Um método de estabilização Novel Vertebral para a Produção de contusão Lesão Medular

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Summary

Estabilização vertebral é necessário para minimizar a variabilidade, e para a produção de lesões da medula espinhal experimentais consistentes. Utilizando um aparelho de estabilização personalizado em conjunto com o dispositivo de pêndulo NYU / MASCIS, demonstramos aqui o equipamento e procedimento adequado para gerar cervical (C5) lesões na espinal hemi-contundente reprodutíveis medula em ratos adultos.

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Walker, M. J., Walker, C. L., Zhang, Y. P., Shields, L. B., Shields, C. B., Xu, X. M. A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing Contusive Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (95), e50149, doi:10.3791/50149 (2015).

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Abstract

Animais cervical lesão medular clinicamente relevante modelos (SIC) são essenciais para o desenvolvimento e teste de terapias potenciais; no entanto, a produção de SCI cervical confiável é difícil devido à falta de métodos satisfatórios de estabilização vertebral. O método convencional para estabilizar a coluna vertebral é suspender a coluna cervical rostral e caudal através de grampos ligados a processos espinhosos cervical. No entanto, este método de estabilização não consegue evitar tecido produzindo durante a contusão como os processos da coluna vertebral cervical são demasiado curto para ser eficazmente protegido por as braçadeiras (Figura 1). Aqui nós introduzimos um novo método para estabilizar completamente a vértebra cervical no mesmo nível da lesão impacto. Este método minimiza eficazmente o movimento da coluna vertebral no local de impacto, o que melhora consideravelmente a produção de SIC consistentes. Nós fornecemos a descrição visual do equipamento (Figura 2-4), métodos, e um protocolo passo-a-passo para a estabilização do 5 vértebra cervical (C5) de ratos adultos, para executar laminectomia (Figura 5) e produzir um SCI contundente posteriormente. Embora apenas se demonstrar de um hemi-contusão cervical utilizando o impactador NYU dispositivo / MASCIS, esta técnica de estabilização vertebral pode ser aplicado a outras regiões da espinal-medula, ou ser adaptado para outros dispositivos de SCI. Melhorar a exposição da medula espinhal e fixação através de estabilização vertebral pode ser valiosa para a produção de lesões consistentes e confiáveis ​​para a medula espinhal. Este método de estabilização vertebral também pode ser utilizado para injecções estereotáxicas de células e os marcadores, e para imagiologia por microscopia de dois fotões em vários estudos neurobiológica.

Introduction

Força mecânica consistente e replicável no tecido espinhal alvo é fundamental para minimizar a variabilidade funcional e histológico e para o estabelecimento de modelos de sucesso contundente 1-7 lesão medular (LM). A quantidade de força aplicada a uma região alvo da medula espinhal depende dos métodos utilizados para a estabilização da coluna vertebral. Deslocamento posicional da coluna alvo durante o contacto entre o êmbolo de impacto e da medula espinhal altera a força de lesão resultante. O modelo SCI contusão cervical é um modelo clinicamente mais relevante do que outras formas de SCI, como aproximadamente 50% dos casos humanos de LM ocorrer a este nível 8, e vários estudos SCI foram realizados utilizando modelos animais de lesão cervical 9-14. Embora os modelos SCI contusão muitas vezes utilizam alguma forma de estabilização, fixando o anterior processos espinhosos e posterior para o local da lesão, esta preparação é difícil para a produção de SCI cervical. &# 160; Como mostrado nesta demonstração, o método de estabilização que desenvolvemos é vantajoso na sua capacidade para aumentar a qualidade e reprodutibilidade de contusão. Particularmente, este método de estabilização vertebral foi criada em uma tentativa de alterar as deficiências e os desafios de outros modelos: 1) variabilidade na vertebral produzindo sob a força do impacto pode ocorrer por aperto processos espinhosos adjacentes dorsal rostral e caudal à laminectomia. O grau de deslocação vertebral é dependente do número de articulações vertebrais entre o impacto e a vértebra a ser estabilizado (Figura 1). Portanto, quanto mais articulações envolveu a menos estável a coluna vertebral torna-se; 2) os processos espinhosos dorsais são frágeis e falha braçadeira causa como um resultado de fractura processo espinhoso ou o grampo de deslizar fora do processo; e 3) os processos espinhosos sobre estas vértebras são extremamente curto entre o C3 a T1 vértebras em comparação com aqueles da vértebra torácicabrae, o que torna difícil usando grampos tradicionais de compreender os processos espinhosos para a estabilização da coluna cervical.

Descrevemos aqui um novo método de estabilização da coluna vertebral para a produção de C5 contundente SCI em fêmeas adultos de ratos Sprague-Dawley. Este método pode ser usado para a estabilização de outros níveis da coluna vertebral e medula espinhal, e os conjugados de bem com outros dispositivos SCI contusão, incluindo o cabo de New York University / Multicenter animal Spinal Injury Study (NYU / MASCIS) pêndulo 15 (Figura 2) , Sistemas de precisão e Instrumentação, LLC Infinito Horizon (IH) dispositivo 16, da Ohio State University / eletromagnética Spinal Cord Injury dispositivo 1, e o aparelho de Louisville Sistema Injury (LISA) 17, permitindo a utilização generalizada em pesquisa SCI.

Protocol

1. A exposição do colo do útero Spinal Lâminas

  1. Limpar a superfície cirúrgico com etanol a 70%, pré-aquecida com uma almofada de aquecimento. Cubra a superfície com um campo cirúrgico estéril, antes de colocar gaze esterilizada, compressas de algodão, e as ferramentas cirúrgicas autoclavada na área de cirurgia. Use um esterilizador microbead para esterilização inter-cirurgia de instrumentos cirúrgicos.
  2. Anestesiar ratos com cetamina (87,7 mg / kg) / xilazina (12,3 mg / kg) por via intraperitoneal (IP). O plano de anestesia adequada é atingida quando o animal deixa de responder a um estímulo de aperto do dedo do pé. Injectar subcutaneamente 0,01-0,05 mg / kg de Buprenorfina e 5 mg / kg Carprofeno antes da intervenção cirúrgica. A buprenorfina devem então ser administrados a cada 8-12 horas e carprofeno uma vez por dia, durante os primeiros 4-7 dias após a cirurgia.
  3. Aplicar pomada protetora para os olhos do animal para evitar o ressecamento da córnea durante a cirurgia.
  4. Raspar a área cirúrgica na dorsalsuperfície do rato a partir do meio da região torácica para a parte de trás da cabeça com tesoura. Remover pele raspada utilizando um vácuo equipado com um filtro HEPA.
  5. Aplicar a solução betadine para a área raspada como paramentação em seguida, limpar a área com 70% de algodão embebido em álcool isopropílico.
  6. Utilize uma lâmina de bisturi para fazer uma incisão de 3-4 cm na linha média na pele a partir da base da cabeça caudalmente para meados de tórax.
  7. Identificar a linha média da fáscia e músculos subcutâneos anterior à glândula hibernação no pescoço inferior; cortar o trapézio e outros músculos ao longo da linha média para reduzir a hemorragia.
  8. Encontre a linha média de duas regiões do tecido adiposo subjacente os músculos; cortar os músculos paraspinous estritamente caudalmente ao longo da linha mediana, e as camadas musculares separadas usando um pequeno retractor de tecido até que o nível do processo espinal torácica T2 é atingido.
  9. Identificar e cortar o músculo ligado ao processo espinhoso T2 para utilizar this estrutura como um marco anatômico.
  10. Remover a ponta cartilaginosa do processo espinhoso T2 para melhorar a visibilidade das vértebras cervicais.
  11. Separe os músculos paravertebrais lateralmente dos processos espinhosos e lâminas de C4-T1; no entanto, poupar o músculo que cobre sobre a lâmina C3 para evitar sangramento.
  12. Cortar os músculos sobre as lâminas de C4-T1 lateralmente no sentido das facetas de ambos os lados da coluna vertebral.
  13. Depois as lâminas são espinal exposta, colocar o animal na sua superfície ventral do canal em forma de U do estabilizador.
  14. Identificar a vértebra C5 pela contagem dos processos espinhosos rostral a partir do local de interesse T2 e T1, C7, C6, e, finalmente, C5.

2. Estabilizar as vértebras e Executar o Injury Impact

  1. Posicionar as duas hastes de aço inoxidável do estabilizador para suspender o animal, colocando as bordas serrilhadas dos braços sob a lateral facetas da C5-6 vértebras (Figura 1C). Depois de garantir os braços com vértebras no lugar (Figura 2B), ajustar o aparelho para garantir a estabilização da coluna vertebral está nivelado e centrado. Finalmente, travar os braços apertando os parafusos do estabilizador.
  2. Corte os ligamentos entre os processos espinhosos e lâminas em C4-5 e C5-6 para identificar a margem da lâmina C5.
  3. Usando um micro-rongeur, clipe de fora a metade da lâmina à direita, no C5 como destinado a SCI (Figura 5C-E). Depois de laminectomia, transportar o animal com o estabilizador sob o dispositivo de lesão. Prender o animal juntamente com estabilizador sobre um suporte (Figura 3A-C) para alinhar com precisão o êmbolo sobre o alvo da espinal medula, usando um micro-manipulador lateral (Figura 3).
  4. Sob alta ampliação, localizar as zonas de entrada da raiz dorsal C5 e C6 (DREZs) na superfície da medula espinhal dorsal expostos sem durotomy. Objectivo do êmbolo no meio das duas DREZs identificados e a meio caminho entre a linha média e o bordo lateral da medula espinhal (Figura 5B).
  5. Usando um dispositivo de pêndulo NYU / MASCIS com uma ponta de diâmetro 2,5 milímetros (Figura 3A e B), produzem um hemi-C5 contusão (Figura 5B & E), por uma altura de queda de 10 g haste x 12.5 mm (Figura 2A).
  6. Verifique se o ferimento visualmente por contusões sobre a medula espinhal (Figura. 5E, seta) e verificar os parâmetros de lesão fornecidos pelo software NYU 12,17 (Figura 6).
  7. Sutura músculos e tecidos moles com estéril sutura vicryl 4-0, em seguida, fechar a incisão na pele com grampos cirúrgicos (EZ Clipes).
  8. Aplicar pomada antibacteriana no local da cirurgia.
  9. Administrar 5,0 ml de 0,9% de solução salina por via subcutânea ao animal para a hidratação.
  10. Colocar o animal em um calorambiente sob controlo (recirculação padcage água quente em uma almofada de aquecimento)) com alimento úmido fornecido na roupa de cama (trocadas diariamente), e uma garrafa de água com um bico longo para facilitar o acesso colocada no chão da gaiola. Prestar cuidados para garantir a recuperação adequada antes de devolver o animal para a gaiola.
  11. Como se trata de uma lesão contusão cervical unilateral, o animal provavelmente vai perder a função do membro anterior ipsilateral, transitoriamente, que começa a se recuperar durante as primeiras semanas após a lesão. No entanto, a função contralateral deve permanecer intacto, assim, o animal deve ser capaz de comer e beber sem comprometimento, e ter apenas uma diminuição menor na locomoção e grooming.

Representative Results

Após seguir este protocolo, consistente e reproduzível cervical hemi-contundente SCI é produzido (Figura 5 e 6). O uso de um estabilizador vertebral para estabilizar os processos laterais da mesma vértebra ao nível pretendido para a SCI permite tais resultados satisfatórios. Usando este método, não só a vértebra C5-alvo, mas também adjacente C4 e C6 são rigidamente fixados.

O software NYU / MASCIS proporciona uma leitura com um gráfico definida em um x e eixo-y, e suporta o uso de nosso método de estabilização vertebral, e equipamentos (Figura 6). Este método de estabilização de ferimentos reduz a variabilidade que pode resultar do deslocamento para baixo do tecido alvo e da coluna vertebral (Figura 1). Após lesão, um hematoma azulada unilateral claro centrada entre a C5 e C6 DREZs é visível (Figura 5E). Estes parâmetros de lesão são consistentes de animal para animal de acordo com a leitura fornecido pelo software NYU / MASCIS (Figura 6).

Como a cervical hemi-contusão produz déficits forelimb claras, este modelo é ideal para avaliar membros anteriores habilidades funcionais, como chegar, aliciamento 13, e manipulação de objetos 18-19. Como os défices motores dos membros posteriores são menos proeminentes, de Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) ​​locomotora escala de pontuação 4 não é apropriado para uso neste modelo. O resultado funcional após lesão é mais perceptível nos déficits forepaw extensores ipsilaterais, em que o rato apresenta uma "paulada" punho com todos os dígitos flexionado 18. Todos os animais expostos à mesma gravidade da lesão e do nível da medula espinhal deve apresentar déficits semelhantes ao membro anterior ipsilateral ilustrado neste protocolo, após lesão correta. Animais indevidamente lesada pode apresentar-se com muito diferente manifestação e duração dos déficits 13,18.

Histologicamente, o modelo produz os danos extensivos matéria cinzenta e branca no epicentro lesão e rostral e caudal em relação ao local da lesão, que conduz a formação da lesão e da cavidade considerável continha quase exclusivamente no lado da lesão da medula espinal. Um grande, formas cicatriz glial principalmente baseado em astrócitos nas fronteiras lesão com enorme morte neuronal 18.

Figura 1
Figura 1: Ilustração de flexibilidade da coluna durante SCI contundente com diferentes métodos de fixação. Figuras A e B mostram flexibilidade ou "rendimento" da coluna vertebral quando processos espinhosos são presas dorsal, permitindo impactos impróprios e dados inconsistentes. A ilustração mostrada em A mostra muito mais flexibilidade no momento do impacto (linha tracejada vermelhae grandes setas curvas) em comparação com a mostrada em B (setas curvas menores), como as braçadeiras estão mais distantes do local da laminectomia e lesão. A figura C mostra estabilização lateral com o nosso dispositivo descrito com o braço de estabilização bem apertados sob o processo transverso a vértebra em que o local de impacto será executada. Não há flexibilidade da coluna durante este processo, tal como a vértebra de interesse é completamente estabilizado.

Figura 2
Figura 2: NYU / MASCIS pêndulo e recipiente de estabilização personalizado. Figura A mostra as partes e funções do dispositivo de lesão medular NYU / MASCIS, com múltiplas configurações de altura da haste para a gravidade da lesão (no detalhe). Figuras B e C ilustram o recipiente em forma de U que detém arato, e os braços de estabilização serrilhadas que estabilizam de forma segura a coluna vertebral durante a cirurgia e lesão (desenhado e produzido por YP Zhang).

Figura 3
Figura 3: sistema e microadjuster laterais Personalizado montagem no pêndulo NYU / MASCIS Figura A detalha os diferentes componentes do sistema de montagem personalizada para o estabilizador de rato em forma de U para lesão da medula espinhal.. Note-se a microadjuster laterais na figura A, crucial para o alinhamento exacto da medula espinal de rato de lesão. As Figuras B e C fornecem mais descrição do estabilizador sem (B) e com o recipiente em forma de L de rato (C) com respeito à outra importante componentes do dispositivo de lesão (sistema de montagem concebido e produzido pela YP Znão reagir).

Figura 4
Figura 4:. As medições dos componentes individuais do dispositivo de estabilização cirúrgica e anexos Cada componente do sistema de estabilização é costume destacada para mostrar as dimensões e escala (A, C, e D). Braços de estabilização do Tórax (B) são apresentados para mostrar o potencial de aplicação deste dispositivo para uso em diferentes modelos cirúrgicos da coluna vertebral.

Figura 5
Figura 5: marcos cirúrgicos e preparação para a cervical hemi-contusão lesão medular. Figuras A e B retratar os marcos corretos para impa adequadaalinhamento ct na ratos expostos medula espinhal. O ponto de impacto apropriado é directamente entre as raízes dorsais C5 e C6 nervosas (rostral-caudal) e a linha média e bordas laterais da medula espinal (B). As figuras mostram CE, na maior ampliação, o processo de exposição a metade do desejado medula espinhal cervical por lesão, através laminectomy unilateral cuidado. Além disso, as figuras D e E demonstrar a cabo imediatamente antes e após a lesão da medula espinal contusão. Note-se a hemorragia visível (E), causada pelo impacto (seta preta).

Figura 6
Figura 6 :. Exemplos de aceitável contra leituras de dados inaceitáveis ​​seguintes impacto com o pêndulo NYU / MASCIS. O topo do gráfico (A) e conjunto de dados superior (C) (B) e de erro durante a "redução a zero" da haste do pêndulo e ponta sobre a superfície da espinal medula, antes de definir a altura da haste de pêndulo (C). Note-se a um erro considerável indicado para a altura inicial e hora de início da queda de pêndulo, como indicado pela seta vermelha e sublinhado. O software também fornece um aviso de que erro foi detectado por estes parâmetros (parte inferior do painel C).

Discussion

Aqui demonstramos um método de estabilização da coluna cervical para a produção unilateral contundente SCI em C5. Este método de estabilização aumenta a precisão do trauma anatomicamente consistente e produz défices funcionais 13,18. Em outros modelos que dependem de aperto dorsal dos processos espinhosos, o risco de danos processo espinhoso ou desprendimento das pinças da vértebra é muito alta. Estes modelos podem também permitir espinha considerável deslocamento e produzindo a partir da força de contusão e a natureza flexível da coluna e as colunas vertebrais (Figura 1A e B). O tecido rendendo altera o tempo de contato de êmbolo de tecido e resulta em vigor lesão imprevisível (Figura 1A-B e 6B). Nossa estabilização vertebral descrita também proporciona outros benefícios para a preparação cirúrgica: 1) este método estabiliza totalmente as vértebras centrado em C5 sob omicroscópio cirúrgico o que aumenta a precisão de laminectomia (Figura 1C); 2) o animal montado dentro do estabilizador em forma de U pode ser tomado diretamente do local cirúrgico para a fixação de montagem personalizado, o que evita o procedimento de remontar o animal em dispositivos SCI e economiza tempo; e 3) estabilizar as vértebras ao nível da lesão e dorsal e caudal directamente no local pretendido da lesão pode diminuir grandemente o movimento do corpo causadas pela respiração, outra medida para reduzir a variabilidade.

A principal vantagem da utilização deste método de estabilização é a quantidade reduzida de ceder, ou movimento ventral da medula espinal e da coluna após o impacto. Com base em simples física de uma contusão, a força e a energia do impacto irá transferir a partir da haste para a medula espinal, de preferência, com o cabo de absorver esta energia no local de impacto. No entanto, se os rendimentos de coluna sob o cabo, tal como é possívelno método de fixação coluna dorsal (Figura 1A e B), a força real aplicada ao cordão é diminuída e variável, dependendo do grau de rendimento.

Embora este vídeo ilustra todo o processo de um modelo SCI contusão cervical, a essência deste artigo é a introdução do método de estabilização da coluna vertebral que usamos em várias aplicações em nosso laboratório, especificamente para estudos SCI. Uma versão modificada deste dispositivo de estabilização e método tem sido utilizado em ratinhos SCI 23. Este método simples de estabilização da coluna é muito útil para a investigação SCI, e nós já usou este método e equipamento para executar contusão torácica, bem como laceração modelos SCI. Outro laboratório descreveu recentemente uma variação desta forma de estabilização de lesão cervical nesta revista 22. Em resumo, nós apresentamos este novo método de estabilização vertebral para vários Surgical procedimentos para gerar reprodutível SCI experimental variando de laminectomia para produção da lesão. Os benefícios do presente dispositivo de estabilização não se limitam a contusão cervical da medula espinhal, como este método de estabilização foi adaptado para uma vasta variedade de experiências, como injecções intra-espinal, o transplante celular, recolha de CSF da cisterna magna, hemi secção e transecção lesões, lesões contusão torácica, em imagem vivo empregando microscopia de dois fótons, e gravação eletrofisiológico espinhal. A melhoria da qualidade dos procedimentos cirúrgicos e de lesões na medula e reduzir a variabilidade experimental vai ajudar a fornecer informações sobre os verdadeiros mecanismos de lesão e recuperação, e examinar os efeitos das terapias diferentes sobre a doença devastadora da SCI.

Disclosures

Não temos nada a divulgar.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [NS36350, NS52290 e NS50243 para X-MX]; Mari Hulman George Endowment Fund; Estado de Indiana; e um Service Award Ruth L. Kirschstein Nacional de Pesquisa (NRSA) 1F31NS071863 para CLW

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Purdue Products Betadine Surgical Scrub Fisher Scientific 19-027132
Dukal Gauze Sponges Fisher Scientific 22-415-490
Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) Webster Veterinary 07-881-9413, 07-890-5745
Decon Ethanol 200 Proof Fisher Scientific 04-355-450
Artificial Tears Eye Ointment Webster Veterinary 07-870-5261
Antiobiotic Ointment Webster Veterinary 07-877-0876
Cotton Tipped Applicators Fisher Scientific 1006015
Rongeur Fine Science Tools 16000-14
Surigical Scissors Fine Science Tools 15009-08
Scissors (blunt dissection) Fine Science Tools 14040-10
Surgical Retractor Fine Science Tools 17005-04
Large Forceps Fine Science Tools 11024-18
Fine Forceps Fine Science Tools 11223-20
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
Scalpel Fine Science Tools 10003-12
Scalpel Blade #15 Fisher Scientific 10015-00
EZ Clips Fisher Scientific 59027
Sterile sutures Fine Science Tools 12051-10
Instrument Sterilizer Fine Science Tools 14040-10
Surgical Stabilizer Custom Manufactured N/A Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com)
Vertebral Stabilization Bars (clawed endfeet) Custom Manufactured N/A Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com)
NYU/MASCIS Impactor Device Custom Manufactured W. M. Keck Center for Collaborative Neuroscience
Rutgers, The State University of New Jersey
e-mail: impactor@biology.rutgers.edu

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