Super-opløsning Imaging af Bakteriel Division Machinery

Published 1/21/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Vi beskriver en super-opløsning billeddannelse metoden til undersøgelse af den strukturelle organisation af det bakterielle FtsZ-ring, en væsentlig apparat til celledeling. Denne metode er baseret på kvantitative analyser af fotoaktiverede lokalisering mikroskopi (PALM) billeder og kan anvendes på andre bakterielle cytoskeletproteiner.

Cite this Article

Copy Citation

Buss, J., Coltharp, C., Xiao, J. Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery. J. Vis. Exp. (71), e50048, doi:10.3791/50048 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bakteriel celledeling kræver den koordinerede samling af mere end ti essentielle proteiner ved midcell 1,2. Centralt for denne proces er dannelsen af en ringlignende suprastructure (Z-ring) af FtsZ proteinet ved opdelingsplaner 3,4. Z-ring består af multiple enkeltstrengede FtsZ protofilamenter, og forståelse af arrangementet af protofilamenter inde i Z-ringen, vil give indsigt i mekanismen for Z-ringsamlingen og dets funktion som force generator 5,6. Denne information er forblevet undvigende grund af de nuværende begrænsninger i konventionelle fluorescens mikroskopi og elektronmikroskopi. Konventionel fluorescens-mikroskopi er i stand til at tilvejebringe et billede med høj opløsning af Z-ring på grund af diffraktion grænsen af ​​lys (~ 200 nm). Electron cryotomographic billeddannelse har registreret spredt FtsZ protofilamenter i små C. crescentus celler 7, men er vanskelig at anvende til større celler, såsomE. coli eller B. subtilis. Her beskriver vi anvendelsen af en super-opløsning fluorescensmikroskopi metode, til fotoaktiveret Localization Microscopy (PALM), kvantitativt karakterisere den strukturelle organisering af E. coli Z-ring 8.

PALM billedbehandling tilbyder både høj rumlig opløsning (~ 35 nm) og særlig mærkning for at muliggøre entydig identifikation af target-proteiner. Vi mærkede FtsZ med den fotoaktiverbare fluorescerende protein mEos2, som skifter fra grøn fluorescens (excitation = 488 nm) til rød fluorescens (excitation = 561 nm) efter aktivering ved 405 nm 9. Under en PALM eksperiment, er enlige FtsZ-mEos2 molekyler stokastisk aktiveret og de tilsvarende centroid positioner af de enkelte molekyler bestemmes med <20 nm præcision. En super-opløsning billede af Z-ringen bliver så rekonstrueret ved at sammenføje det geometriske tyngdepunkt positioner for alle detekterede FtsZ-mEos2 molekyler.

<p class = "jove_content"> anvendelse af denne fremgangsmåde, har vi fundet, at Z-ringen har en fast bredde på ~ 100 nm og består af en løs bundt FtsZ protofilamenter der overlapper hinanden i tre dimensioner. Disse data giver et afsæt til yderligere undersøgelser af cellecyklus afhængige ændringer i Z-ringen 10 og kan anvendes på andre proteiner af interesse.

Protocol

1. Prøvefremstilling

  1. Inokulere LB-medier med en enkelt koloni af stammen JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Vokse natten over på et rysteapparat ved 37 ° C.
  2. Fortynd kulturen 1:1000 i M9 + minimale medier [M9-salte, 0,4% glucose, 2 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, MEM aminosyrer og vitaminer] og vokser til mid-log fase (OD600 = 0,2 til 0,3) i nærværelse af chloramphenicol (150 ug / ml) ved stuetemperatur (RT).
  3. Fremkald kultur med 20 uM IPTG i 2 timer (se note # 1).
  4. Pelletkultur i mikrocentrifuge (8.000 rpm, 1 min) og resuspenderes i et lige volumen M9 +; repeat. Efter den anden resuspension, fortsat vækst ved stuetemperatur i 2 timer.
  5. Fix inducerede kultur med 4% paraformaldehyd i PBS (pH = 7,4) ved stuetemperatur i 40 min. Pelletkultur og resuspender i et lige volumen af ​​PBS; repeat. Hvis imaging levende celler, springe fiksering, pellet kultur, og resuspender med samme volumeni M9 - [M9-salte, 0,4% glucose, 2 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, MEM Aminosyrer]; gentagelsesenheder.
  6. Fortynd guldperler 1:10 med resuspenderede kultur. Påfør prøven forberedt imaging kammer (se trin 2,4).

