Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

* These authors contributed equally
Immunology and Infection
 

Summary

Nós descrevemos um método de imagem ao vivo de células que fornece insights sobre a dinâmica de proteínas durante o processo de ativação de células-T. Nós demonstramos a utilização combinada de a célula T-ensaio espalhamento, microscopia confocal e análise de imagens para se obter resultados quantitativos para seguir a formação do complexo de sinalização durante a activação de células-T.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Noy, E., Pauker, M. H., Barda-Saad, M. Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation. J. Vis. Exp. (76), e50076, doi:10.3791/50076 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

A protecção contra doenças infecciosas é mediada pelo sistema imunológico 1,2. Os linfócitos T são os coordenadores mestre do sistema imunitário, que regula a activação e respostas de várias células imunitárias 3,4. A activação das células T depende do reconhecimento de antigénios específicos apresentados por células apresentadoras de antígenos (APCs). O receptor de antigénio de célula T (TCR) é específico para cada clone de células T e determina a especificidade do antigénio 5. A ligação do TCR para o antigénio induz a fosforilação dos componentes do complexo TCR. A fim de promover a activação das células T, o sinal deve ser transduzida a partir da membrana para o citoplasma e o núcleo, inicia várias respostas cruciais tais como o recrutamento de proteínas de sinalização para o TCR; da APC (da sinapse imune), a sua activação molecular, rearranjo do citoesqueleto, a elevação da concentração de cálcio intracelular, e as alterações na expressão do gene 6,7. O correto emitiation e terminação dos sinais de activação é crucial para as respostas de células T apropriadas. A actividade das proteínas de sinalização é dependente da formação e terminação de interacções proteína-proteína, pós translacionais, tais como a fosforilação da proteína, a formação de complexos de proteína, ubiquitinação de proteínas e ao recrutamento de proteínas para vários locais celulares 8. Compreender o funcionamento interno do processo de ativação de células T é crucial para a pesquisa imunológica e aplicações clínicas.

Diversos ensaios têm sido desenvolvidas a fim de investigar as interacções proteína-proteína, no entanto, os ensaios bioquímicos, tais como o método de co-imunoprecipitação amplamente utilizado, não permitem a localização da proteína para ser discernidos, impedindo assim a observação de informações valiosas sobre a dinâmica de celular mecanismos. Além disso, estes ensaios granel geralmente combinam proteínas de muitas células diferentes que podem estar em diferentes fases da tele investigou processo celular. Isto pode ter um efeito prejudicial na resolução temporal. A utilização de imagens em tempo real de células vivas tanto permite o rastreio espacial das proteínas e a capacidade de distinguir entre os eventos de sinalização temporalmente, derramando assim luz sobre a dinâmica do processo de 9,10. Apresenta-se um método de imagem em tempo real da formação do complexo de sinalização durante a activação de células-T. As células T primárias ou linhas de células T, como Jurkat, são transfectadas com plasmídeos que codificam para proteínas de interesse fundidos a proteínas fluorescentes monoméricos, impedindo oligomerização não fisiológico 11. Vivo células T são eliminadas durante uma lamela pré-revestida com anticorpo de activação de células T 8,9, o qual se liga ao complexo CD3/TCR, indução da activação de células T ao superar a necessidade de antigénios de activação específicas. As células activadas são constantemente fotografada com a utilização de microscopia confocal. Dados de imagem são analisados ​​para produzir resultados quantitativos, como o colcoeficiente ocalization das proteínas de sinalização.

Protocol

1. A transfecção de células T

  1. Preparar a solução Nucleofector Amaxa ativado através da mistura de solução "Anexo" do kit para a solução Nucleofector. A solução activada pode ser armazenado a 4 ° C durante até três meses.
  2. Cultivar células T de Jurkat em meio de cultura [10% de soro fetal de vitelo (FCS), uma solução de Penicilina-Estreptomicina a 1%, e 2 mM de L-glutamina em meio RPMI]. Idealmente, as células devem ser utilizados 1-2 semanas depois do descongelamento. Utilizando culturas de células em crescimento logarítmico é crucial para a alta eficiência de transfecção e da sobrevivência celular. Alternativamente, com modificações menores, este protocolo pode ser utilizado com células T primárias, tal como anteriormente descrito 8. Deve ser enfatizado que, como a duração do processo de activação de células T primárias é mais longa do que a de células T de Jurkat (~ 30 min), uma fase de microscópio montado sistema de incubação deve ser usada para manter os níveis de humidade e de temperatura em todo o CO 2, ativação do processo.
  3. Colete 5× 10 6-fase log por transfecção de células T para um tubo de 15 ml.
  4. Centrifugar as células durante 7 minutos a 400 x g à temperatura ambiente.
  5. Durante a centrifugação, preparar uma placa de 6 poços. Encher um poço para cada transfecção com 5 ml de meio de cultura, e pré-incubado a 37 ° C.
  6. Recolher os tubos da centrífuga e desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de RPMI.
  7. Centrifugar as células durante 7 minutos a 400 x g à temperatura ambiente.
  8. Durante a centrifugação, a preparação da solução de transfecção. Em um poço de uma placa de 96 poços, misturar 100 ul de solução Amaxa Nucleofector activado, preparado no passo 1, com 5 ug de ADN do plasmídeo de interesse que codifica para uma proteína fluorescente marcado. Idealmente, a concentração de DNA deve ser maior do que 1 ug / ml, a fim de evitar a diluição da solução de transfecção.
  9. Misture bem por pipetagem suave.
  10. Após a centrifugação das células, remova cuidadosamente todo o sobrenadante enquanto não disturbing o sedimento.
  11. Pipetar a solução de ADN / transfecção duas vezes.
  12. Adicionar a solução de DNA / transfecção com o sedimento.
  13. Transferir as células à Amaxa cuvete.
  14. Insira a cuvete no dispositivo Nucleofector Amaxa.
  15. Usar o ajuste H-10 Amaxa transfecção por electroporação (para Jurkat) e T-23 (para as células T primárias).
  16. Remova a placa de 6 poços da incubadora.
  17. Após electroporação, transferir cuidadosamente o sobrenadante com a suspensão de células para a placa de 6 poços utilizando uma pipeta de Pasteur. Um sedimento consistindo em fragmentos de células podem formar. Evitar transferir o sedimento.
  18. Incubar as células durante 24 horas a 37 ° C.
  19. Transferir 2,5 ml de suspensão de células de cada poço para um poço novo. Adicionar 2,5 ml de meio de cultura quente (descrito no passo 2) a cada poço.
  20. Após 72 h, a transferência das células para um tubo de centrífuga estéril e durante 7 minutos a 400 x g à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e substituí-lo wipo meio de cultura suplementado com o antibiótico de selecção de células de mamífero apropriada para o plasmídeo utilizado (aplicar uma concentração adequada para os antibióticos usados, foi aplicado a G418 e / ou higromicina em concentrações de 1,3 mg / ml e / ou 0,2 mg / ml, respectivamente). Cultura da suspensão de células num poço fresco. Alternativamente, as células podem ser transfectadas transitoriamente e fotografada 48 horas após a transfecção. Para preparar as células transfectadas transitoriamente, co-transfecção as células com os dois plasmídeos simultaneamente no passo 8, continuando normalmente a etapa 20 e, em seguida, pular diretamente para o passo 23. Note-se que neste cenário, as células devem ser usados ​​imediatamente, e, geralmente, a sua intensidade de fluorescência é heterogênea e não necessariamente de alta.
  21. Cultivar células em meio de cultura suplementado com o antibiótico de selecção apropriado. Dividir as células e complementá-los com meio de cultura suplementado com antibiótico, se necessário.
  22. Após 2 semanas, verificar a transfecção bem sucedida com o uso de FACS (gripeseparação de células activada por orescence) como se segue:
  23. Recolha 10 6 células transfectadas, 10 6 células transfectadas simuladas (controlo negativo), e 10 6 células que são conhecidas por expressar estavelmente a proteína fluorescente marcado. Se as células são transfectadas com mais de uma proteína fluorescente (ver passo 27), o uso de várias linhas de células, individualmente marcados como controlos positivos.
  24. Centrifugar as células durante 7 minutos a 400 x g à temperatura ambiente.
  25. Descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em 500 ul de tampão de FACS (PBS w / o Ca 2 + e Mg 2 +, 5% de FCS, 0,05% de azida de sódio).
  26. Use um FACS análise para verificar a fluorescência celular. Comparar a fluorescência das células transfectadas com a dos controlos negativos e positivos.
  27. Para transfectar as células com um adicional, marcados por fluorescência de proteína, repetir os passos 3-26 utilizando as células transfectadas.
  28. Células são visualizadas elevados níveis de fluorescência deveria ser usado. Idealmente, pelo menos, 50% deas células da cultura deve ser altamente fluorescente. Fluorescência celular pode ser aumentada por separação de células por meio de FACS.

As proteínas marcadas com adicionais devem ser fundidos com fluoróforos diferentes e ser codificado em plasmídeos que codificam para diferentes antibióticos de selecção. Meio de selecção para as células transfectadas com mais do que um plasmídeo deve ser suplementado com todos os antibióticos apropriados.

2. De células T Espalhando Preparação de Ensaio

  1. Use Lab-Tek II sistema lamela alemão 4 slides de câmara. Certifique-se de que não arranhar acidentalmente a superfície interior das câmaras, por exemplo, com uma ponta de pipeta, durante a preparação ou utilização.
  2. Preparar 50 ml de solução de preparação da lâmina: Tome 4,6 mL de 12 M (37%) de HCl, adicionar 38,5 ml de etanol a 100%, e 6,9 ​​ml de água bidestilada.
  3. Encha cada câmara do slide com 500 mL solução de preparação da lâmina.
  4. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
  5. Aspirar a câmaras, secá-los completamente.
  6. Incubar as lâminas descoberto por 1 hora a 45 ° C até secar completamente.
  7. Preparar a solução de poli-L-lisina 0,01% por diluição de 0,1% de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) em água duplamente destilada.
  8. Aplicar 500 mL para cada câmara.
  9. Incubar as lâminas durante 15 minutos à temperatura ambiente.
  10. Aspirar as câmaras, secá-los completamente.
  11. Incubar durante 3 horas a 45 ° C até secar completamente.
  12. Lâminas revestidas podem ser armazenadas secas durante vários meses à temperatura ambiente.
  13. Prepara-se uma solução de anticorpo activador. Utilização de um anticorpo anti-CD3: ou HIT3a (BD Pharmingen, # 555337) ou UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 10 ug / ml em 400 ul de PBS, em cada câmara. Esta solução deve ser preparada pouco antes de preparação.
  14. Encher cada câmara com 400 ul da solução de anticorpo activador.
  15. Incubar a lâmina durante 2 horas a 37 ° C ou, de preferência, durante a noite a 4 ° C.
  16. Remover o anticorpo de activação solenóidebuição e lave imediatamente a câmara duas vezes com 300 mL PBS. A partir deste ponto, certifique-se as câmaras permanecem cheias de buffer.
  17. Armazenar o diapositivo PBS preenchido a 4 ° C. Sugerimos o uso das câmaras de slides preparados dentro de 1 semana.

3. A ativação de células T e Imagem

  1. Preparar tampão de imagiologia [1,25 ml de HEPES (1 M), 10 ml de FCS, 38,75 mL de meio RPMI sem vermelho de fenol]. Tampão de imagiologia pode ser armazenado a 4 ° C após filtração.
  2. Ative o Zeiss LSM 510 Meta microscópio. Aqueça o heatable estrutura de montagem microscópio para 37 ° C. Selecione "Modo Expert".
  3. Clique na aba "Adquirir" e abra as seguintes guias: Lasers; Microscopia; configuração; digitalização; Tempo Series.
  4. Ative os lasers necessários. Para excitação do CGPP e mYFP, defina o Argon / 2 laser para "standby" para 5 min, em seguida, para "on".
  5. Se você executou este ensaio de imagens de células ao vivo antes, usando os mesmos fluorophores, abra o arquivo LSM resultante, clique no botão "reutilização" iengodo, e continuar a partir do passo 9. Caso contrário, continuam a partir do passo 6.
  6. Definir canais utilizando os filtros apropriados para a excitação e de emissão das proteínas fluorescentes utilizados.
  7. Na janela "Scan controle", selecione a opção pilha Z.
  8. Digite os seguintes parâmetros de rastreamento: número de fatias: 5; intervalo: 0,5 m; fatia atual: 3.
  9. Preparar um banho Accublock digital seco (Labnet) a 37 ° C perto do microscópio.
  10. Aquecer o tampão de imagiologia e 37 ° C.
  11. Prepare o slide armazenados por aspiração do PBS, substituindo-o por 600 mL de tampão de imagem quente.
  12. Incubar a lâmina a 37 ° C. Manter a lâmina na incubadora até passo 13, durante pelo menos 15 min.
  13. Colete 5 × 10 5 células T transfectadas.
  14. Centrifugar as células durante 2 minutos a 400 x g.
  15. Descartar o sobrenadante.
  16. Ressuspender as células em 1 ml de tampão de imagiologia quente, e transferi-los para um tubo Eppendorf de 1,5 ml.
  17. Coloque a ttubo est no banho a seco Digital Accublock.
  18. Leve o slide aquecido da incubadora, e montá-lo no microscópio estrutura de montagem aquecido.
  19. Clique no ícone "VIS".
  20. Misture a suspensão de células e remover 1-2 ul.
  21. Inserir a ponta da pipeta para o buffer de imagem de cima da parte inferior da lâmina. Evite coçar o slide.
  22. Semente das células sobre a abertura da objetiva.
  23. Começar imediatamente rastrear visualmente as células fluorescentes como eles descem. Seleccionar uma célula que exibe fluorescência elevada em ambos os canais.
  24. Antes de a célula atinge a superfície da lâmina, activar o modo de LSM.
  25. Alterna apenas uma excitação com laser. Selecione um laser para o qual você tem um canal de DIC.
  26. Definir Zoom para 1. Clique no ícone "Fast XY". Clique no ícone "Stop". Usando a ferramenta Recortar, selecione um ROI centrado na célula.
  27. Definir Zoom para 3. Clique no ícone "Fast XY", em seguida, definir o foco manualmente para ver perfeitamente o celular. Clique no botão "Stop" icon.
  28. Alternar todos os lasers de excitação necessários.
  29. Iniciar a gravação clicando no ícone "StartT". Imagem da célula para a totalidade do processo de difusão (habitualmente 5 min.) Quando terminar, clique no ícone "Stop".
  30. Salve o arquivo.
  31. Para adquirir células adicionais, clique no ícone "VIS". Se há células que ainda não entrou em contato com o fundo do slide, continue a partir do passo 23. Evite células de imagem que já começaram o processo de propagação. Caso contrário, vá para o passo 32.
  32. Se a área de lâmina observada é principalmente desprovida de células, adicionar uma outra alíquota de células continuam a partir do passo (20). Caso contrário, vá para o passo 33.
  33. Para adquirir células adicionais, mover a corrediça de modo que a zona superior da abertura da objectiva é desprovida de células.
  34. Adicionar outra aliquota de células (e continuar no passo 20).
  35. Após a realização de toda a imagem desejada, abrir um arquivo LSM salvos.
  36. Clique em "Galeria", "Time + Z" e "subconjunto".
  37. Selecione o relevant intervalo de tempo e pilha Z.
  38. Salve o novo arquivo.
  39. Realize os passos 35-38 para todos os arquivos de imagem.

4. Análise de dados de imagem

  1. Abra os arquivos usando o software LSM Imaris (Bitplane AG, Zurich Suíça).
  2. Clique em "Superar". Clique no menu "Processamento de Imagem" e selecione "Troque Tempo e Z". Isso vai ajudar no cultivo correto da imagem.
  3. Clique no botão "Editar" da barra de ferramentas e selecione a opção "Crop 3D" no menu drop. Cortar a imagem para incluir apenas a área circundante da célula. Sugerimos cortar um quadrado de pixels 300 × 300 centrado na célula. Note-se que a forma ea localização da célula pode mudar ao longo do tempo. Observando-se o eixo t, certifique-se de que a célula está dentro da região cortada em todos os momentos.
  4. Clique no menu "Processamento de Imagem" e selecione "Troque Tempo e Z" para restaurar a separação temporal original da imagem.
  5. Pressione o botão "Coloc" na barra de ferramentas principal. Selecione "Construir Tempo Dep. COLOC ". Imaris calculará automaticamente limiares de intensidade para cada canal em cada momento.
  6. Ver os resultados da análise de co-localização, selecionando "Estatísticas Channel". Exportar os dados, clicando em "Export".
  7. Repetir os passos 1 a 6, para cada célula de imagens. Recomenda-se que pelo menos 50 células ser analisados ​​desta forma.
  8. Calcule o coeficiente de co-localização média de Pearson e seu erro padrão ou desvio.

Representative Results

Nós apresentamos um exemplo de imagem de células T ao vivo e análise. Antes do experimento imagiologia, SLP76 células T deficientes (J14) foram analisadas com o uso de FACS para determinar a expressão de proteínas fluorescentes (Figura 1). As células T transfectadas com as proteínas de sinalização etiquetados CGPP-Nck e SLP76-mYFP foram depositadas sobre lâminas de activação e fotografada durante o espalhamento das células-T (Figura 2). Recolhidas as imagens mostram a dinâmica da localização da proteína durante a activação e disseminação (Figura 3). Processamento de imagem computadorizada fornece novos insights e informações quantitativas das células visualizadas, minimizando o viés humano. Para analisar a co-localização das duas proteínas durante o processo de activação celular, utilizou-se o co-localização da ferramenta do software Imaris (Bitplane AG, Zurique, Suíça). Ao comparar os coeficientes de co-localização entre os diferentes pontos de tempo através de células com imagens, que foram poder verificar se a co-localização de Nck SLP76 e não se altera significativamente durante a activação de células T (p> 0,3) (Figura 4).

Figura 1
Figura 1. A análise FACS das células transfectadas com as proteínas dupla fluorescentemente marcadas Os dados são mostrados como histogramas de intensidade de fluorescência para (A) CGPP;. (B) mYFP, e (C), como um gráfico de pontos. Intensidade de fluorescência de J14 células transfectadas com CGPP-Nck e SLP76-mYFP são representados em ciano e amarelo, respectivamente. J14 células de controlo negativo não transfectadas estão indicadas por linhas pretas.

/ Files/ftp_upload/50076/50076fig2.jpg "/>
Figura 2. A representação esquemática do live-célula T espalhando ensaio (A) A preparação de lâminas de ativação de células T;. (B) viver T-cell espalhando ensaio e análise;. (C) a instalação de microscopia Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 3
Figura 3. Distribuição de Nck SLP76 e durante o processo de activação de células-T. Células que expressam CGPP-Nck e SLP76-mYFP foram retiradas ao longo de anti-CD3 de anticorpos estimuladores lamelas pré-revestidas e constantemente fotografada por um período de 7 min. CGPP-Nck é representado por ciano, enquanto SLP76-mYFP é mostrada a amarelo.


Figura 4. A análise quantitativa de co-localização de proteínas. Processamento de imagem de células foi realizada utilizando o software Imaris (Bitplane AG, Zurich Suíça). Co-localização é calculada como coeficiente de correlação de Pearson entre as intensidades do canal CGPP eo canal mYFP para cada pixel. Coeficientes de co-localização de Pearson calculado a partir de diferentes pontos de tempo são comparadas. Trinta segundos para o processo de ativação, o coeficiente de co-localização de CGPP-Nck e SLP76-mYFP foi significativamente aumentada (p <0,05). Estes resultados foram calculados por análise> 50 células independentes. A média ± erro padrão são mostrados.

Discussion

A regulação e função de vários processos celulares dependem da formação e terminação de interacções proteína-proteína. Imagens microscópicas permite o acompanhamento em tempo real das proteínas fluorescentes marcados em células vivas. Co-localização de proteínas marcadas pode sugerir uma interacção directa ou indirecta entre as proteínas, e podem ser usados ​​para reforçar resultados obtidos por métodos bioquímicos, tais como a imunoprecipitação. Ao contrário de métodos bioquímicos, imagens ao vivo de células permite que as interacções entre estas proteínas a serem observadas e espacialmente ao longo do tempo, o que facilita o controlo dos processos fisiológicos como eles ocorrem e a detecção da distribuição celular de proteínas. Várias ferramentas para a análise quantitativa de colocalização têm sido desenvolvidos, coeficiente de correlação de Pearson continua a ser um método muito atraente e amplamente disponíveis para a quantificação do nível de co-localização entre as duas proteínas 12. Apesar de ressonância de fluorescência etransferência (FRET) experimentos nergy permitir a detecção de interações inter-proteínas caracterizadas pela proximidade (10 nm), este método requer configurações especializadas (equipamentos e compatibilidade de taggings fluorescentes usadas) e processamento de dados complexos. Para a maioria dos usos, a análise de co-localização, em conjugação com os métodos bioquímicos, constitui uma ferramenta easy-to-use e método simples para a observação de interações proteína-proteína ao longo do tempo.

Estabelecer um limite de intensidade de fluorescência para pixels analisados, ignorando pixels abaixo do limiar de intensidade para cada canal, é de fundamental importância para a análise de co-localização precisa e sensível. O algoritmo utilizado para a determinação objectiva e automática desses limiares, foi desenvolvido por Costes et al. 13 e é implementado por programas de processamento de imagem, tais como Imaris e Volocity.

Aqui, demonstramos a utilização do imag vivo de células-Ting método para analisar a dinâmica das SLP76, um andaime chave nas células T, e Nck, uma proteína adaptadora, ambas as quais são essenciais para a activação de células T 14,15. Imagens das células T recolhidas durante a activação sugerem que as duas proteínas são co-localizada ao longo do processo de activação celular (Figura 3). Isto é quantitativamente corroborado por realizando um teste de co-localização de Pearson em imagens recolhidas por todo o processo de activação. Co-localização coeficientes de variação de Pearson de -1 a 1, onde uma pontuação de -1 significa anti-correlação, uma pontuação de 1 significa co-localização perfeita e 0 significa que não há correlação entre os dois canais de imagem. A comparação dos coeficientes de co-localização de Pearson calculado para diferentes pontos de tempo e para diferentes células indica que a co-localização de Nck SLP76 e não se altera significativamente durante a activação celular, mas mantém-se constante (p> 0,3, Figura 4). Embora o co geral colocalizaçãoeficiente destas proteínas não se altera ao longo do processo de activação, não elimina a possibilidade de um processo dinâmico de associação e dissociação entre estas proteínas que ocorrem 18.

O protocolo foi apresentado pode também ser adaptado para outras linhas de células hematopoiéticas, ajustando as condições de crescimento de células, conforme necessário, escolhendo um ambiente adequado para a transfecção de linha de células em questão e modificar o processo de activação celular, se for o caso. Por favor, note que, enquanto usamos o LSM 510 Meta microscópio confocal, com os ajustes e uso de configurações apropriadas, outros sistemas de microscopia confocal pode ser utilizada com sucesso também.

O uso de imagens de células T ao vivo permite que os processos de regulação e ativação de ser diretamente monitoradas, permitindo que eventos de sinalização a serem exploradas com resolução temporal e espacial indisponíveis através de métodos bioquímicos e moleculares. Nós apresentamos um meth simplesOD para a realização de um ensaio de espalhamento de células T ao vivo, monitorizar as proteínas relevantes em tempo real e análise de dados para produzir resultados quantitativos. Os dados resultantes de microscopia também pode ser usado para outras aplicações a jusante, tais como a análise do índice de células em forma de 16 e FRET análise 17,18, dependendo da configuração experimental específico e objetivos da pesquisa.

Disclosures

Nós não temos conflitos de interesse de divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecem a Sophia Fried para assistência técnica. MBS agradece aos seguintes órgãos para o seu apoio à investigação: a Fundação Israel Ciência para bolsas no.1659/08, 971/08 de 1503/08 e 491/10, dos Ministérios da Saúde e Ciência de subvenções não. 3-4114 e 3-6540, o Israel Cancer Association através da propriedade do falecido Alexander Smidoda, e da Fundação Família Taubenblatt para a concessão excelência Bio-medicina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Amaxa human T Cell nucleofector kit Lonza VCA-1002
Anti CD3 (UCHT1 clone) BioLegend 300432
Falcon FACS Tubes Becton Dickinson 352058
FCS HyClone SV30160.03
G418 Calbiochem 345810
German coverglass system 4 chamber slides Lab-Tek II 155382
HCl Bio Lab 8410501
Hepes Biological Industries 03-025-1B
Hygomycin Enzo ALX-380-306
L-glutamine Sigma G7513
PBS (10X) Sigma D1408
Penicillin-Streptomycin Sigma P0781
Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O Sigma P8920
RPMI Sigma R87589
Sodium azide Sigma S2002
Equipment
Accublock digital dry bath Labnet D1105A
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
Confocal microscope Zeiss LSM 510 Meta
Heatable mounting frame - Heating Insert P S PeCon 130-800-031
TempModule S (required for the heatable mounting frame) Zeiss 411860-9010-000
Electroporation device Amaxa Nucleofector I
Fluorescence activated cell sorter Becton Dickinson FACSVantage SE
Image analysis software Bitplane 7.0.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
  2. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
  3. Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
  4. Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
  5. Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
  6. Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
  7. Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
  8. Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
  9. Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
  10. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
  11. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
  12. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
  13. Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
  14. Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
  15. Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
  16. Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
  17. Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
  18. Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics