500
UDP-6-N3-glucose Active Motif 55013
Enzyme
β-glucosyltransferase (β-GT) New England Biolab M0357
Equipment
Sonication device Covaris
Desktop centrifuge
Water bath Fisher Scientific
Gel running apparatus Bio-Rad
NanoDrop1000 Thermo Scientific
Labquake Tube Shaker Barnstead
Labquake Tube Shaker Thermolyne
Magnetic Separation Stand Promega Z5342
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen
Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20).

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