[1] Bemærk: Ovenstående induktion protokollen (trin 1,1-1,3) er blevet optimeret til ekspressionssystemet af stamme JB281. Detaljerede induktion betingelser kan variere for andre ekspressionssystemer eller proteiner af interesse.

2. Montering af Imaging Afdeling

  1. Foretag en 3% (vægt / volumen) agarose-opløsning i M9 -. Smelte agarose ved 70 ° C i en bench-top varmeblok i 40 min. Store smeltede agarose ved 50 ° C i op til 5 timer.
  2. Anbring en ren microaqueduct dias i den øverste halvdel af den billeddannende kammer med elektroderne vender nedad. Bringe den nederste pakningen på microaqueduct slide således at dække perfusion kanaler.
  3. Anvendelse ~ 50 ul af smeltet agarose til midten af ​​glassetdias. Umiddelbart top agarosegelen dråben med en ren, tør dækglas. Tillad gelen at størkne ved stuetemperatur i 30 minutter.
    1. At rense dækglas: arrangere dækglas i en keramisk holder og sonikeres i 20 minutter i roterende bade med acetone, ethanol og 1M KOH på glas. Gentag cyklus tre gange, for i alt 9 sonications, efterfulgt af en enkelt sonikering i dH 2 O. Opbevar de rengjorte dækglassene i frisk dH 2 O. Inden brug blæse tørre dækglas med filtreret luft.
  4. Fjern forsigtigt dækglasset, forlader gel pad på microaqueduct dias. Umiddelbart tilsættes 1 ml af cellekultur prøve (se trin 1.6) til toppen af ​​gelen pad. Vente på ~ 2 min, så opløsningen at blive absorberet af den gel pad. Top gel pad med en ny ren, tør dækglas. Samle hele imaging kammer ifølge producentens instruktioner.

3. Image Acquisition

  1. Tænd mikroskop, kamera og lasere. Åben MetaMorph software (Molecular Devices).
  2. Placer passende excitation / emission filtre i den billeddannende sti (Figur 1).
  3. Indstil laser beføjelser og køb indstillinger i overensstemmelse hermed.
    1. 488-nm laser = 15 mW (se note nr. 2)
    2. 561-nm laser = 75 mW
    3. 405-nm laser = 2 mW ± neutralfiltre (Se note # 3)
  4. Lås imaging kammeret i den fase via den komplementære fase adapter.
  5. Udpege et egnet imaging region (100x100 pixel), der er homogent belyst af alle tre lasere.
  6. Identificere en prøve område, der indeholder både celler og referencemærker markører (guldperler) i umiddelbar nærhed, men ikke overlappende.
  7. Fokus på overfladen af ​​celler tættest på dækglasset. Erhverve en brightfield billede med 50 ms integrationstid og flytte fokus 0,5 um i prøven (figur 3Ai).
  8. Erhverve ensemble grøn fluorescens billede med excitation fra 488-n m laser anvendelse af en 50 ms integrationstid (figur 3Aii).
  9. Erhverve streaming video i rød kanal med kontinuerlig belysning fra 405-nm og 561-nm lasere. For fikserede celler er en 50 ms ramme, der anvendes til i alt 20.000 rammer (~ 17 min i alt) med 405-nm lasereffekt ramped med ~ 10% af 1.000 rammer (se note # 4). Til levende celler, er en 10 ms ramme, der anvendes til i alt 3.000 rammer (~ 30 s i alt) ved en konstant 405-nm laser power.
  10. Flytte fokus tilbage til den nedre overflade af cellerne og opnå et lysfelt billede som i trin 3.7.

[2] Note: Den integrerede intensitet af grøn fluorescens af en celle er direkte proportional med det samlede antal FtsZ-mEos2 molekyler udtrykt i cellen. Den 488-nm excitation kraft og ensemble fluorescens erhvervelse indstillinger skal holdes konstant for alle celler, således at den relative FtsZ-mEos2 ekspressionsniveauer i forskellige celler kan sammenlignes.

NDHOLDET "> [3] Note:. Fikserede celler afbildes med Neutral Density (ND) filter (fig. 1, optisk komponent nr. ​​5) på plads for at opnå en langsom aktiveringsgraden hvorved hver enkelt molekyle kan identificeret de ND filter fjernes, når billeddannelse levende celler til at øge aktiveringsgraden, og samtidig opretholde en lav sandsynlighed for at to molekyler, der aktiveres samtidig i et diffraktions-begrænset område. Jo hurtigere sats til live-cell imaging er nødvendig for at nedbringe den samlede erhvervelse tid, hvorved "frysning" Z-ringen i tid og begrænse virkningen af ​​lysbeskadigelse til cellen.

[4] Note: Antallet af erhvervede billeder blev optimeret til vores system og afhænger af den særlige cellestruktur, mærkning densitet, aktiveringsgraden og om udtømme hele puljen af ​​fluoroforer er vigtig for analyse. I levende celler, er det vigtigt at opnå et tilstrækkeligt antal lokaliseringer i så kort en periode på timig som muligt for at undgå sløring af billedet på grund af bevægelse af den cellulære struktur.

4. PALM Billede Byggeri

  1. Bestem centroid position for hver detekteret plet.
    1. Indlæs billedstak i Matlab (MathWorks, Inc).
    2. Beskære billedet stakken til et område omkring en celle, der udelukker alle referencemærker perler.
    3. Vælg en intensitet tærskel for spot detektering, der er over baggrundsniveauet, men under gennemsnittet stedet intensitet. Vi står for variationen i baggrundsniveau gennem et eksperiment ved at beregne det løbende gennemsnit af maksimal intensitet ved hjælp af en 150 framevindue. Intensiteten tærskelværdi for hver ramme derpå interpoleret fra de løbende middelværdier.
    4. Fratræk den tærskel, fra hver ramme. Kommende spots er identificeret som tre tilstødende pixels med intensiteter over tærsklen.
    5. Passer fluorescensintensiteten af ​​hver potentiel stedet til en todimensional Gaussian-funktion [Ligning # 1] med en ikke-lineær mindste kvadraters algoritme (figur 2). Lokalisering præcision af hver plet beregnes det samlede antal af registrerede fotoner [Ligning # 2]. Enhver dårligt fit stedet med en lokalisering præcision på mere end 20 nm (fikserede celler) eller 45 nm (levende celler) kasseres (se note # 5). Ethvert sted med en intensitet større end to gange den gennemsnitlige intensitet, muligvis på grund af overlappende emittere, ligeledes kasseres.
    6. For faste celler, fjerne gentagne observationer af samme molekyle ved at se bort enhver plet, hvis centroid position er inden for 45 nm af enhver anden plet, der gik forud med 6 frames eller mindre. Til levende celler, er alle pletter bevares.
  2. Kalibrer prøve drift ved hjælp af referenceenergi markør bevægelse.
    1. Afgrøde en 10x10 pixel område omkring et referencepunkt markør.
    2. Fratræk den tærskel bestemmes i 4.1.3 fra hver ramme.
    3. Monter intensitet profil i hverrammen via mindste kvadraters tilpasning algoritme antager en todimensional Gaussisk form.
    4. Beregn forskydning mellem centroiden positioner i forhold til frame 1.
  3. Ret centroid position af hvert unikt molekyle identificeret i 4,1 med den passende prøve drift opgjort i 4,2. Sammenlign brightfield billeder optaget i 3,7 og 3,10. Hvis celler observeret at bevæge sig i forhold til referencemærkerne markører bliver data smidt ud.
  4. Superimpose alle korrigerede tyngdepunkt positioner på et enkelt billede, der består af 15x15 nm pixels. Plotte hvert unikt molekyle som en enhed-område, todimensional Gaussisk profil, centreret ved det geometriske tyngdepunkt position med en standardafvigelse lig med lokalisering præcision [Ligning # 2]. Dette resulterer i en sandsynlighedsfordeling kort, når en pixel intensitet er proportional med sandsynligheden for at finde et molekyle i denne pixel (fig. 3Aiv).
  5. Sammenligning PALM billeder til ensemble billeder.
    1. Replot centroid positioner som i 4,4, men på et plan med 150x150 nm pixels og en standardafvigelse svarende til 250 nm. Dette genererer en PALM billede, som efterligner en diffraktionsbegrænset billede, som kan anvendes til at sammenligne den diffraktionsbegrænset, ensemble billede optaget i 3,8 (fig. 3Aiii).
    2. For at bekræfte, at de fundne molekylerne er repræsentative for hele befolkningen, sammenligne det rekonstruerede ensemble billedet (Figur 3Aiii, trin 4.5.1) med den eksperimentelle ensemble fluorescens billede (Figur 3Aii, trin 3,8) for at bekræfte, at begge billeder viser strukturer af lignende form , orientering og relativ intensitet.

[5] Bemærk: Det krævede lokalisering præcision blev bestemt empirisk for hver imaging metode ved at plotte de naermere af alle molekyler for en given prøve og vælge et hensigtsmæssigt cutoff.

