트립신과 Passaging 색채 인간의 배아 줄기 세포 - 라인

Published 10/12/2006
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Biology

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Summary

이 비디오에서 우리는 우리의 실험실은 정기적으로 트립신과 색채 인간 배아 줄기 세포 라인을 통로 방법을 보여줍니다.

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Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

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Abstract

이 비디오에서 우리는 우리의 실험실은 정기적으로 트립신과 색채 인간 배아 줄기 세포 라인을 통로 방법을 보여줍니다. 인간 배아 줄기 세포는 세포 배양의 유물이며, 높은 인구 doublings와 karyotypic 이상을 취득하는 경향이 있습니다. 적절한 passaging은 건강, undifferentiated, karyotypically 정상적인 색채에게 인간의 배아 줄기 세포 배양을 유지하기위한 필수적입니다. 첫째, 확장 문화 잔류 미디어와 세포 부스러기를 제거하기 위해 PBS에 씻어, 그러면 세포는 따뜻한 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 최소 볼륨 겹쳐 있습니다. 트립신은 최대 5 분 동안 세포에 남아있다, 그때 전지 부드럽게 2mL serological 피펫과 dislodged 수 있습니다. 세포 현탁액은 색채 미디어의 큰 볼륨과 수집 및 혼합이며, 그 세포는 부드러운 원심 분리에 의해 저장됩니다. inactivated 트립신 미디어 혼합물을 제거하고, 세포 사전 예열 색채 미디어에 resuspended 있습니다. 적절한 분할 비율 (일반적으로 1시 10분에서 1시 20분까지) 계산하고, 조사 마우스 배아 fibroblast 피더 세포 monolayer를 포함 1~2일 된 판에 다시 도금 세포. 새로 씨앗 색채 문화 플레이트가 48 시간에 대해 그대로 남아 있습니다 다음, 미디어 이후 매일 변경됩니다. 이 karyotypic 이상을 도입의 위험을 증가로 그것은 하나의 세포 현탁액로 trpsinize하지 않는 것이 중요합니다.

Protocol

일반

우리는 쉽게 처리하기 위해 주어진 시간에 더 이상보다 샘플을 해동하는 것이 좋습니다. 핸들러는 오랜 기간 동안 실내 온도와 낮은 CO2의 문화를 떠나지 않도록주의를 기울여야한다. 라이브 세포의 모든 원심 분리는 상온에서 5 분 500-600 XG에서 이루어집니다.

MEFs (마우스 배아 피더 세포)

  1. 37 사전 따뜻한 MEF 미디어 ° C. -80에서 MEF의 약병을 제거 ° C 즉시 잠수함 37 ° C 물 욕조에서 튜브의 아랫부분. 세포는 80 % (왼쪽 작은 부분 냉동) 해동되기 전에는 30~45초 정도 걸릴 것입니다.
  2. 신속 튜브는 층류 후드에 가지고 70 %의 알코올로 아래로 스프레이하고, 사전 예열 미디어 세포를 전송할 수 있습니다.
  3. 이전 준비 접시에서 젤라틴 솔루션을 대기음.
  4. 여섯 우물의 각에 드롭 현명한 방식으로 MEF 솔루션의 나누어지는 2 ML. 잘 대해 균일하게 MEFs를 배포해야합니다. MEFs가 번호판에 첨부할 수 있도록 밤새 MEF 판, 그리고 37 ° C 배양기에서 개최 날짜입니다.
  5. 6 시간 만에 MEFs는 접시에 첨부됩니다. MEF 접시 도금 후 24~48시간를 사용하는 것이 좋습니다. 사일 넘어 섭니다 MEF 접시를 사용하지 마십시오.
  6. 사전 따뜻한 색채의 미디어와 0.05 % 37 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) ° C 후드 아래 prelabel 한 무균 50 ML 원뿔 관.
  7. 조심스럽게 문화의 색상 미디어 분할 수 대기음. 부드럽게 1X 인산 버퍼 용액 (PBS) 당 우물의 2mL와 우물 씻으십시오. PBS를 대기음. 잘하는 0.75 ML 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가합니다.
  8. 뚜껑을 교체하고, 4X 배율에서 세포를 관찰합니다. 색상의 식민지를 둘러싼 MEFs은 철회하기 시작한다. MEFs이 충분히 반올림과 색채의 식민지의 경계 힘든 때 보닛에 접시를 반환합니다. 이 과정은 전혀 이상 10 분 또는 세포 다시 성장하지 않습니다보다 약 5 분을 받아도됩니다.
  9. MEF의 monolayer 완전​​히 (monolayer은 끈적하고 한 조각에 남아있을 수 있습니다) 분리 때까지 부드럽게, 우물의 바닥 세척, 아래로 피펫합니다.
  10. 추가 색상 미디어를 포함하는 50 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 5 분 대한 500xg 세포의 튜브를 스핀, 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의, 미디어를 대기음.
  11. MEFs의 새 접시에 접시하려면 추가적인 색채 미디어로 세포의 적절한 결정 볼륨을 추가하고 자동 피펫으로 용액에게 5-7 번 피펫.
  12. MEFs의 새로운 접시에서 MEF 미디어를 제거합니다.
  13. 나누어지는 잘 대해 균등하게 방울을 배포해야하는 각 잘하는 것이 현명 색상 솔루션 드롭. 접시를 떨지 않고, 신중하게 색채 식민지의 종자 수 있도록 야간 37 ° C 배양기에 세포를 반환합니다.
  14. 분할 나오는 색채 세포는 해동 나오는 것과 유사하게 동작한다.

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Discussion

이 비디오에서 우리는 우리의 연구실에서 어떻게 정기적으로 통과 색채 인간 배아 줄기 세포 라인을 보여주었다. 효율적이고 정기적으로 분할하고 passaging는 건강한 인간 배아 줄기 세포 라인을 유지하기위한 필수적입니다. 트립신의 중재 통로는 색채 셀 라인의 중요한 장점이다 그러나, 그것은 이상의 문화를 trypsinize하거나 다시 플래팅 동안 단일 세포의 큰 비율을하지 않는 것이 중요합니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

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References

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Comments

4 Comments

  1. That's very nice clip and  I have some question. Normally, HuES cells are very hard to form colony from single cell state. By treating with trypsin, I think, HuES colony will be dissociated into single cell state or very small colony state. How could you solve this problem? Which HuES cell line your lab are using? Looking forward to your response! Tran Ngoc Tung  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 6, 2009 - 7:15 AM
  2. For Tran Njoc Tung, You are totally correct that HuES, in single cell state, form colonies with great difficulty. The trick to avoid making a single cell suspension is to minimize the time for which you trypsinze. As you put trypsin, observe the cells under the microscope and just when there are small aggregates of HuESC's remaninig add the media. This would not allow the formation f single cell suspension. It totally works for me. Hope it dŒs for you.   Sumit Rai

    Reply
    Posted by: Sumit R.
    April 7, 2009 - 4:06 AM
  3. Dear Sir/Madame Unfortunately I can"t see the movie. How can I overcome this problem? Thank you and regards Vitali Shilo vitali.shilo@gmail.com

    Reply
    Posted by: vitali s.
    January 22, 2009 - 8:05 AM
  4. Hello Vitali, Please try the steps on this page: http://www.jove.com/index/page.stp?name=FlashProblems and let me know if you have any trouble. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2009 - 9:33 AM

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