인간의 피부 생검에서 통각 Intraepidermal 신경 섬유의 3 차원 영상

Medicine

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Summary

고통스러운 신경 병증 (PN)의 통각 intraepidermal 신경 섬유 (IENFs)의 변화를 연구하기 위해, 우리는 직접 통각 IENFs에서 관찰 입체 형태 변화를 검사 할 수 프로토콜을 개발했다. IENFs의 3 차원 분석은 PN에 IENF의 형태 학적 변화를 평가하는 잠재력을 가지고있다.

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Dauch, J. R., Lindblad, C. N., Hayes, J. M., Lentz, S. I., Cheng, H. T. Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies. J. Vis. Exp. (74), e50331, doi:10.3791/50331 (2013).

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Abstract

피부 펀치 생검은 일반적으로 말초 신경 병증 1,2의 진단 intraepidermal 신경 섬유 밀도 (IENFD)을 정량화하는 데 사용됩니다. 현재, 그것은 말초 다리 (DL) 및 길이에 따라 polyneuropathies 3의 평가를위한 근위 허벅지 (PT)에서 3mm 피부 생검을 수집하는 것이 일반적 관행이다. 그러나 IENFs의 다각적 인 특성으로 인해, 2 차원 (2D) 영상의 분석을 통해 신경 구조를 중복 검사하는 도전이다. 또한, 입체 (3D) 영상이 딜레마에 대한 더 나은 솔루션을 제공 할 수 있습니다.

현재 보고서에서, 우리는 고통스러운 신경 병증 (PN)을 연구하는 3D 이미지를 적용하는 방법을 제시한다. IENFs를 확인하기 위해 피부 샘플은 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP), 팬 신경 세포 마커의 면역 형광 분석을 위해 처리됩니다. 현재, 그것은 IENFD을 억제하여 작은 섬유 신경 병증을 진단하는 표준 방법입니다브라이트 현미경 4를 사용하여 PGP의 면역 조직 화학 염색에 의해 채굴. 현재의 연구에서는, 우리는 PGP를 사용하여 총 IENFD를 식별하기 위해 이중 면역 형광 분석을 적용하고, 통각 IENF, 신경 성장 인자 5 (TRK), 높은 친화력 수용체 트로포 마이 오신 수용체 키나제 인식 항체의 사용을 통해. PGP와 TRK 항체 공동 염색 IENF의 장점은 명확 PGP 양성, 통각 섬유를 염색 PN의 연구를 혜택을 제공합니다. 이 형광 신호는 PN과 관련된 IENF의 통각 IENFD 형태 학적 변화를 확인하기 위해 정량화 할 수있다. 형광 이미지는 공 촛점 현미경에 의해 인수 및 3D 분석을 위해 처리됩니다. 3 차원 영상은 더 PN과 관련된 형태 학적 변화를 분석하는 회전 능력을 제공합니다. 함께 촬영, 형광 공동 염색, 공 촛점 이미징 및 3D 분석은 명확 PN​​의 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다.

Introduction

현재, 작은 섬유 신경 병증 3, 6-8를 진단하는 데 사용할 수있는 피부 펀치 생검에서 intraepidermal 신경 섬유 밀도 (IENFD)을 정량화하는 의사에 대한 일반적인 방법입니다. 생검은 말초 다리 (DL), 외측 복사뼈 위 10cm, 그리고 근위부 허벅지 (PT), 전방 장골 척추 9 아래 20cm에서 가져옵니다. 모든 IENF는 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP), 팬의 연결 마커 10-12을 사용하여 레이블이 표시됩니다. 현재, 그것은 표준 사용하여 작은 섬유 신경 병증을 진단하는 방법 브라이트 현미경 6 PGP 염색에 의해 결정 IENFD.입니다 또한 여러 연구 그룹은 PGP 면역 7-9에 대한 면역 형광 프로토콜을 사용했습니다. 작은 섬유 신경 병증은 일반적으로 신경 병증 성 통증과 연관됩니다. 또한 통증 처리를위한 필수 IENF의 역할을 이해하기 위해, 우리는 고통을 생성 섬유와 공동 레이블을 총 IENF하는 기술을 개발했다. Nocicep특히 Aδ TIVE IENF 및 C 섬유는, PGP와 IENF의 공동 레이블과 통각 마커, 트로포 마이 오신 수용체 키나제 A (TRK) 5를 통해 공부하실 수 있습니다. TRK A는 통각의 발전을 위해 필수적인 신경 성장 인자에 대한 높은 친화력 수용체이다. TRK 긍정적 인 통각 신경 섬유는 peptidergic 섬유 것을 표현 물질 P (SP) 및 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드 (CGRP). 이전 로리아와 동료 PN, 10 통각 마커와 협력 라벨 PGP 양성 IENF를 연구하는 두 배 레테르를 붙이는 기술을 적용했다. 우리의 이전 연구에서, 우리는 TRK 양성 IENF하지만 TRK-음 IENF는 고통스러운 당뇨병 성 신경 병증 5의 동물 모델에서 발현이되었다는 것을 보여 주었다. 이 공동 라벨링 기술은 IENFD 및 PN과 관련된 형태 학적 변화를 연구 할 수있는 능력을 합계하는 통각 IENFD의 ​​정량을 비교하는 기능을 제공합니다. 통각 IENF 및 안돼요을 시각화 할 수있는 능력통각 IENFD에 총 IENFD의 ​​재 정량화 PN과 관련된 통증의 정도에 목표 고통의 존재에 대한 증거, 그리고 아마도 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 기술은 또한 동물 모델의 피부에 적용됩니다. 이전의 연구에 비해, 현재의 프로토콜은 2D 이미지 분석에서 발생할 수있는 오류를 방지 할 수있는 기회를 만들고, 3D 이미지 분석을위한 방법을 설명합니다.

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Protocol

부품 번호 : 면역

배경 염색 펀치 피부 생검의 96 - 웰 플레이트 및 예방의 준비는 인간의 과목에서 수집 및 정착액 솔루션에서 12-24 시간 (2 % 0.75 M L-라이신 솔루션 (산도 7.4)와 파라 포름 알데히드와 0.05 mM의 나트륨과 요오드)에 대한 배양하는 4 ° C에서 앞에서 8을 설명했다. 샘플은 다음 다음 설치 미디어를 최적의 절삭 온도 (월), 그라 이오 스탯에 50 μm의 두께 섹션으로 절편에 포함, 최대 1 주일에 대해 4에 20 % 글리세롤 ° C와 생리 식염수 (PBS)를 버퍼 인산염 동결 방지합니다. 아래에서 설명하는 프로토콜은 하나의 96 - 웰 플레이트에서 자유 부동 면역을 받아야 피부 섹션의 최대 수를 가능한 8 피부 섹션을 위해 설계되었습니다.

DAY 1 :

1. 각질층의 비 특정 면역 반응성의 예방

  1. 라벨 96 - 웰 플레이트 그림 1과 같이. 이미지-IT 96 - 웰 플레이트의 행 1에 각 우물에 배경 염색 11,12을 차단하는 효과 FX 신호 (이미지-IT)의 150 μl를 추가합니다.
  2. 96 - 웰 플레이트의 행 2와 3의 각 우물에 1X PBS 150 μl를 추가합니다.
  3. 환자 당 두 개의 50 μm의 섹션을 획득 : DL에서 찍은 생검에서 한 섹션 PT에서 찍은 생검의 한 부분입니다. 접종 루프 (LeLoop)는 형태 학적 손상을 방지하기 위해 다음에 린스 하나에서 섹션을 전송하는 데 사용됩니다. 부드럽게 이미지-IT를 포함,뿐만 행 1의 개인으로, 접종 루프를 사용하여 각 50 μm의 섹션을 전송할 수 있습니다. 플랫 로커에 RT에서 30 분 동안 이미지-IT의 섹션을 품어.
  4. RT에서 10 분 1X PBS (행 2와 3)로 두 번 절을 씻어. 세정과 플랫 로커에 잘 플레이트를 놓습니다.

2. 5 % BSA 차단 솔루션 1 % 세정 용액의 조제

  1. 생검 섹션 이미지-IT에서 배양하는 동안 솔루션을 차단 5 %를 준비TION (5 % BSA가 완전히 용해 될 때까지 BSA, 0.3 % TX-100, 0.1 M PBS-소용돌이 솔루션).
  2. 4 행의 각 우물에 5 % BSA 차단 솔루션 150 μl를 추가합니다.
  3. 접종 루프를 사용하여 5 % BSA 차단 솔루션의 각 우물에 섹션을 전송합니다. 플랫 로커에 1-2 RT의 시간 동안 5 % BSA 차단 솔루션 섹션을 품어.

3. 차 항체의 1 % BSA 세정 용액과 희석의 준비

  1. 섹션 5 % BSA 차단 솔루션 배양하는 동안, 1 % 세정 용액 (1 % BSA, 0.3 % TX-100, 0.1 M PBS-소용돌이 솔루션을 BSA가 완전히 용해 될 때까지) 준비합니다.
  2. 섹션 5 % BSA 차단 솔루션 배양하는 동안, 1 %는 헹굼 용액에 기본 항체를 희석.
    1. 여덟 절 (8 × 150 μL가 = 1,200 μL) 1,200 μL의 총이 필요합니다. 차 항체는 1,500 μL (20 % 추가 볼륨에 대한)에 만들어집니다.
    2. 차 항체의 희석 : PGP, 1:500, TRK,1:500 1 %의 BSA는 솔루션을 세척.

4. 일차 항체의 단면 생검의 배양

  1. 96 - 웰 플레이트의 지정 우물 (5 행)로 희석 일차 항체 150 μl를 추가합니다.
  2. 지정된 일차 항체 우물 (5 행)에 5 % 차단 용액 (4 행)에서 섹션을 전송합니다.
  3. 건조 및 빛의 노출되지 않도록 파라 필름 (parafilm) 및 알루미늄 호일로 96 - 웰 플레이트를 밀봉하십시오.
  4. 플랫 로커에 96 - 웰 플레이트 4에서 O / N ° C를 품어.

DAY 2 :

5. 1 % BSA 세정 용액에 생검을 씻어

  1. 각 행 6도, 7, 8에 1 % BSA 세정 용액 150 μl를 추가합니다.
  2. RT에서 1 시간마다 1 %의 BSA 세정 용액 (행 6, 7, 8)에 절을 세 번 씻어. 세정과 플랫 로커에 알루미늄 호일과 장소에 잘 플레이트를 커버.

6. 차 항체의 희석

<OL>
  • 섹션 (행 8) 1 % BSA 세정 용액의 마지막 헹굼 배양하는 동안, 1 % BSA 세정 용액에 이차 항체를 희석 :
    1. 여덟 절 (8 × 150 μL가 = 1,200 μL) 1,200 μL의 총이 필요합니다. 이차 항체는 1,500 μL (20 % 추가 볼륨에 대한)에 만들어집니다.
    2. 차 항체의 희석 : 1 % BSA 세정 용액의 TRK (알렉사 플 루어 647 당나귀 방지 염소, 1:250)에 대한 PGP (알렉사 플 루어 488 당나귀 안티 - 토끼, 1:250)에 대한.
  • 7. 이차 항체의 단면 생검의 배양

    1. 96 - 웰 플레이트 자신의 지정된 우물 (행 9)에 희석 차 항체 150 μl를 추가합니다.
    2. 잘 이차 항체에 1 % BSA 차단 용액 (행 8) (9 행)에서 섹션을 전송합니다.
    3. 건조 및 빛의 노출되지 않도록 파라 필름 (parafilm) 및 알루미늄 호일로 96 - 웰 플레이트를 밀봉하십시오.
    4. 지정된 이차 항체 O의 섹션을 품어4시 / N ° 플랫 로커에 C.

    8. 1 % BSA 세정 용액에 생검을 씻어

    1. 행 10, 11, 12의 각도에 1 % BSA 세정 용액 150 μl를 추가합니다.
    2. RT에서 1 시간마다 1 %의 BSA 세정 용액 (행 10, 11, 12)에 절을 세 번 씻어. 세정과 플랫 로커에 알루미늄 호일과 장소에 잘 플레이트를 커버.

    9. 현미경 슬라이드 및 설치 단면 생검의 준비

    1. 생검 섹션 1 % BSA 세정 용액 (행 12)의 마지막 헹굼에 배양하는 동안, 현미경 슬라이드를 준비합니다.
    2. 한 번에 하나의 슬라이드에 1 % BSA 세정 용액 50 μl를 놓습니다.
    3. 1 % BSA 세정 용액 (행 12)에서 섹션을 제거하고, 지정된 현미경 슬라이드에 1 % BSA 세정 용액의 50 μL 드롭 놓습니다. 섹션의 위치를​​ 최적화 한 후, 예방 조치, bulbed 유리 피펫과 초과 1 % BSA 세정 용액을 제거시료에 닿지 않도록한다.

    참고 : 섹션에 접혀 있지 않은지 확인하십시오, 표본 현미경 슬라이드의 표면에 평평해야합니다.

    1. 장소 1 하락 현미경 슬라이드에 조직 검사 가까운 DAPI와 시약을 장착 골드 antifade을 연장. 22x22 mm 현미경 유리 coverslip을을 부드럽게 생검에 배치하고의 드롭 DAPI의 드롭 골드 antifade 시약을 연장. 각 섹션에 대해이 단계를 반복합니다.
    2. 어둠 속에서 RT에서 O / N 현미경 슬라이드를 건조 시키십시오.

    참고 : 피펫 팁을 사용하여 공기 방울을 제거합니다. 골드 antifade 시약을 연장 멀리 초과 닦아냅니다.

    파트 B : 공 촛점 이미징

    10. 공 촛점 이미징

    1. 40X 기름 침지 (1.3 NA) 목적 및 FluoView 버전 5.0 소프트웨어와 함께 줌 두 번에 촛점 현미경 스캐닝 올림푸스 FluoView 500 레이저를 사용하여 이미지를 형광 신호. 각각 543 nm의 헬륨 네온 녹색 레이저 633 nm의 헬륨 네온 레드 레이저를 자극하는 알렉사 플 루어 488와 알렉사 플 루어 647을 사용합니다. 알렉사 플 루어 488 신호가 빨간색 LUT에 의해 테이블​​ 위로 녹색보기 (LUT)와 알렉사 플 루어 647으로 표시됩니다.
    2. 신호를 강화하기 위하여 400 μM에서 각각의 검출기 공 촛점 조리개를 설정합니다. 순차적 검사는 신호 분리를 극대화하기 위해 1,024 X 1,024 해상도로 촬영해야합니다.
    3. 칼만 평균화 (두 프레임)와 1.2 μm의 Z-스텝 간격 (FluoView 소프트웨어에 의해 계산 된 최적의 스캔 장치에 따라)를 사용하여 입체 Z 시리즈를 캡처합니다.

    파트 C : 입체 시각화 및 애니메이션

    11. 세 가지 차원 (3D) 시각화 및 애니메이션

    1. Imaris 64 소프트웨어에서 오픈 Fluoview 파일 (버전 7.3, 비트 플레인 AG) 3D 이미지 세트를 시각화합니다.
    2. 조정으로 신경 특정 신호의 선명도를 향상시킬 필요가 표시됩니다.
    3. SU를 생성피부 표피 경계를 시각화 할 수 rface. 경계를 그리려면 그리기 모드에서 윤곽 도구를 사용합니다.
    4. 기본 형광 신호를 확인하기 위해 경계 반투명 표면을 할당합니다.
    5. 3D 영화의 스냅 샷 이미지를 생성하는 3D 형광 신호의 정지 이미지를 캡처합니다.
    6. 3D 영화를 만들기 위해 애니메이션 기능을 사용합니다. 이미지는 (그림 2, 3, 4) 개별적으로 병합 된 각 신호를 표시하는 360도 여러 번 회전 할 수 있습니다. 초당 15 프레임의 애니메이션을 200 프레임으로 구성된 영화를 만들려면 애니메이션을 설정합니다. 원시 AVI 파일로 각각의 동영상을 저장할 수 있습니다.
    7. VirtualDub 프로그램 소프트웨어 (버전 1.9.4)를 사용하여 최종 AVI 동영상을 압축합니다.

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    Representative Results

    우리는 PN 환자에서 PT와 DL 피부 생검에서 IENF의 형태를 연구하는 현재의 프로토콜을 적용했다. 피부는 3 과목에서 PN과 관련된 pathomorphology을 보여 유타 대학에서 수집되었다. 주제는 다음과 같습니다 : 사례 1 : 제 2 형 당뇨병 (: 15 달; 통증 점수 : 지속 시간 51)의 PN의 역사를 가진 51 세 남자 사례 2 : PN의 역사를 가진 56 세 남성 및 사례 3 : 제 2 형 당뇨병 (: 42 달; 통증 점수 : 지속 시간 46)의 PN의 역사를 가진 66 세 남자, 2 형 당뇨병 (:; 47 통증 점수 1백8개월 기간)의. 정량적 감각 검사와 신경 전도 연구 등의 신경 학적 역사와 검사는 말초 신경 병증을 평가하기 위해 수행되었다. 통증 점수는 0-100 시각 아날로그 통증 척도에 따라 결정되었다.

    이 프로토콜을 사용하여, 우리는 인간의 피부에 IENFs (그림 2)의 3 차원 구조를 연구 할 수 있습니다. 그림 2 (그림 3) 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 3에 제시 축삭 부종, 3 차원 영상은 이러한 부종이 IENFs 함께 배포 구형 구조임을 보여줍니다. 또한, 이러한 방법은 IENFs (그림 4)에서 분기 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 4에 제시된 분기를 3 차원 이미지 형태 변경 PN의 존재와 장소를 취할 것을 보여줍니다. 앞에서 설명한대로, 피부 표피 테두리 형태와 방향 신경과 진피와 표피 8 사이의 픽셀 밝기의 차이에 따라 결정되었다. 파란색 그림 2, 3과 추적, 4, 피부 - 표피 접합을 나타냅니다.

    그림 1
    그림 1. 피부 생검 면역을위한 96 - 웰 플레이트에 대한 설정을 나타내는 개략도.

    그림 2. IENF의 3 차원 (3D) 이미지. (A) PGP 양성 IENF의 대표적인 3D 이미지, 통각 IENF (제 360 ° 회전)을 나타내는 빨간색 표시 전체 IENF (최초의 360 ° 회전)와 (B) TRK 양성 IENF을 나타내는 녹색 표시하고, (C ) 사례 1에서 피부 샘플에서 PGP 양성, 통각 IENF을 (제 360 ° 회전) 시연 병합 된 이미지. 바 = 20 μm의. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림3. PN의 IENF의 축삭 부종의 3 차원 (3D) 이미지. 사례 2에서 피부 샘플에 녹색 신호를 PGP로 표시 IENFs 따라 축삭 종창 (화살촉),과 피하 신경 얼기에서 대표적인 3D 이미지입니다. 바 = 10 μm의. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 4. PN의 IENF에서 분기 축삭의 3 차원 (3D) 이미지. 사례 3에서 피부 샘플, 녹색 신호 PGP으로 표시 IENFs 따라 축삭 분기 (화살촉)의 대표적인 3D 이미지. 바 = 20 μm의. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    5 % BSA 차단 솔루션의 구성 요소 : 12.5 ML에 필요한 금액
    1X PBS 8.125 ML
    0.1 % 트리톤 X-100 (TX-100) [최종 농도 : 0.03 %] 3.75 ML
    소 혈청 알부민 (BSA) 0.625 g
    TOTAL 12.5 ML

    표 1. 5 % BSA가 차단 솔루션.

    1 %의 구성 요소는 헹굼 용액 : 12 ML에 필요한 금액
    1X PBS 8.625 ML
    0.1 % TX-100 [최종 농도 : 0.03 %] 3.25 ML
    소 혈청 알부민 (BSA) 0.125 g
    TOTAL 12 ML

    표 2. 1 % BSA가 차단 솔루션.

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    Discussion

    IENFD의 측정은 널리 말초 신경 병증 13,14의 정도를 결정하는 데 사용되었다. 현재 가장 일반적으로 사용되는 프로토콜은 표피의 기저막을 통과 신경 섬유의 밀도를 측정, 그것은 고려 축삭 분기 및 / 또는 신경의 형태 학적 변화를 고려하지 않습니다. 또한, 현재 IENFD 분석 PN 15 고통의 존재와 IENFD 상관 관계를 보여되지 않았습니다.

    우리는 이전에 통각 IENFD의 증가 숫자는 DB / DB 생쥐의 통증 행동, 제 2 형 당뇨병 5의 마우스 모델과 연관되어 있다고보고했다. 해당 보고서에서는 먼저 통각 IENF을 연구하는 이중 면역 형광 프로토콜을 적용했다. 현재의 연구에서는, 우리는 PN 환자에서 인간의 피부에 우리의 프로토콜을 확장합니다. 이중 면역 형광 분석 중재 IENFs의 집합 총 IENF 및 통각 IENF 모두 측정을 제공합니다고통. 이러한 통각 IENF는 TRK 및 기타 통각 신경 펩타이드 5 대부분 긍정적이다. 고통스러운 신경 병증 유사 이중 면역 형광 분석 로리아와 동료 10에 의해 설명되어 있습니다. 그들은보고 고통스러운 신경 병증 환자에서 일시적인 수용체 잠재적 인 양이온 채널 아과 V 멤버 1 (TRPV1)에 대한 IENFD 감소했다. 현재 프로토콜은 우리의 동물 데이터에 근거를 두어 통각 IENFD을 측정하는 다른 방법을 제공 할 수 있습니다.

    현재 프로토콜은 IENF 구조를 연구하는 3D 접근 방식을 제공합니다. 이중 immunofluorecent 분석과 함께, 현재의 프로토콜은 통각 IENFs의 형태를 검사하는 방법을 제공합니다. 이전 연구는 밀도 사이 또는 PN과 통각 IENF의 분기 연결보고하지 않았습니다. 여기, 우리는 축삭 인간의 피부의 IENFs에서 분기 및 부종을 공부하기위한 프로토콜을 보여줍니다. 우리의 3D 분석을 제안하는이 method는 PN의 IENF의 형태 학적 변화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 3D 영상은 2D 이미징과 관련된 중복 구조의 감소 시각화와 관련된 오류를 방지하여 IENFD 측정의 현재의 프로토콜을 향상시킬 수 있습니다.

    축삭 부종은보다 두 번 원래의 축삭 구경 16의 직경 축삭 부분의 확대로 정의됩니다. 이 구조는 축삭 세포 골격과 축삭 수송의 구성 요소 조각이 포함되어 있습니다. 축삭 부종은 축삭 신경 6,16,17의 초기 기능으로 간주됩니다. 그러나 축삭 부종 구조의 3 차원 분석은 문헌에보고되지 않았습니다. 그림 3과 같이, 3D 영상은 PN과 관련된 축삭 부종에 대한 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

    그것은 잘 축삭 분기는 신경 손상 18 회복을 동반하는 것이 특징입니다. 그러나,축삭 분기를 정량화 가능한 방법론은 여전히​​ 2D 영상에 따라 제한됩니다. 그림 4에서 설명한 바와 같이, 축삭 분기가 재생 신경의 고통스러운 성격에 의해 복잡 할 수 있습니다. 따라서, 분기 포인트는 정량의 정확성에 영향을 미칠 근처에있는 신경 섬유에 의해 가려 질 수 있습니다. 우리의 프로토콜의 3 차원 영상 분석은 분기 신경에 대한 자세한 내용은 향상된 시각화를 제공합니다.

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    Disclosures

    관심 없음 충돌 선언하지 않습니다 수 있습니다.

    Acknowledgements

    이 작품은 건강 보조금 국립 연구소에 의해 지원되었다 K08 NS061039-01A2, 신경 연구 및 발견, 미시간 대학의 A. 알프레드 터 브먼 의학 연구소의 프로그램입니다. 이 작품은 형태와 당뇨병과 소화기 및 신장 질환의 국립 연구소의 건강 그랜트 5P90 DK-20572 국립 연구소에 의해 자금 미시간 당뇨병 연구 및 교육 센터의 이미지 분석 코어를 사용했습니다. 저자는 통각 바이오 마커 면역 기술의 초기 개발을 지원하기 위해 인간의 피부 샘플을 자신의 관대 한 기부에 대한 로빈슨 싱글과 고든 스미스 (유타 대학) 감사드립니다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    10X PBS Fisher Scientific BP399-4 To make up 1X PBS
    Image-IT FX Signal Invitrogen I36933 Image-IT
    Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) AbD Serotec 7863-0504 PGP
    Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) R&D Systems AF1056 Trk A
    Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit Invitrogen A21206 AF488 donkey α-goat
    Alexa Fluor 647 donkey α-goat Invitrogen A21447 AF647 donkey α-goat
    Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich A7906-100 BSA
    Triton X- 100 Sigma-Aldrich T9284 TX-100
    Non-calibrated Loop LeLoop MP 199025 inoculating Loop
    96-well assay plate Corning Incorporated 3603 Well plate
    Prolong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36931 DAPI
    Microscope Cover Glass 22x22 mm Fisher Scientific 12-541-B Coverslips
    Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15 Microscope Slides
    Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope Olympus FV500 Confocal Microscope
    Optimum Cutting Temperature Sakura 4583 OCT
    Leica cryostat Leica CM1850 Cryostat

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164, (2), 172-178 (1999).
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