एक उपन्यास

Biology

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Summary

माउस में विकास अध्ययन हमल के दौरान भ्रूण की पहुंच से प्रभावित कर रहे हैं. गर्भ की देर चरणों में भ्रूण दिल की दीर्घकालिक संस्कृति को बढ़ावा देने के लिए, हम excised दिल एक अर्द्ध ठोस, पतला Matrigel में सुसंस्कृत है जिसमें एक प्रोटोकॉल विकसित की है.

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Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart. J. Vis. Exp. (75), e50359, doi:10.3791/50359 (2013).

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Abstract

माउस में विकास अध्ययन हमल के दौरान भ्रूण की पहुंच से प्रभावित कर रहे हैं. इस प्रकार, प्रोटोकॉल को अलग करने और ब्याज की संस्कृति व्यक्ति के अंगों दोनों के विकास में परिवर्तन दृश्यमान करने और अनुमति देने के लिए उपन्यास उपचार रणनीति का एक तरीका प्रदान करने के लिए आवश्यक हैं. गर्भ की देर चरणों में भ्रूण दिल की दीर्घकालिक संस्कृति को बढ़ावा देने के लिए, हम excised दिल एक अर्द्ध ठोस, पतला Matrigel में सुसंस्कृत है जिसमें एक प्रोटोकॉल विकसित की है. इस सब्सट्रेट तीन आयामी संरचना को बनाए रखने का समर्थन पर्याप्त प्रदान करता है, लेकिन निरंतर संकुचन अनुमति देने के लिए काफी लचीला है. संक्षेप में, दिल भ्रूण से excised और ठंड Matrigel के एक मिश्रण में रखा जाता है मध्यम विकास के साथ 1:1 पतला. पतला Matrigel solidifies के बाद, मध्यम विकास संस्कृति पकवान में जोड़ा जाता है. भ्रूण दिन 16.5 के रूप में देर के रूप में excised दिल चार दिनों के बाद विच्छेदन के लिए व्यवहार्य थे. कोरोनरी जाल का विश्लेषण इस विधि नहीं है पता चलता है किकोरोनरी संवहनी विकास को बाधित. इस प्रकार, हम भ्रूण दिल की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तुत करते हैं.

Introduction

हाल के वर्षों में, ट्रांसजेनिक माउस विकास हृदय दोष के अध्ययन के लिए प्रमुख मॉडल व्यवस्था की गई है. हालांकि, इस तरह zebrafish के रूप में अन्य मॉडल जीवों, माउस से अधिक महत्वपूर्ण लाभ है सिद्ध कर दिया है. Zebrafish के तीन प्रमुख लाभ भ्रूण के लिए उपयोग में आसानी के लिए, अंडे की बाहरी बिछाने रहे हैं, हृदय की विकास की आसान दृश्य की अनुमति देता है, जो भ्रूण के ऑप्टिकल पारदर्शिता,, और करने के लिए छोटे आणविक उपचार लागू करने में आसानी भ्रूण के विकास को व्यवस्थित करना 1. इस प्रकार, एक भ्रूण अंग के पूर्व गर्भाशय वृद्धि की अनुमति दी है कि एक संस्कृति तकनीक के विकास के कम से कम भाग में, सीमाओं वर्तमान में ट्रांसजेनिक चूहों में विकास की प्रक्रिया का अध्ययन शोधकर्ताओं द्वारा अनुभवी, बाईपास होगा.

पूर्व vivo हृदय संस्कृति प्रणालियों अलग कैसे के छोटे अणुओं और विश्लेषण के साथ इलाज के लिए अनुमति देते हैं कि लड़की और माउस भ्रूण दोनों में विकसित किया गया हैदिल की अलग क्षेत्रों 2-6 संवाद. पूरे माउस दिल संस्कृति के लिए, दिल भ्रूण को भ्रूण से ऊपर ले लिया (ई) उम्र के 12.5 कमाल 2,3,5 के साथ या बिना संस्कृति के माध्यम में रखा जा सकता है. इस तकनीक का उपयोग करना, भ्रूण दिल सफलतापूर्वक E13.5 की समानक लिए incubated किया गया है, और कमाल के साथ सुसंस्कृत दिल के रूप में लंबे समय से तीन दिन (E10.5 पर शुरू) 3 के रूप में बनाए रखा गया है. हालांकि, कोई पढ़ाई पुराने भ्रूण से दिल की सफल संस्कृति की सूचना दी है. इसी तरह, बचाव प्रयोगों संस्कृति के माध्यम से 2 से विश्व स्तर पर चिकित्सीय एजेंट को लागू करने के लिए सीमित कर दिया गया है.

दिल, excised एम्बेडेड, और एक vibratome का उपयोग sectioned रहे हैं जिसमें एक टुकड़ा संस्कृति प्रणाली, भी इस तरह E12.5 माउस दिल और हैम्बर्गर-हैमिल्टन चरण 36 (लगभग E16 माउस में) लड़की के दिल के रूप में दोनों युवा दिलों के लिए उपयोग किया गया है ऐसे प्रसवोत्तर और वयस्क माउस ज के रूप में 2,4,6, और बड़े दिल,earts और वयस्क मानव मन 7,8. भ्रूण विश्लेषण आम तौर पर 150 माइक्रोन मोटी वर्गों 2,4 का उपयोग किया है, वहीं खंड मोटाई ऑक्सीजन के अभाव 8 के सबूत के बिना एक महान के रूप में 500 माइक्रोन हो सकता है. ये टुकड़ा संस्कृतियों सबसे स्लाइस इस अवधि 9 भर सिकुड़ना बनाए रखने के साथ, संस्कृति में दो महीने के रूप में लंबे समय के रूप में बनाए रखा गया है. पृथक cardiomyocytes में पढ़ाई की तुलना में, इन टुकड़ा संस्कृतियों उनके पड़ोसी प्रकार की कोशिकाओं के साथ cardiomyocytes की सह संस्कृति की अनुमति और पूर्व vivo विश्लेषण के लिए एक उपयोगी तरीका प्रदान करते हैं. हालांकि, इन संस्कृतियों बस संस्कृति के माध्यम में एक दिल (जैसे एक vibratome पर सेक्शनिंग के लिए जीना दिल एम्बेड) रखने की तुलना में अधिक व्यापक सेट अप की आवश्यकता होती है, और किसी भी विश्लेषण स्पष्ट रूप से खंड के भीतर दिल के हिस्से तक सीमित है.

सीमाओं संवर्धन भ्रूण माउस दिल और ट्रांसजेनिक चूहों Ava है के धन के लिए ऊपर वर्णित देखते हुएअध्ययन के लिए ilable, हम वीवर द्वारा विकसित एक पूर्व vivo फेफड़ों संस्कृति व्यवस्था करने के लिए इसी तरह के एक पूर्व vivo माउस दिल संस्कृति प्रणाली विकसित की है, एट अल. 10 हमारी संस्कृति प्रणाली पूरे भ्रूण माउस दिल के भीतर remodeling के कोरोनरी परिसंचरण के दीर्घकालिक संस्कृति और दृश्य परमिट. इसके अलावा, Matrigel का उपयोग इस प्रकार चिकित्सीय एजेंट के साथ एक स्थानीय उपचार उपलब्ध कराने, मोती दिल के पास जगह में आयोजित होने के लिए अनुमति देता है. इन प्रयोगों ऐसे कोरोनरी धमनी गठन के रूप में एक प्रक्रिया पर किसी दिए गए उपचार के प्रभाव की तुलना करने के विभिन्न विकासात्मक समय बिंदुओं पर प्रदर्शन किया जा सकता है. छोटे अणुओं Matrigel के माध्यम से फैलाना सकती है, इस संस्कृति प्रणाली भी विशिष्ट सेल सेल संपर्कों कुछ विकास की प्रक्रिया के लिए आवश्यक या अन्य करने के लिए एक क्षेत्र से पैराक्राइन संकेत है कि क्या कर रहे हैं कि क्या यह निर्धारित करने के लिए एक दूसरे के निकट दिल की संस्कृति विच्छेदित क्षेत्रों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है आवश्यक.

इस संस्कृति प्रणालीअपेक्षाकृत सरल है और, टुकड़ा संस्कृति प्रणाली के विपरीत, मूल संस्कृति अभिकर्मकों और सबसे प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध हैं कि सेट अप का उपयोग करता है. संक्षेप में, excised भ्रूण दिल एक अर्द्ध ठोस समर्थन प्रदान करता है जो पतला Matrigel में सुसंस्कृत हैं. यह समर्थन भी अनुबंध करने के लिए दिल की अनुमति है, जबकि दिल की तीन आयामी आकारिकी बनाए रखने के लिए पर्याप्त है. इस प्रणाली का प्रयोग, पुराने माउस भ्रूण (E14.5-E16.5) से पूरे दिल चार दिनों के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है. पूरे कोरोनरी जाल टुकड़ा संस्कृतियों में विपरीत बनाए रखा है, तो दिल के विभिन्न क्षेत्रों से होती है कि किसी भी संकेत संकेत मौजूद रहना है. इसके अलावा, रहने कक्ष फ्लोरोसेंट रंगों रहते दिल के दृश्य की अनुमति Matrigel तर कर सकते हैं, और प्रोटीन संयुग्मित मोती एक स्थानीय संकेत स्रोत प्रदान करने के लिए दिल के पास रखा जा सकता है. साथ में, इन लाभों को इस तकनीक को गर्भावस्था के दूसरे सप्ताह से 8 वे सप्ताह का बढ़ता हुआ भ्रूण में विकास की प्रक्रिया के अध्ययन के लिए एक आदर्श विधि बनानेआईसी माउस दिल.

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Protocol

1. भ्रूण दिल excising

  1. एक अनुमोदित इच्छामृत्यु तकनीक का उपयोग कर वांछित भ्रूण दिन में एक समय पर गर्भवती माउस euthanize. सभी प्रयोगों के चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
  2. उदारतापूर्वक विच्छेदन से पहले 70% इथेनॉल के साथ महिला स्प्रे. गर्भाशय सींग पुनः प्राप्त करने और उत्पाद शुल्क को महिला के पेट गुहा खोलें.
  3. ठंड 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और जरूरत के रूप में कुल्ला युक्त एक पेट्री डिश में गर्भाशय सींग रखें. संलग्न भ्रूण थैलियों का पर्दाफाश करने के midline के माध्यम से गर्भाशय सींग खोलने कट.
  4. एक भ्रूण थैली खोलने कट और एक भ्रूण निकालते हैं. ठंड पीबीएस के साथ एक दूसरे पेट्री डिश में भ्रूण रखें. बर्फ को गर्भाशय सींग के साथ पेट्री डिश लौटें.
  5. छाती दीवार के लिए उपयोग में सुधार करने के लिए भ्रूण सिर काटना. जीनोटाइपिंग आवश्यक है, तो हटा दें और बर्फ पर रखा एक Eppendorf ट्यूब में पूंछ बचा.
  6. साथअपनी पीठ पर भ्रूण, हृदय और फेफड़ों कल्पना करने के लिए छाती दीवार खुले में कटौती. मंच पर निर्भर करता है, छाती दीवार पारदर्शी हो सकता है.
  7. ध्यान से संदंश का उपयोग दिल उठा और नीचे वाहिकाओं में कटौती. फिर, दिल मुक्त करने के लिए महान वाहिकाओं ऊपर कटौती. यदि आवश्यक हो, बाहरी ऊतकों को हटा दें.
  8. ठंड पीबीएस के साथ भरा एक 24 अच्छी तरह से पकवान की अच्छी तरह से एक में दिल प्लेस और बर्फ पर पकवान जगह है.
  9. दिलों सभी भ्रूण से हटा दिया गया है जब तक पिछले चरण दोहराएँ.

2. संस्कृति सेट अप

  1. एक लामिना हुड में, एक 1:1 के अनुपात में ठंड Matrigel और वांछित संस्कृति मध्यम (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में जैसे 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)) गठबंधन. पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम से नहीं करते हैं.
  2. बर्फ, भी बर्फ पर बनाए रखा है कि एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति डिश के एक कुएं में पतला समाधान के पिपेट 500-1,000 μl पर पतला Matrigel रखते हुए.
  3. हुड में, ध्यान से लेने और excised जगहMatrigel युक्त संस्कृति पकवान की एक अच्छी तरह से में दिल बर्फ पर संस्कृति डिश रखते हुए.
  4. एम्बेडेड दिल के उन्मुखीकरण महत्वपूर्ण है: उदारतापूर्वक 70% इथेनॉल के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप और आसपास के अंतरिक्ष स्प्रे. हुड में, जबकि अभी भी बर्फ पर Matrigel युक्त संस्कृति की थाली के एक कुएं में excised दिल जगह है. फिर, एक माइक्रोस्कोप पर थाली जगह और जल्दी पूरबी excised दिल Matrigel जमना शुरू होता है.
  5. एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (5% सीओ 2) में संस्कृति पकवान प्लेस और Matrigel लगभग 30 मिनट के लिए दृढ़ करने की अनुमति देते हैं.
  6. अच्छी तरह से एक दिल वाले प्रत्येक को 1 मिलीलीटर पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम जोड़ें.
  7. दिल कम से कम चार दिनों के लिए संस्कृति में रह सकते हैं. संस्कृति के माध्यम से हर दो दिन बदलने की सिफारिश की है.

3. फिक्सेशन और दृश्य

  1. अगर वांछित, जी दिल कल्पना करने के लिए (जैसे Syto-16) एक फ्लोरोसेंट रहते सेल डाई जोड़ें. फोटोग्राफी होगीयह एम्बेडेड था जिसमें स्थिति के आधार पर दिख रहा है कि दिल का पक्ष तक ही सीमित.
  2. बाद संवर्धन का विश्लेषण करती है (उदाहरण के लिए पूरे माउंट इमेजिंग या सेक्शनिंग) का प्रदर्शन किया जाएगा, संस्कृति मध्यम हटाने और ठंड 4% formaldehyde के साथ की जगह. 30 मिनट के लिए बर्फ पर पकवान.
  3. ठंड formaldehyde और बर्फ Matrigel के विघटन को बढ़ावा देने के बाद, ताजा formaldehyde के साथ (और Matrigel) लगानेवाला की जगह और 4 में रात दिल डिग्री सेल्सियस तय
  4. 4 डिग्री सेल्सियस तक आगे के विश्लेषण पर बफर (जैसे पीबीएस या Tris) और दुकान के साथ दिलों को धो लें.

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Representative Results

इस तकनीक का उपयोग करना, दिल अपने तीन आयामी आकारिकी रखता है और व्यवहार्य रहता है, के रूप में निरंतर संकुचन (1 मूवी) ने संकेत दिया है. ये संकुचन निलय में से अटरिया में लगातार अधिक प्रमुख हैं. संस्कृति के बाद, दिल तय की और संसाधित विशिष्ट मार्कर अभिव्यक्ति या संरचनाओं की जांच के लिए immunohistochemistry या ऊतक विज्ञान के लिए या तो. चित्रा 1 ए तय, 24 घंटे के लिए संवर्धित किया गया था कि एक भ्रूण माउस दिल की निलय और महान धमनियों के आधार से पता चलता है, और के लिए कार्रवाई की जा सकती अन्तःचूचुक लेबल करने immunohistochemistry. ये confocal micrographs कोरोनरी वाहिका गर्भाशय (चित्रा 1 बी) में रखा गया था कि एक comparably वृद्ध भ्रूण से excised एक दिल के समान प्रतीत होता है कि प्रदर्शित करता है. हालांकि, दिल सुसंस्कृत पूर्व vivo में कोरोनरी वाहिकाओं utero में बनाए रखा गया था कि दिल की तुलना में छोटे दिखाई देते हैं. दोनों दिलों में वें,निलय की ई apices ऊतकों को एंटीबॉडी के बेहतर उपयोग की अनुमति के लिए हटा दिया गया.

4 घ के लिए E16.5 और सुसंस्कृत पूर्व vivo में excised दिलों की hematoxylin और eosin (एच एंड ई) विश्लेषण दर्शाता है कि महान धमनियों की दीवारों (2A चित्रा) और निलय और interventricular सेप्टल मायोकार्डियम (चित्रा 2 बी) के सहित समग्र आकारिकी, दिल बरकरार है. परिसंचरण की कमी के बावजूद, कोरोनरी ओस्टिया (2A चित्रा) स्पष्ट कर रहे हैं. हालांकि, डीएनए विखंडन, एच एंड ई (आंकड़े 2A, 2 बी) और DAPI (नहीं दिखाया डेटा) के साथ दोनों मनाया कॉम्पैक्ट मायोकार्डियम में और महान वाहिकाओं के आसपास स्पष्ट है. पूर्व vivo सुसंस्कृत दिल अभी भी धड़क रहा था, भले ही गर्भाशय (आंकड़े -2 सी, 2 डी) में विकसित किया है कि एक E18.5 भ्रूण से एक दिल के साथ तुलना के रूप में इसके अलावा, मायोकार्डियम कम घना है. इस प्रकार, सीमाओं लंबाई करने के लिए कर रहे हैंके लिए समय या चरण की, जिस पर इन दिलों को बनाए रखा जा सकता है.

इस संस्कृति तकनीक भी fluorescently दिलों संस्कृति में जबकि लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मामले में, दिल एक endothelial विशेष फ्लोरोसेंट डाई के साथ incubated होने के बाद 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत हैं. इस उदाहरण में, दृश्य दिल के उन्मुखीकरण और ऊतक (आंकड़े 3 ए, 3 बी) की अस्पष्टता के आधार पर ही सीमित है. हालांकि, निलय मायोकार्डियम के माध्यम से बाद में ऊतकीय वर्गों इस फ्लोरोसेंट अणु निलय (आंकड़े -3 सी, 3 डी) के भीतर उप एपिकार्डियल वाहिकाओं लेबल करने के लिए बाहरी सेल परतों घुसना कर सकते हैं, इसकी पुष्टि, और इस फ्लोरोसेंट डाई (चित्रा 3 डी) आईएसओ लेक्टिन साथ colocalizes.

चित्रा 1
चित्रा 1. विकास पूर्व vivo परिस्थितियों में सामान्य दिखाई देता है. (ए) संस्कृति में 24 घंटे के बाद, E14.5 भ्रूण से पूर्व vivo दिल, तय किया गया एक endothelial मार्कर (हरा) के साथ लेबल को मंजूरी दे दी, और confocal माइक्रोस्कोपी के साथ imaged. पल्मोनरी धमनी (पीए), महाधमनी (ए ओ), और दिल के आधार दिखाए जाते हैं. (बी) के गर्भ में विकसित कि E15.5 भ्रूण से excised दिल इसी तरह से प्रोसेस किया गया. स्केल बार, 100 माइक्रोन.

चित्रा 2
चित्रा 2. आकृति विज्ञान निहायत पूर्व vivo संस्कृति दौरान बनाए रखा है. (ए, बी) दिल 4 दिनों के लिए E16.5 भ्रूण और सुसंस्कृत पूर्व vivo से हटा रहे थे. दिल hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के साथ फिर sectioned और दाग थे. महाधमनी (ए ओ) और फेफड़े के धमनी (पीए) के संरेखण दिखा (ए) एक अनुप्रस्थ अनुभाग. कोरोनरी ओस्टिया (नोक) से एक दिखाई देता है. मायोकार्डियम सुरगोलाई महाधमनी नियंत्रण (सी) में कम से कम घने है, और कुछ परमाणु विखंडन (तीर) भी मौजूद है. (बी) निलय और interventricular पट (IVS) की कॉम्पैक्ट मायोकार्डियम के समग्र आकारिकी सामान्य दिखाई देता है, लेकिन मायोकार्डियम नियंत्रण (डी) में से कम घना है, और कुछ परमाणु विखंडन (तीर) IVS में स्पष्ट है. (सी, डी) तुलना के लिए, ललाट एच एंड एक E18.5 दिल से ई दाग वर्गों दिखाए जाते हैं. (ग) एक कोरोनरी ostium ए ओ (नोक) से सटे मनाया जाता है. (डी) interventricular पट अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है. स्केल बार, 70 माइक्रोन.

चित्रा 3
से चित्रा 3. पूर्व vivo दिलों fluorescently संस्कृति में 48 घंटे के बाद के दौरान संस्कृति. (ए, बी) लेबल किया जा सकता, पूर्व vivo दिलE16.5 भ्रूण 1 घंटे के लिए Syto 16 (हरा) के साथ incubated रहे थे, और प्रतिदीप्ति ऊष्मायन के बाद 48 घंटे के रूप में देर के रूप में देखा जा सकता है. (सी, डी) इस प्रतिदीप्ति जमी सेक्शनिंग के माध्यम से बनाए रखा गया था और subepicardial उपकला कोशिकाओं में मनाया जा सकता है निलय मायोकार्डियम के भीतर. डी में, निलय मायोकार्डियम भीतर अनुभाग (लाल) आईएसओ लेक्टिन सह के साथ चिह्नित किया गया. आईएसओ लेक्टिन सह लेबल हरी Syto 16 पॉजिटिव कोशिकाओं (तीर) और भी Syto 16 के साथ दाग नहीं थे कि मायोकार्डियम के भीतर जहाजों लेबल. एबी, 4x बढ़ाई, सीडी में पैमाने पर पट्टी, 120 माइक्रोन.

मूवी 1. 30 घंटे के लिए पूर्व vivo संवर्धन के बाद, एक E14.5 भ्रूण से excised एक दिल आलिंद और निलय के बीच लगातार सिकुड़ना और पेसिंग से पता चलता है. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

वर्तमान संस्कृति प्रणाली भ्रूण माउस दिल के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण लाभ बन गया है. इस संस्कृति प्रणाली भी संस्कृति में चार दिनों के बाद, परिगलन की सीमित संकेत के साथ दौरे सिकुड़ना और कोरोनरी जाल, को बरकरार रखता है. इसके अलावा, अर्द्ध ठोस मैट्रिक्स संस्कृति के दौरान जगह में लिपटे मोतियों धारण करने के लिए भी अनुबंध के लिए लचीलेपन की अनुमति और जब विकासशील दिल की तीन आयामी आकारिकी बनाए रखने के लिए समर्थन पर्याप्त प्रदान करता है. इस समर्थन के बावजूद, इस मैट्रिक्स रहते दिल का फ्लोरोसेंट विश्लेषण की अनुमति, ऐसे Syto 16 के रूप में फ्लोरोसेंट रंगों को पारगम्य है.

स्लाइस संस्कृति तरीकों केशिका क्रिया के माध्यम से 7 oxygenation को बनाए रखने के लिए एक हवाई तरल इंटरफेस में एक झरझरा झिल्ली पर, कोरोनरी जाल के अपने हिस्से से युक्त, दिल खंड जगह है. इसके विपरीत, पिछले पूरे दिल संस्कृति तरीकों एक कार्यात्मक कोरोनरी vasculat से पहले भ्रूण उम्र के कमाल और प्रतिबंधित पढ़ाई पर भरोसाउरे 2,3,5 आवश्यक है. कोरोनरी जाल एक हवा तरल इंटरफेस के अतिरिक्त जटिलता के बिना गठन किया गया है के बाद मौजूदा तकनीक का प्रयोग, तथापि, दिल आसानी से संवर्धित किया जा सकता है.

देर भ्रूण दिल (जैसे E16.5) संस्कृति में समय की एक विस्तारित अवधि के बाद परिगलित बन जाएगा कि हमारी चिंताओं के बावजूद, केवल सीमित परिगलन संस्कृति के चार दिन (यानी एक प्रसवोत्तर दिन 1 दिल के समकक्ष) के बाद मनाया गया. मूल प्रोटोकॉल, के रूप में भ्रूण फेफड़ों कलियों का उपयोग किया, 10 पहले मंचन भ्रूण से कोई गल जाना है लेकिन यह भी उपयोग किया फेफड़ों की सूचना दी. इस प्रकार, परिगलन पहले भ्रूण समय अंक के लिए पढ़ाई को सीमित करने से बचा जा सकता है.

इस पूर्व vivo संस्कृति प्रणाली सीमाएँ है. संस्कृति में दो दिनों के बाद, epicardium शुरू होता मैट्रिक्स के प्रसार, और चार दिनों के भीतर, epicardium संस्कृति डिश के लिए देता है. क्योंकि एपिकार्डियल परिणाम हरिणीएस दृश्य को प्रभावित नहीं है, तथापि, इस मुद्दे एपिकार्डियल पढ़ाई के लिए प्राथमिक महत्व का हो सकता है. इस प्रकार, उसके परिणाम कोरोनरी जाल पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है प्रकट नहीं होता है, चरणों में (E14.5-E16.5), epicardium दिल 11 घेर लिया और विकासशील जाल 12 से संकेत प्रदान की लंबे समय के बाद से यहां का विश्लेषण किया. इसके अलावा, संस्कृति में दिल उनके गर्भाशय समकक्षों में तरह बड़ा बढ़ रोकने के लिए दिखाई देते हैं. एक और सीमा भ्रूण माउस दिल zebrafish भ्रूण की तरह पारदर्शी नहीं है. किसी भी जीवित दृश्य इस तरह दिल की बाहरी परत पर देखा जा सकता है क्या करने के लिए सीमित है. हालांकि, एक जीवित endothelial मार्कर पर्याप्त कोरोनरी जाल के कुछ लेबल करने के लिए दिल चूना और संस्कृति में दिखाई दे रहा है सकते हैं.

इन सीमाओं के बावजूद, हम इस पूर्व vivo संस्कृति विधि आवेदनों की एक संख्या के लिए उपयोगी हो सकता है कि आशा. ट्रांसजेनिक चूहों की व्यापक विविधता लाइनों कि कारry के fluorescently लेबल प्रकार की कोशिकाओं को आसानी से समय चूक इमेजिंग का उपयोग विकास के विभिन्न पहलुओं का आकलन किया जा सकता है. इसके अलावा, छोटे आणविक यौगिकों के साथ भ्रूण दिल पूर्व vivo के उपचार, नैदानिक ​​प्रयोग में उपन्यास या पहले से ही पूरा करने के लिए आसान हो सकता है और दवा के उपचारों मानव में लागू कर रहे हैं कि कैसे mimics जाएगा.

अंत में, हम भ्रूण माउस दिल के लिए एक पूर्व vivo संस्कृति विधि ढाल लिया है. इस तकनीक के विकास के दौरान, ऐसे जिगर या गुर्दे के रूप में अन्यथा दुर्गम अंगों में आसानी से प्रवेश की अनुमति होगी और इन अंगों के जोड़ - तोड़ और जीने के विश्लेषण के लिए अनुमति देगा.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgements

हम महत्वपूर्ण पांडुलिपि के पढ़ने और वित्तीय सहायता के लिए एनआईएच (अनुदान # R01HL061656) के लिए एंड्रिया Portbury धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Timed-pregnant mice To be dissected at the embryonic stage of interest
PBS (1x)
DMEM Cellgro
FBS Sigma-Aldrich F2442
Growth factor-reduced Matrigel BD Bioscience 356231
Syto-16 Invitrogen S7578 Used as directed in 13
24-well culture plate Fisher Scientific 07-200-84
EQUIPMENT
Stereoscopic microscope Nikon SMZ645
Cell culture incubator Thermo 3110

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References

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