5. PALM Image Analysis

  1. Måling Z-Ring Width og diameter.
    1. Rotere PALM billedet, således at lodret orientere den lange akse af cellen (figur 4A).
    2. Afgrøde den cellulære område, der indeholder Z-ringen.
    3. Beregne den kumulerede intensitet ved at projicere en intensitet profil langs cellens længdeakse.
    4. Monter intensitet profil til en gaussisk fordeling. Ringen Bredden er defineret som den fulde bredde halvt maksimum (FWHM) af den monterede Gauss-fordeling (figur 4B).
    5. Projicere kumulative intensitet profil 5.1.2 langs cellens korte akse. Ringens diameter er defineret som den fulde længde af intensitetsprofilen (figur 4C).
  2. Plotning FtsZ Density (se note # 6).
    1. Replot centroid positioner som i (4.4), men uden den gaussiske profil, således at hver unikt molekyle gives en værdi på 1 og tildelt til en enkelt pixel, der svarer til dens tyngdepunkt position. På denne måde intensitet af hverpixel repræsenterer det samlede antal af molekyler påvist i denne pixel. The Density PALM Billedet kan også visualiseres som et kurveplot (figur 5E).
  3. Bestemmelse rumlig opløsning.
    1. Teoretisk-opnåelige rumlig opløsning: oprette en repræsentant PSF til hele prøven efter gennemsnittet bestemt lokalisering præcision af alle afslørede molekyler og beregne FWHM (ligning # 3).
    2. Eksperimentelt opnået rumlig opløsning: beregne den gennemsnitlige forskydning mellem gentagne observationer af samme molekyle.

[6] Bemærk: Vi anvendte total intern refleksion PALM (TIR-PALM, figur 1 og 5) til at begrænse aktivering og excitation med et tyndt lag (~ 200 nm) over den celle / glas-grænsefladen. således at kun FtsZ molekyler er forbundet med membranen tættest på dækglasset vil blive detekteret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vist i fig 3Aiv er et todimensionalt, super opløsning præstationen af Z-ringen dannet fra PALM imaging beskrevet ovenfor. Nedenfor har vi opsummere kvalitative og kvantitative oplysninger, der kan opnås fra dem.

Kvalitativt vi observeret, at Z-ringen er en uregelmæssig struktur, der anvender multiple konfigurationer (enkelt bånd eller spiralformede bue), der ikke kan skelnes i konventionelle fluorescensbilleder (sammenlign figur 3A-Dii og iv). Bemærkninger som disse kan anvendes til at bestemme procent af cellepopulationen, der viser en særlig strukturel konfiguration.

Vi kan også kvantitativt at måle dimensionerne af Z-ringen. Vores fremgangsmåde til bestemmelse af ringen bredde og diameter er beskrevet i trin 5.1 og illustreret i figur 4.. Fra figur 4B, var ringen bredde theermined at være 113 nm (FWHM). Denne værdi er bredere end forventet bredden af et enkelt FtsZ protofilament (5-10 nm er baseret på in vitro EM 11). I figur 4C, er ringens diameter målt 1050 nm. Denne diameter kan anvendes til kvantitativt at beskrive graden af ​​konstriktion under celledeling.

En anden kvantitativ fremgangsmåde er at beregne molekylet tæthed ved at tælle antallet af molekyler lokaliseret inden for et defineret område. Densiteten Målingen giver oplysninger om, hvordan tæt molekyler pakkes i strukturen. Molecule tæthed kan beskrives i både relativt og absolut. Relativ massefylde (f.eks fraktion af molekyler i Z-ring vs hele cellen) giver oplysninger om fordelingen af molekyler i forskellige cellulære områder. Absolute densitetsmåling kompliceres af den kendsgerning, at PALM billede (fig. 3Aiv) er faktisk en 2D projektionaf et 3D-objekt. For at omgå denne komplikation, anvender vi TIR-PALM, der begrænser detektering flyet til en enkelt side af Z-ringen. De resulterende data er vist i figur 5E. Da de plottede molekyler repræsenterer en del af den samlede FtsZ befolkning, bestemt densitet er en nedre grænse for den faktiske densitet. Den maksimale densitet observeret i TIR billeder af Z-ring antyder, at nogle sektioner indeholder overlappende protofilamenter 10.

Figur 1
Fig. 1. En forenklet skematisk afbildning af vores mikroskop setup. Alle tre lasere styres af en brugerdefineret imaging program udviklet i MetaMorph der muliggør præcis kontrol over passende excitationsbølgelængde. Den mørkegrå linje angiver excitation lysbanen, medens det lysegrå linje viser emissionen sti. For total indre reflektion (TIR) ​​mikroskopi, er den indstillelige platform oversat vinkelret på lysets bane for at ændre indfaldsvinklen.

Figur 2
Figur 2. En sammenfatning af PALM metoden. I første omgang alle FtsZ-mEos2 molekyler er i det grønne-fluorescens tilstand. Ved udsættelse for kontinuerlig belysning af de 405 og 561 lasere, der enkelte molekyler stokastisk omdannet til rød fluorescens tilstand. Hastigheden for denne proces bestemmes af styrken i 405 laser, medens fotoblegning hastighed bestemmes af strømmen af ​​både 405 og 561 laser. Ideelt anvendes hastigheden af ​​aktivering og fotoblegning Baseret på en sådan måde, at kun et molekyle detekteres per frame. Når et tilstrækkeligt antal rammer er opnået, bliver billederne behandles i Matlab ved at montere hver identificeret plet som beskrevet i trin 4.1. Hver unique molekyle afbildes derefter (trin 4.4) i et enkelt plan, hvorved der genereres en PALM billede, her vist i pseudo-rød farve. Rammen er skitseret i rød blev bestemt til at indeholde en gentagelse sted fra det samme molekyle som den foregående ramme og blev derfor ikke medtaget under opførelsen af ​​PALM billedet.

Figur 3
Figur 3. Repræsentative billeder af faste (A og B) og levende (C og D) celler, der udtrykker FtsZ-mEos2. For alle celler, kan omridset og generelle form synliggøres i brightfield billede (i). Ensemble fluorescensbilleder (ii) erhverves med excitation fra 488 laser (trin 3.8) og repræsenterer fordelingen af den samlede pulje af FtsZ-mEos2. Ensemblet billede rekonstrueret fra PALM data (iii, trin 5,4) giver en kvalitativ check for metodens trofasterepræsentation af den sande ensemble struktur. Den genererede PALM billede (iv) er summation af alle unikke FtsZ-mEos2 lokaliseringer og repræsenterer en sandsynlighedsfordeling kort for FtsZ-mEos2. Cellen omrids er repræsenteret ved den gule stiplede linje i billeder III og IV. Celler A og C viser FtsZ i et enkelt bånd konformation, mens cellerne B og D illustrerer FtsZ om et spiralformet bue konformation, der er upåviselig i diffraktionsbegrænset ensemble billede (iii). Scale bars, 500 nm.

Figur 4
Figur 4. A. En PALM billede, der viser skematiske repræsentationer af Z-ring bredde (rød) og Z-ringdiameter (grøn). B. Ring bredde er beregnet ved at tilpasse den forventede intensitetsprofil (blå X'er) langs den lange akse af cellen med en Gaussisk funktion (gray linje) og derefter bestemmelse af FWHM (rød stiplet linje). Her blev ring bredde bestemt til at være 113 nm. C. Ring diameter bestemmes ved først at projicere intensiteten profil langs den korte akse af cellen og derefter beregne den fulde længde (grøn stiplet linje) af intensitetsprofilen over nul. Diameteren af ​​Z-ring blev bestemt til at være 1050 nm.

Figur 5
Figur 5. TIR-PALM muliggør nøjagtig optælling af molekyler. Som i figur 3, er den brightfield billede (A), ensemble fluorescensbillede (B), rekonstruerede ensemble fluorescensbillede (C) og PALM billede (D) illustreres for en given celle, der udtrykker FtsZ-mEos2. De samme data, der anvendes til at konstruere D plottes igen som en kontur plot af molekyle hulefoldighed (molekyler per pixel) i E. Fra denne densitet analyse blev FtsZ-mEos2 bestemt til at være maksimalt stede på 8-molekyler per pixel. Fordi et enkelt lag af FtsZ protofilamenter medfører en maksimal tæthed af 5 molekyler per pixel 10, Denne analyse antyder, at Z-ringen er sammensat af flere lag af FtsZ protofilamenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PALM billeder indeholder information om molekyle tæller og positioner inden for en celle, hvilket tillader detaljeret analyse af fordelingen og placeringen af ​​mål-proteinmolekyler, som er vanskeligt at opnå på anden måde. Nedenfor skitserer vi forholdsregler, der skal træffes for at udtrække præcis kvantitativ information og samtidig opretholde den biologiske relevans af PALM billeder. Vi har også udforske oplysninger, der kan bedst opnås ved anvendelse af levende vs faste celler. Endelig foreslår vi muligheder for at opnå ekstra super-opløsning oplysninger om celledeling maskiner.

Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde blev optimeret til at frembringe nøjagtige PALM billeder på følgende måder. For det første har vi beskrevet og optimeret funktionaliteten af fusionsproteinet at sikre, at det fungerer som en pålidelig markør for Z-ringstruktur 10. For det andet, vi finjusteret ekspressionen af ​​fusionsproteinet, da både over-og under-ekspression resultereri afvigende strukturdannelse 10,12,13. For det tredje, vi valgte tærskler for unikt molekyle bestemmelse (trin 4.1.5) baseret på fluorofor photoblinking egenskaber 14. Photoblinking komplicerer bestemmelse af unikke molekyler og hvis bort, fører til overcounting af enkelte molekyler. Selvom overcounting ikke påvirker dimension målingerne, betyder det forstærke absolutte densitetsmålinger og kan skabe udseendet af falske klynger. Alle disse faktorer bør overvejes nøje ved anvendelsen af ​​denne metode til andre proteiner af interesse.

Udvælgelsen af ​​levende eller fikserede celler til billeddannelse afhænger af den ønskede information og gennemløb. Live-cell imaging er hurtige (30 s), men kun rapporter om localizable (dvs. langsomme) molekyler. Det betyder normalt, at kun membran-associerede molekyler observeret i levende celler, mens fikserede celler give oplysninger om alle mærkede molekyler. Live-cell imaging provides høj opløsning strukturelle dimensioner og morfologi, men kan ikke give nøjagtige molekyle densitetsmålinger på grund af flytning af enkelte molekyler. Faste celle billeder kan give alle disse oplysninger, men kræver lav UV aktivering niveau, så unikke molekyler kan identificeres. Dette fører til udvidet billedoptagning (> 15 min). Desuden kan fikseringen forårsage strukturelle ændringer. Alle disse faktorer skal være afbalanceret, når de vælger hvilken prøve, der skal bruges.

Den PALM metode, vi har beskrevet giver super-opløsning detaljer i Z-ringstruktur, som kan sammenlignes på tværs af forskellige stammer, cellecyklus-stater, og vækstbetingelser. Gennemførelse af de seneste teknologiske fremskridt kan tilføre indsigt i cytokinetic mekanisme af Z-ring. For eksempel er indførelse af astigmatisme til påvisning pathway den nemmeste måde at føje tredimensionale kapacitet (~ 100 nm z-opløsning) til den optiske opstilling illustbedømt i figur 1 15. Også, samtidig afbildning af to eller flere proteiner på samme tid er blevet en realistisk mulighed med den hurtige fremkomsten af ​​spektralt-distinkte fotoaktiverbare fluorescerende proteiner. Endelig vil udviklingen af ​​et fluorescerende protein, der photoactivates i et UV-uafhængig måde tillader langsigtet overvågning af en enkelt celle uden at generere DNA beskadiget af 405 nm lys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgements

Grant: 5RO1GM086447-02.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 x MEM Amino Acids Sigma M5550
100 x MEM Vitamins Sigma M6895
IPTG Mediatech 46-102-RF
16% Paraformaldehyde Electron Micrsocopy Sciences 15710-S
SeaPlaque GTG Agarose Lonzo 50111
50 nm Gold Beads Microspheres-Nanospheres 790113-010
FCS2 Imaging Chamber Bioptechs
Stage Adaptor ASI I-3017
Inverted Microscope Olympus IX71
1.45 NA, 60x Objective Olympus
IXON EMCCD Camera Andor Technology DU897E
488-nm Sapphire Laser Coherent
561-nm Sapphire Laser Coherent
405-nm CUBE Laser Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buddelmeijer, N., Beckwith, J. Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center. Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).
  2. de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase. Nature. 359, 254-256 (1992).
  3. Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ). J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).
  4. Bi, E. F., Lutkenhaus, J. FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli. Nature. 354, 161-164 (1991).
  5. Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).
  6. Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes. Science. 320, 792-794 (2008).
  7. Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. Embo J. 26, 4694-4708 (2007).
  8. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  9. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
  10. Fu, G., et al. In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM). Plos One. (2010).
  11. Huecas, S., et al. Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments. Biophys. J. (2007).
  12. Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).
  13. Dai, K., Lutkenhaus, J. The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).
  14. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).
  15. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats