Kvantifiering glomerulär permeabilitet av fluorescerande makromolekyler Använda 2-foton mikroskopi i München Wistarråttor

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

En teknik som använder hög upplösning intavital 2-foton mikroskopi att direkt visualisera och kvantifiera gloemrular filtrering i ytan glomeruli. Denna metod möjliggör en direkt bestämning av permeabilitetsegenskaper makromolekyler i både normala och sjuka tillstånd.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. J. Vis. Exp. (74), e50052, doi:10.3791/50052 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Njursjukdomar där urinen stora viktiga makromolekyler, såsom serumalbumin, har länge ansetts vara orsakade av förändringar i permeabilitetsbarriären består av podocytes, vaskulära endotelceller, och ett basalmembran arbetar unisont. Data från vårt laboratorium använder intravital 2-foton mikroskopi visade en mer permeabel barriär glomerulär filtration (GFB) än vad man tidigare trott under fysiologiska förhållanden, med hämtning av filtrerat albumin förekommer i ett tidigt delmängd av celler som kallas proximala tubuli-celler (PTC) 1,2, tre.

Tidigare tekniker som används för att studera njurfiltrationen och upprättande av karakteristiska för filtrering barriär som micropuncture av lumen av dessa tidiga rörformiga segment med provtagning av flytande innehåll och analys 4. Dessa studier bestäms albuminkoncentration i luminala vätskan att vara praktiskt taget obefintlig, motsvarande näramot vad som vanligtvis detekteras i urinen. Däremot avslöjade karakterisering av dextran polymerer med definierade storlekar från denna teknik de av en storlek som liknar serumalbumin hade högre nivåer i den rörformade lumen och urin, vilket tyder på ökad permeabilitet 5.

Häri finns en detaljerad beskrivning av den teknik som används för att direkt visualisera och kvantifiera glomerulär fluorescerande albumin permeabilitet in vivo. Denna metod möjliggör detektion av filtrerat albumin över filtreringen barriären i Bowmans utrymme (den inledande avdelningen av urin filtrering), och tillåter också kvantifiering av albumin reabsorption av proximala tubuli och visualisering av efterföljande albumin transcytos 6. Frånvaron av fluorescerande albumin längs senare rörformiga segment väg till blåsan belyser effektiviteten hos hämtning banan i de äldre proximala tubuli segment. Dessutom, när denna teknik tillämpades bestämma permeabilitetav dextraner med en liknande storlek som albumin nästan identiska permeabilitetsvärden rapporterades 2. Dessa observationer stöder direkt behovet av att utöka fokus för många proteinuri njursjukdomar till inkluderade förändringar i proximala tubuli cell regenerering.

Protocol

Ett. Konjugering av råttserumalbumin till Sulfo-Rodamin 101 sulfonylklorid (Texas Red)

  1. Lös 100 mg av rått-serumalbumin (RSA) i 6,667 ml 100 mM Natriumbikarbonat pH 9,0, slutlig koncentration 15 mg / ml i en 50 ml koniska rör.
  2. Placera lösningen i is / vatten bägare och kyl till mellan 0 till 4 ° C.
  3. Lägg 200 pl av hög kvalitet vattenfri dimetylformamid (DMF) till en 10 mg flaska av Texas Red sulfonylklorid (TRSC), virvel på medium i 15 sek.
  4. Vortex RSA lösningen på medellång och tillsätt den upplösta TRSC.
  5. Wrap 50 ml koniskt i folie (Parafilm kan användas för att säkerställa en tät försegling bildas), plats horisontellt i ishink w / is bara och lägg på rocker att agitera lösningen långsamt (undvik bubblor), låta reaktionen fortsätta vid 0 till 4 ° C under 1 timme.
  6. Gör 5 L av 0,9% saltlösning, och fukta en 50 kDa molekylvikt avskurna kammare som kan vara antingen a) dialysmembran med clips, b) diALYS slang som i en float-a-lyzer, eller c) slide-a-lyzer kassett (alla lämpliga för att avlägsna okonjugerat TRSC).
  7. Placera reaktionsblandningen i dialys kammaren och plats i 5 L behållaren w / 0,9% saltlösning, dialysera över natten vid 4 ° C med en försiktig omröring med användning av en omrörare.
  8. Ändra 5 lösningen L dialys på morgonen och sent på eftermiddagen tills inkubation över natten resulterar i praktiskt taget ingen färgförändring (Detta tar vanligtvis ~ 48 timmar med minst 4 byten). Dessutom, med MWCO 50 kDa är så nära till MW av RSA, 66kDa, är det möjligt att aldrig ge en klar lösning, detta kommer att vara beroende av fördelningen i porstorlek av membranet, 60 timmar och 5 utbyten är mer än tillräckligt med tid.
  9. Mät volym och dela den initiala vikten av 100 mg genom volymen för att ge ungefärlig koncentration av TR-RSA; typiskt koncentrationer intervallet från 10 till 13 mg / ml. Den slutliga färgen: albumin förhållandet skall vara ~ 4:01, 1 fluoroforen per 15,000 Dalton protein MW. Förvara vid 4 ° C. Frys aldrig TR-RSA-lösning, som resulterande fragmentering som kan inträffa kommer att förändra permeabilitetsvärden.

2. Förbereda inverterat mikroskop scenen för avbildning / Mikroskop Inställningar

  1. Place ~ 4-7 bitar av autoklav tejp (ungefär ¾ "lång) staplade perfekt över varandra inuti en 50 mm skål med en 40 mm täckglas botten (täckglas nedre skålen). Dessa placeras närmare en av kanterna så att kanten av bandet kommer att ta kontakt med kanten av krökningen av njure men inte blockera målet strålgången (fig. 1A och 1B), större råttor kräver mer utrymme mellan tejpen och kanten av skålen.
  2. Placera 2 Repti-Therm kuddar bredvid scenen tillsammans med 50 mm skålen (Figur 1A). Placera en värmande filt vattenmantel över scenen.
  3. Maximera effektiviteten vid insamling bilder genom att säkerställa målet tornet har en 10x luft or 20x (luft eller vatten nedsänkning) objektiv och en kraftigare nedsänkning i vatten mål att samla in bilder för kvantifiering.
  4. Under avbildning det mest effektiva sättet att tillsätta vatten till de mål är att rotera dem åt sidan och tillsätt vatten med användning av en 1 cc spruta med en lång bit av PE-200 slang som kan nå toppen av målen.
  5. Ställ excitationsintensitet av 10watt lasern till ~ 15-20% med hjälp av neutrala densitet filter på programvaran. De gallium-arsenik fosfidpartiklama icke-descanned fotodetektorer satt till 750 för att samla gröna utsläpp, och 625 för att samla röda utsläpp. Blue utsläpp (t.ex. nukleära fläcken Hoechst 33342) samlas med hjälp av en standard nondescanned multialkaline detektor med en inställning mellan 750-800.
  6. För att säkerställa en korrekt uppbörd av de lågintensiva utsläppen inom Bowmans utrymme, se till att den undre gränsen för detektorerna är satta så att de inte utesluter dessa värden. Visuell varning markörer kommer att lysa om känslighetenär för låg och dessa värden ges ett intensitetsvärde av noll.
  7. Ladda en 1 cc spruta med ~ 5-8 mg av den fluorescerande albuminlösningen spädas med 0,9% steril koksaltlösning för att få upp den totala volymen till 1 cc.

3. Exponera Njure i München Wistar råtta för Intravital 2-Photon Imaging

  1. Börja med en pre-sövd råtta med Pentabarbitol (50 mg / ml lösning, 120 μl/100 g kroppsvikt), Inactin (130 mg / ml lösning, 120 μ/100 g kroppsvikt), eller isofluoran (5% induktion, 1,5 till 2,5% underhåll), en kvarliggande venkateter linje (antingen jugular eller lårbenshals ven), och den vänstra flanken rakat från strax under bröstkorgen till strax ovanför vänster lår.
  2. Placera råttan platt på sin högra sida så att den vänstra, rakade är vänd uppåt, kontrollera att den är platt på bordet, med sin hållning långsträckt och inte kröp, med framtassarna vidrör varandra och bakbenen vidrör varandra (Figur 2A). Mycket försiktigt palpera känna njuren för att avgöra var det naturligt lägger inom retroperitoneum och dra en rak linje parallell med kroppen (från bröstkorgen till låret) med en Sharpie (Figur 2A).
  3. Plocka upp huden med ett par tandade pincett, och nyp ihop huden längs den ritade linjen med ett par peanger att krossa vävnaden och förhindra blödning. Klipp längs snittet med ett par av kirurgiska saxar. Krossning det yttre skalet och skikten muskler före styckning kommer att dramatiskt minska och oftast eliminera blödning.
  4. Upprepa denna procedur för yttre muskeln lagret, vilket är tunt.
  5. För snittet in i det inre muskel skikt, som kommer att exponera bukhinnan, åter palpera njuren att uppskatta storlek. Nyp ett snitt linje mindre än njuren, försäkrar snittet är drygt njuren. Det är bäst att göra detta snitt för litet och göra den större om det behövs. Om detta görs för stor, kommer suturering krävas.Denna sista snitt är kritisk, långt över i någon riktning kommer att påverka stabiliteten på scenen och framkalla antingen rörelseartefakter från andning (bästa fall) eller töjer den renal BLOMSTJÄLK och negativt reducera renal perfusion (worst case scenario).
  6. Leta njurarna (såsom visas i figur 2B) och grepp omgivande fettet med pincett, som arbetar mot botten polen i njuren i en hand över hand mode.
  7. När den nedre polen i njuren är nådd, dra försiktigt njuren genom snittet medan mycket försiktigt klämma nedanför njuren exteriorize. Om snittet är för liten, krossa muskellagret och skär att vidga det, upprepa proceduren att exteriorize njure.

4. Placering av München Wistar Rat på scenen för Imaging

  1. Placera njuren mot kanten av täckglas skålen med njuren roterad något mot dorsal (baksidan) hos råttan så den ventrala sidan av njuren iar att ta kontakt med täckglas nedre skålen (Figur 1A). Lägg en uppvärmd, steril 09.% Saltlösning till skålen.
  2. Titta igenom 10x eller 20x objektiv och söka efter rörelse. Om rörelse detekteras, rulla råttan över något så bröstkorgen är längre bort från täckglas nedre skålen, se till njuren så nära kanten av skålen utan att sträcka renal BLOMSTJÄLK (Figur 1B).

5. Förvärva bilder att kvantifiera Renal permeabilitet av albumin

  1. Beräkning av glomerulär permeabilitet (Glomeruluar siktkoefficient, GSC) någon makromolekyl kommer att kräva att ta bilder referens bakgrund av individuella glomeruli före infusion av den fluorescerande molekylen. Om din Mikroskopet är utrustat med en motoriserad skede kan märkning platser, hitta och center enskilda glomeruli med den undre drivna mål och markera varje plats. En dubbel pass Fluorescein / Rodamin epifluorescence filter är idealisk för detta förfarande även antingen utsläpp filter fungerar (fas kontrast eller andra icke-fluorescens ljuskällor fungerar inte). Glomeruli visas som tomma cirkulära strukturer omgivna av proximala tubuli har en inneboende gulorange autoflourescence när de betraktas genom den dubbla pass filter.
  2. Om din mikroskop inte har en motoriserad skede, scanna njurarna i ett raster mönstrar med den låga energiförbrukningen målet och göra en rudimentär karta över där individen glomeruli är belägna, att förlita sig på naturliga landmärken såsom stora ytliga blodkärl ovanför njurkapseln eller feta fläckar.
  3. Växla revolvern till den högre effekten nedsänkning i vatten mål och ta 3D-data uppsättningar av varje glomeruli att se de kapillära loopar och Bowmans utrymme syns tydligt. Använda en pseudofärger palett (något annat än B / W) kommer att bidra till att visualisera dessa strukturer.
  4. Fokusera på en ytlig blodkärl ingjuta långsamt i than fluorescerande albumin att se tid ges för att möjliggöra för systemisk distribution. För molekyler med låg GSC är det viktigt att maximera intensitetsvärdena i plasmat men inte nå nivåer som kommer att mätta de fotodetektorer i mikroskopet. Detta ökar detekterbarheten filtrerade molekyler. Obs: det är normalt en 5-7 sek förflutit mellan den tidpunkt då fluorescerande albumin introduceras till den tid den visas på skärmen (förvärva hela bildrutor på ~ 1 bildruta / sekund).
  5. Låt ca 10 minuter för att tillåta eventuella lågmolekylära fragment att rensa innan förvärva 3D volymer till 1 um mellanrum som skall användas vid beräkning albumin GSC. Typiskt har Simonsens stam av München Wistar råttor betydligt färre ytan glomeruli, så allt som kan visualiseras avbildas och kvantifieras. Den Frömter stammen har ett mycket större antal så vi begränsa antalet kvantifieras till ~ 10.
  6. Vid slutet av studien råttan avlivas genom en överdos av anesthetic användes i studien. En dubbel pneumothoracotamy utförs för att försäkra eutanasi.

6. Beräkning GSC för Lysrör Albumin från 3D-volymer

  1. Använda metamorfa bildbehandlingsprogram ladda 3D datamängder för varje glomeruli, både bakgrunden set och ställa togs efter infusion av fluorescerande albumin.
  2. I volymen innehåller fluorescerande albumin lokalisera en ytlig kapillär slinga med tillräckligt utrymme tomt utrymme mellan de definierade marginaler och kanten av Bowmans kapsel.
  3. I bakgrunden volymen lokalisera samma fokalplan som ska innehålla alla de visuella ledtrådar för albumin innehållande bilden. Välj en region inom kapillär slinga av intresse och notera den genomsnittliga intensiteten läsning. Nästa välja en region inom Bowmans utrymme och notera den genomsnittliga intensiteten läsning. Dessa kommer att användas som bakgrund värden.
  4. För kvantifiering väljer samma region inom Bowmans utrymme i albumin containing bild. Gör detta i minst två andra regioner att ta ett medelvärde för den genomsnittliga intensiteten inom Bowmans utrymme.
  5. Välj kapillär slinga med den ljusaste plasma intensitet och rita en region runt den. Nästa använda tröskelvärdet funktionen, markera de ljusa värdena inom plasma, undvika mörka ränder som cirkulerar RBC. Notera medelintensiteten värdena för den valda plasma rymden. Det är viktigt att företrädesvis välja de ljusa områdena i plasma eftersom faktorer i blodet bara kommer att orsaka och underskattning av plasma fluorescens nivåer.
  6. Använda ett Microsoft Excel-kalkylblad ange värden för att beräkna generalsekretariatet där:

Figur 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3 visar ett exempel på en bild tagen från en yta glomerulus av München Wistar Frömter råtta och de åtgärder som vidtagits för att bestämma permeabilitet fluorescerande albumin. GSC värde för albumin av 0,0111 härledas för denna person glomerulus faller inom samma område som hos denna stam av München Wistarråttor när i Fed skick 3. Stabiliteten ses i dessa bilder beror på noggrann planering och utförande av instruktioner som avbildas i figurerna 1 och 2. Såsom angivits tidigare, är placeringen av snittet som används vid exteriorizing njuren det mest avgörande steget i att producera stabila bilder fria från rörelseartefakt.

Figur 1
Figur 1. Ett detaljerat schema av positionering av en orienteringav råttan på mikroskop scenen före avbildning. Lägg försiktigt ned råttnjure nedåt (enligt A) över Repti-Therm värmedynor med njurarna om i täckglaset skålen. Rulla njuren utåt (*) så att den ventrala sidan berör täckglas botten och kontakt sker med autoklav tejp (AT). För att minimera andas inducerad rörelse, rulla råttan framåt (**) så att bröstkorgen är ute i området omedelbart ovanför täckglaset skålen. Fyll skålen med steril 0,9% koksaltlösning och täck med vatten jacka. Använd en termometer för att övervaka rektal temperatur och vrid rEPI-Therm kuddar på och av efter behov. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2 : Src = "/ files/ftp_upload/50052/50052figure2highres.jpg" />
Figur 2. . Exteriorisering av njure i München Wistar Rat före placering på mikroskop scenen en sövd råtta placeras med sin vänstra storlek upp, området mellan bröstkorgen och övre lår rakade (visas i grått, A). När sekventiella snitt görs för att skära genom huden, yttre sedan inre muskellagret såsom visas av linjen korsa njuren i A. Njuren med tillhörande peri-renal fett bör vara synligt (B). Med hjälp av en pincett, är fettet kläms i en hand-over-hand mode tills den undre mest polen nås (BE). Tryck försiktigt på ytan under njuren samtidigt dra på fettet att exteriorize. Klicka här för att visa en större bild .

052/50052figure3.jpg "alt =" Bild 3 "fo: innehåll-width =" 5.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50052/50052figure3highres.jpg "/>
Figur 3. Enda plan bilder tagna från 3D-volymer visar ett glomerulus en München Wistar råtta. Paneler A och B visar bakgrundsbilder och en tagit ~ 12 infusion min post i Texas Red råttserumalbumin (TR-RSA) i svart och vitt. Notera avsaknaden märkbar intensitet kapillära slingor (CL) eller Bowmans utrymme (BowSp) i bakgrunden bilden (A). Fält C visar en region som tas från panel A i pseudofärger att bättre visualisera de låga intensitet bakgrund av vävnad. Här är en liten region som dras i en kapillär slinga (längre region) och inom Bowmans utrymme att uppskatta befintliga fluorescerande intensitet som måste subtraheras från värden som erhålls efter infusion av fluorescerande albumin. Paneler D och E är tan från panel B och visas i pseudofärger. Tre små regioner av intresse i enlighet med Bowmans utrymme används för att beräkna den genomsnittliga intensiteten av fluorescerande albumin som har förflyttas över filtrering barriären (D). Medelintensitet värdena för de enskilda regionerna rapporterades i det markerade området inom "Statistiken visar Region" i dialogrutan (panel D '). För att beräkna de cirkulerande värden plasma intensitet inom kapillära slingor (CL, i panel E) en stor region dras över den ljusaste kapillär slingan och de ljusa värdena längs den markerade med en tröskel funktion (visad en apelsin pixlar). Bara intensiteten värdena för pixlarna markerade i orange kommer att rapporteras oberoende av formen eller storleken på den omgivande regionen. Panel E "visar den råa medelintensitet värden för albumin inom de kapillära slingor, notera kontrolleras" Använd tröskeln för intensitetsmätningar "låda som ärkontrolleras. Panel F visar utvecklingen av värderingar utgör vänster till höger med början med bakgrunden värden för Capillary loopar och Bowmans utrymme, som subtraheras från de rådata som erhållits inom de bilderna. När de korrigerade värdena härleds är Bowmans utrymme intensitet värde dividerat med Kapillär Loop intensitet värde att ge Glomerulär siktkoefficient vilket är ett förhållande av permeabilitet, ogenomtränglig molekyler har värdet noll (0), medan de som fritt filtreras ha ett värde av ett (1). Bar = 20 pm. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4
Figur 4. Upptag av filtrerad fluorescerande albumin sker huvudsakligen in den tidiga segmentet av proximala tubuli, S1. Panel A visar ett tvärsnitt av en glomerulus och S1 segmentet tas ~ 20 infusion min efter av den initiala Texas Red RSA bolus. Den öppna Bowmans utrymme och ivrig upptag av albumin (röd) är show i S1 segmentet. Panel B visar en ytlig 20 pm 3D projektion av samma uppsättning data. Panel C visar en 3D-projektion med en lägre effekt 20x objektiv ca 60 min efter infusion. Notera samma glomerulus sågs i paneler A och B som visas i C (*) och de högre nivåerna av albumin hämtning sett i detta segment jämfört med andra proximala tubuli segment. Bar = 20 pm. Klicka här för att visa en större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Stegen markerade här representerar vad vi anser vara de som kommer att producera konsekventa och korrekta permeabilitetsvärden eftersom de kringgå följande fallgropar:

  1. Spridning: Användningen av en röd emitterande fluoroforerna möjliggöra mer effektiv uppsamling av ljus eftersom längre våglängd fotoner är mindre benägna att sprida. Använda antingen gröna eller blå avger fluoroforer kommer att införa större variation i generalsekretariatet på grund av ökad variabilitet i intensitet värden från de kapillära loopar och Bowmans utrymme 3.
  2. Bild djup: Även djupa 3D datamängder brukar samlas (ofta mellan 30-45 mikrometer djup), de övre 10-15 mikrometer utgör de mest lämpliga fokaldjup att bestämma GSC värden. Återigen med större djup kommer en minskning i känslighet och en ökad variabilitet till följd av scatter av emitterade fotonerna. Ännu viktigare är dock trängseln av kapillära slingor som uppstår deeper inom glomerulus. Här används kapillära slingor pressas upp tätt till kanten av Bowmans kapsel som omger Bowmans utrymme. Detta ökar chanserna för misstag välja ett område direkt över en av de många podocytes som omger de kapillära slingor. Detta kommer att leda till en underskattning av generalsekretariatet eftersom det sanna, högre intensitet filtrerade albumin inte kommer att rapporteras. Obs Panel B och D i figur 3 och den stora mängden utrymme närvarande mellan kanten på de kapillära slingor och kanten av Bowmans utrymme 3.
  3. Provtagning: Markera flera regioner inom Bowmans utrymme försäkrar den bästa approximation av detektering filtrerade albuminnivåer. Det är också viktigt att undvika områden som 11 och 12:00 position ovanför de kapillära loopar. Fokusera genom 3D-volymen avslöjar en uppsättning kapillära slingor fångas nästan tvären strax nedanför fokalplan. Detta område skulle ge ett falskt förhöjt GSC värde avöverskattar den filtrerade albumin. Omvänt är det viktigt att välja den ljusaste delen av plasman inom kapillära slingor att bäst avgöra de verkliga nivåerna av cirkulerande fluorescerande albumin. Här underskattar dessa nivåer kommer också att öka GSC genom att minska värdet av nämnaren i ekvationen.

Validering av denna teknik sker genom att avbilda en filtreras fritt förening med en GSC av ett (1). Här, farhågor som konsekvent underskattar albumin i plasma, beroende på optiska begränsningar är ansvarig för att överskatta albumin permeabilitet, anses eliminerade 3. Dessutom, efter att ha fastställt en GSC värde för en 70kDa dextran som är nästan identisk med den som erhålls genom att mäta urin clearance / plasma nivåer och micropuncture bevisa intravital 2-foton mikroskopi är kapabel att korrekt bestämma permeabilitet fluorescerande makromolekyler 2. Slutligen, förmågan att visualisera snabbt the glomerulus och rörformiga segment längs filtratet banan, med en hög grad av upplösning, 2-foton mikroskopi står unikt redo att kvantifiera betydelsen av glomerulär filtration barriären och PT att bestämma protienuria och albuminuri.

De protokoll som beskrivs häri är baserade på användningen av en 2-Photon-system med en inverterad etapp som har fördelar i enkelheten i de inblandade kirurgiska ingrepp och råtta placering på scenen. För information om att använda en 2-Photon systemet med en upprätt skede finns i kapitel av Dunn et al. 7 i Current Protocols in Cytometry (2007).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgements

Författarna vill tacka Dr Silvia B Campos-Bilderback och George J Rhodos för att slutföra kirurgiska ingrepp som omfattar placering av linjer venös tillgång. De skulle också vilja tacka Sara E avvänja för att upprätthålla de Munich-Wistar kolonier bestående av både Simonsen och Frömter stammar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope Olympus America Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser Spectra-Physics Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors Hamamatsu Corp Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software Molecular Dynamics Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel Microsoft Corportation 2007 version
Handling Forceps Electron Microscopy Sciences Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors Electron Microscopy Sciences Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300 Electron Microscopy Sciences Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight) Electron Microscopy Sciences Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad Gaymar T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater ZooMed RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride Invitrogen/Molecular Probes Cat# T-353
Rat Serum Albumin Sigma Aldrich Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF Sigma Aldrich Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape Fisher Scientific Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) Electron Microscopy Sciences Cat# 70665-07

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russo, L. M., et al. The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states. Kidney International. 71, 504 (2007).
  2. Russo, L. M., et al. Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 20, (3), 489 (2009).
  3. Sandoval, R. M., et al. Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats. Journal of the American Society of Nephrology. 23, (3), 447 (2012).
  4. Tojo, A., Endou, H. Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique. American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).
  5. Asgeirsson, D., et al. Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation. Acta Physiologica. 191, (3), 237 (2007).
  6. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy. Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).
  7. Dunn, K. W., et al. Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics