MBPベースタギング戦略によってMgm101組換えタンパク質の調製

Biology

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Summary

酵母ミトコンドリア核様体タンパク質、Mgm101は、大きなオリゴマーの環を形成するRAD52型組換えタンパク質である。プロトコルは、陽イオン交換およびサイズ​​排除クロマトグラフィーと連結マルトース結合タンパク質(MBP)タギング方式を使用して可溶性組換えMgm101を調製するために記載されている。

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Wang, X., Mbantenkhu, M., Wierzbicki, S., Chen, X. J. Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy. J. Vis. Exp. (76), e50448, doi:10.3791/50448 (2013).

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Abstract

MGM101遺伝子はミトコンドリアDNAの維持におけるその役割のために20年前に同定された。いくつかのグループからの研究がMgm101タンパク質は、ミトコンドリアDNAの組換え修復に関与することが示唆されている。最近の研究は、Mgm101がRAD52型組換えタンパク質ファミリーに関連することが示されている。これらのタンパク質は、大きなオリゴマーの環を形成し、相同な一本鎖DNA分子のアニーリングを促進する。しかし、Mgm101の特徴は、組換えタンパク質を産生することが困難によって妨げられてきた。ここでは、組換えMgm101の調製のための信頼性のある手順を説明する。マルトース結合タンパク質(MBP)タグ付きMgm101は、第大腸菌で発現される。融合タンパク質は、最初アミロースアフ​​ィニティークロマトグラフィーにより精製する。タンパク質分解切断によって放出された後、Mgm101は、陽イオン交換クロマトグラフィーによってMBPから分離される。単分散Mgm101その後、得られたサイズ排除クロマトグラフィーによる。細菌培養のリットルあたりMgm101の〜0.87ミリグラムの収量は日常的に得ることができる。換えMgm101は、DNAの最小の汚染されています。調製したサンプルが正常にMgm101の、生化学的構造及び単粒子像分析のために使用される。このプロトコルは、ミスフォールドおよび細菌細胞に対して毒性することができる他の大きなオリゴマーDNA結合タンパク質の調製のために使用することができる。

Introduction

相同組換えは、二本鎖切断(DSBの)と鎖間架橋の修復のための、および縮小複製フォーク1からDNA複製の再開始のために重要である。従来の相同組換えでは、中央の反応は、原核生物においてRecAタンパク質、及びRad51の1-3および真核生物におけるDMC1含むATP依存性リコンビナーゼにより触媒される。これらのリコンビナーゼは、二本鎖DNAテンプレート( 図1、左パネル)4-7内の相同性検索と鎖侵入を開始するために不可欠である一本鎖DNA上で核タンパク質フィラメントを形成。従来方式に加えて、相同組換えはまたRecA/Rad51-independent方法( 図1、右パネル)で行うことができる。例えば、酵母RAD52とRad59タンパク質は直接二本鎖DNA切断の切除によって公開され、相補鎖DNA鎖のアニーリングを触媒することができます。歌うと呼ばれるこの再結合過程、ル鎖がアニーリング、一般的に相同な二本鎖DNAテンプレートとのペアリングは含まれません。アニール後、異種尾はエキソヌクレアーゼとニックゲノム継続8-10を復元するために連結されることにより除去される。一本鎖アニーリング機構により修復は、しばしば直接繰り返さ地域間のゲノム配列の欠失を伴っている。

RAD52はバクテリオ11の間で普及している組換えタンパク質の多様なグループに属しています。これらのタンパク質はまた、相同な一本鎖DNA分子のアニーリングを促進するそれらの活性に基づいて、一本鎖アニーリングタンパク質(SSAPs)として知られている。最高の特徴バクテリオファージSSAPsはRedβとラクトコッカスファージul36からプロファージRACおよびサックタンパク質からバクテリオファージλとP22、RecTをからErfにある。類似性が事実上undetectですがSSAPsは、構造的、典型的なβ-β-β-α倍によって特徴付けられる彼らの主要なシーケンスでできる。 10彼らは、すべてのフォーム大ホモオリゴマーリング- 体外 12-14 14回対称。この特徴的な高次構造、組織の機能的な意味はよく理解されていない。

私たちは、ミトコンドリアゲノムに相同組換えのメカニズムを理解することに興味を持っています。我々は以前に、サッカロミセス·セレビシエ 15内のmtDNAの維持に必須であるMGM101遺伝子を同定した。MGM101は 、その後、ミトコンドリア核様体と関連することが見出され、DNA損傷剤に対するミトコンドリアの許容16に必要とされる。しかし、Mgm101の研究は、組換えMgm101を生産する難しさによって10年で戻って開催されています。我々は最近、E.から大量に可溶Mgm101を生産することに成功しましたMBP融合戦略を使用して大腸菌 。これは、Mgm101株式を発揮することができましたタンパク質17,18のRAD52-家族と生化学的および構造的類似性。本報告では、三段階精製法は均質Mgm101for生化学的および構造解析します( 図2)を生成し、これに記載されています。

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Protocol

これまでの研究では、Mgm101の最初のアミノ末端22残基がミトコンドリア19へのインポート後に切断されることが示されている。 大腸菌における発現のために、最初の22コドンを欠くMGM101オープンリーディングフレームをPCRで増幅された発現ベクター物pMAL-C2Eの修正版でマルトース結合タンパク質(MBP)をコードする配列の下流に配置された。これは、プレシジョンプロテアーゼ( 図3)のための切断部位を含むリンカーとMBP-Mgm101融合を生成します。プラスミドは、第E.を選択することにより構成されているIPTGおよびXgal白/青選択せずに形質転換体。得られたプラスミド物pMAL-C2E-MGM101その後、E.に導入され、アンピシリンとクロラムフェニコール耐性コロニーを選択することにより、 大腸菌株BL21-CodonPlus(DE3)-RIL。

1。表現、誘導、細胞溶解とのDNase I処理

  1. INOCグルコース(0.2%)、アンピシリン(100μg/mlの/ ml)およびクロラムフェニコール(50μgの/ ml)を添加したLB培地10ml(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl)中に新鮮な形質転換体をulate。 200 rpmで振とうしながら37℃CO / Nでインキュベートする。
  2. 上記のように添加したLB培地を2リットルに10ミリリットルの前培養に接種。 OD 600が 0.5に達するまで振とうしながら37℃で細胞を成長させる。
  3. 0.3mMの最終濃度イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加することによりMBP-Mgm101融合タンパク質の発現を誘導する。 5時間30℃で振とうしながら細胞を育てる。
  4. ベックマンJA-10ローター(5,500×gで、4℃、10分)を使用して、遠心分離により細胞を回収。上清を廃棄した後に、プロテアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液(20mMのトリス-HCl、pHが7.4および1mM EDTA、pH7.4)中(25μMロイペプチン、1μMのペプスタチン及び1mM PMSF)30ml中に細胞ペレットを再懸濁。
  5. 20氷上で細胞懸濁液を超音波処理秒超音波プロセッサ(熱機関;モデルW-385)を用いて50%のデューティサイクルで、30秒間、氷上で冷却し、そして2×繰り返すことができる。
  6. 2 mg / mlのDNアーゼで1株を1 mlを加える。 2時間4℃で細胞溶解物を揺する。
  7. 500mMの最終濃度のNaClを調整します。
  8. 30分間、4℃で10,000×gで遠心分離することにより細胞の破片を取り除きます。

2。アミロースアフ​​ィニティークロマトグラフィーによる精製

  1. 溶解緩衝液中のアミロース樹​​脂を1.5ml(50%スラリー)を平衡化する。細胞ライセートに平衡化アミロース樹​​脂を追加します。 4℃のCO / Nで優しく揺らし
  2. 寒い部屋に設置エコノカラムクロマトグラフィーカラムにライセート樹脂ミックスをロードします。非結合タンパク質は重力によって列を渡すことができます。
  3. 洗浄バッファーI(; 400のNaCl、1mMのEDTA、pHが7.4、および0.2 mMのPMSF、20mMのトリス-HCl、pH7.4)で300mlでアミロース樹​​脂を洗ってください。
  4. 洗浄バッファーII(20mMのT 150mlで洗浄を繰り返し立上り - 塩酸、pHが7.4、NaClが200 mM、1 mMのEDTA、pHは7.4であり、0.2 mMのPMSF)。
  5. カラムに、4℃で10分間インキュベートする、収集溶出緩衝液5mlの(; 200mMのNaClを、図1 mMのEDTA、pHが7.4および0.2 mMのPMSF、10mMのマルトース20mMのトリス-HCl、pHが7.4)を追加もっと回溶出を繰り返し。
  6. 溶出液を組み合わせ、クマシー染色( 図4)に続いて、SDS-PAGEゲル上で溶出液のアリコートをロードすることにより、MBP-Mgm101の収率および純度を決定します。

3。プレシジョンプロテアーゼ切断及び陽イオン交換クロマトグラフィー

  1. MBP-Mgm101溶出液にプレシジョンプロテアーゼの50単位を追加します。 4℃での切断を行うCO / Nし、透析緩衝液に対して透析中継続することができ(20mMのトリス-HCl、pH7.4の、100mMのNaCl、2mMのDTT、1mMのEDTA、pHは7.4であり、0.2 mMのPMSF)
  2. SDS-PAGEゲル( 図5A)の切断の効率を確認してください。
  3. 複数の注入によって切断MBP-Mgm101を読み込むバイオスケールミニマクロプレップハイSカートリッジのイオンは、Bio-Rad社の生物学的DuoFlow FPLCシステムに接続。
  4. 300mMの、5mMの工程の塩勾配を適用することによって、陽イオン交換クロマトグラフィーを開始し、500mMの、混合液(5 mMの塩化ナトリウムによって作成され750mMのNaClを、1,000 mMの、10mMのリン酸ナトリウム、pH7.2の図1 mMのPMSF)とバッファーB(1MのNaCl、10mMのリン酸ナトリウム、pHは7.2、1mMのPMSF)。 0.5ml /分で、流量を設定してください。 Mgm101画分を回収し、SDS-PAGEゲル( 図5B)上のタンパク質の純度を確認してください。

4。サイズ排除クロマトグラフィー

  1. 陽イオン交換クロマトグラフィーからのタンパク質画分を兼ね備えています。 GF平衡緩衝液(; 150mMのNaCl、1mMのEDTA、pH7.4の、5mM 2 - メルカプトエタノール、0.2mMのPMSFを20mM MOPS、pH7.0)中でのタンパク質の透析。
  2. 4℃で3,000 xgで回転させて〜1ミリリットルの容積を減らすためにビバスピン15Rの限外ろ過スピンカラムにタンパク質を集中
  3. Mgm101 OのロードNAはクロマトグラフィバッファー(; 150mMのNaCl、5mMのβ-メルカプトエタノール、1mMのEDTA、pH7.4の、0.2 mMのPMSFを20mM MOPS、pH7.0)で平衡化したスーパーロース6プレップグレードカラムをキャリブレーション。
  4. 0.5ml /分の流速でクロマトグラフィーを実行する緩衝液を用いてサイズ排除を開始する。
  5. 精製Mgm101ピークの画分を集め。タンパク質の最終品質をチェックするための12%SDS-PAGE上の画分のアリコートをロードします。
  6. ビバスピン6タンパク質を集中し、その後速やかに-80℃で液体窒素とストアでサンプルを凍結℃に
  7. 一本鎖DNA結合アッセイ( 図8)および透過型電子顕微鏡( 図9)による構造可視化のための6-12カ月以内にMgm101サンプルを使用。

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Representative Results

Mgm101はミトコンドリアにおけるRAD52関連の組換えタンパク質である。 RAD52が広くミトコンドリアDNA組換え( 図1)におけるその役割のために研究されてきた。組換えMgm101は、3段階の手順( 図2)により調製することができる。これは、Mgm101が可溶型で発現することができ、その後、タンパク質分解的切断( 図3)により、タグから放出MBP-タグ付け戦略の使用によって促進される。

典型的な準備のために、MBP-Mgm101融合の約2〜3 mgのアミロースアフ​​ィニティークロマトグラフィーの後に細菌培養物1リットルから回収することができる。 SDS-PAGEゲル上で、MBP-Mgm101を約70 kDaの( 図4)の主要バンドとして検出される。樹脂が適切に溶出前に洗浄されている場合は他のタンパク質による汚染は最小限に抑えられます。プレシジョンプロテアーゼによる切断後、MBPとMgm101がオンにそれぞれ42キロダルトンと28キロダルトンのバンドとして分離され、表示されますSDS-PAGE( 図5A)。 〜70 kDaのバンドの存在によって示されるように、不完全な消化の場合には、追加のプレシジョンプロテアーゼと拡張消化をお勧めします。

切断されたMBP-Mgm101の陽イオン交換クロマトグラフィーでは、MBPは、塩のアプリケーション( 図6)の前の列で保持されません。通常、Mgm101はMBP( 図5B)で顕著な汚染せずに塩の500mMので溶出する。 300mMのに小さなピークは未切断MBP-Mgm101融合微量に対応する、いつか見える。これは、この画分中Mgm101カラムに結合親和性を低下させる汚染DNAによって結合されることが可能である。従って、陽イオン交換は、DNAの混入を最小にするために必要なステップである。

図7は、サイズ排除クロマトグラフィーによるMgm101精製の ​​最終工程を示す図である。 Mgm101オリゴマーは、一般的に単分散のピークで溶出〜400 kDaで。 Mgm101一部の変異体は、多くの場合、増加V0間サイズ(空隙容量)と400 kDaのピークと見られている。この理由は未だ不明である。 Mgm101のオリゴマー化に影響する変異はV0画分に溶出する凝集体の形成を誘導することができる。しかし、我々は、単量体Mgm101に対応するピークを見たことがない。 Mgm101モノマーは、溶液中で可能性が不安定である。

精製Mgm101は一本鎖DNA( 図8)に高い結合親和性を有する。一本鎖DNAに対する結合親和性は、ゲル上で無料のssDNAの滴定に基づいて推定することができる。 Mgm101/ssDNA複合体は井戸の不十分から移行されます。可能な説明はMgm101が正に帯電し、一本鎖DNAにMgm101の複数のサブユニットの結合電気泳動条件下でタンパク質/ DNA複合体が不動になり、その負電荷を中和されていることです。適切に準備するとき、Mgm101は〜200nmのKdをと一本鎖DNAに結合する。

図9はネガティブ染色透過型電子顕微鏡による精製Mgm101の直接構造可視化を示しています。作りたてMgm101は約20nmの直径を持つ大規模なオリゴマーリングとして主に存在している。その代わりに、高齢Mgm101サンプルは圧縮フィラメントを形成。これらのフィラメントはリングの積み重ねシンプルによって形成されていません。フィラメントにらせんパターンが明らかにありま​​す。フィラメンテーションプロセスを調節する条件は、現在調査中です。これは、タンパク質の品質は、電子顕微鏡で分析される前に高齢者のサンプルについて4℃でのインキュベーション後、SDS-PAGE上でチェックされていることをお勧めします。

図1
RAD52は、カリフォルニア州の組換え部位にRad51のリコンビナーゼの負荷のために仲介者として機能することを示す図1簡略概略図nonical相同組換え経路(左パネル)、およびRad51の(右パネル)の独立したアニーリング一本鎖を推進しています。

図2
図2組換えMgm101の準備のための全体的なスキーム。 Mgm101は、第E.で表現されMBP融合形で大腸菌 。菌体を超音波処理により溶解されています。 DNアーゼIで消化DNAの汚染を低減するために適用される。 MBP-Mgm101融合次いで、アミロースカラムを用いてDNAを除去した溶解物から精製される。タンパク質切断後、Mgm101が解放され、陽イオン交換クロマトグラフィーによってMBPから分離。このステップはさらに、DNAによる汚染を低減することが必要である。溶出した画分をMgm101スーパーロース6プレップグレードカラムに通して均一になるまで精製される。


図3。Mgm101発現プラスミド物pMAL-C2E-MGM101の物理的地図。 MBPとMgm101間プレシジョンプロテアーゼの切断部位が示されています。それぞれ42と28 kDaの分子量を持つタンパク質分解切断利回りMBPとMgm101。

図4
図4アミロースアフィニティークロマトグラフィー後のMBP-Mgm101融合タンパク質の純度を示すSDS-PAGE。タンパク質濃度を280nmの吸光度を測定することによって決定され、Mgm101の約5μgのゲル上にロードされている。ゲルをクマシーブルーで染色されています。

図5 図5 Mgm101のSDS-PAGE分析。プレシジョンプロテアーゼで切断後にMBP-Mgm101融合タンパク質からMgm101のA)リリース。プロテアーゼO / Nで消化した後、タンパク質の約5アンピシリンを含むアリコートをゲル上にロードされます。ゲルをクマシーブルーで染色されています。 Mgm101は、標準的なSDS-PAGEの条件下でタンパク質の全体的な正電荷に起因する28 kDaで、その予想されるサイズよりもわずかに遅い移行されます。 B)陽イオン交換クロマトグラフィーによるMBPから分離後Mgm101。

図6
図6。陽イオン交換クロマトグラフィーによるMBPからMgm101の分離を示すクロマトグラム。切断されたMBP-Mgm101はバイオスケールミニマクロプレップハイSカートリッジを複数回に注入される。 5mMの、300mMの、500mMの、7のステップ塩勾配50 MMとのNaCl 1,000 mMのが適用されます。 larer図を表示するには、ここをクリックしてください

図7
図7。校正済みスーパーロース6プレップグレードカラムでMgm101オリゴマーの溶出プロファイルを示すクロマトグラム。クロマトグラフィーは、0.5ml /分の流速によって行われる。溶出Mgm101は〜400 kDaのピークとして観測される。 V0:ボイドボリューム。 larer図を表示するには、ここをクリックしてください

図8
図8は、一本鎖DNA精製Mgm101に堅牢な結合活性を有することを示す電気泳動移動度シフトアッセイ。 1.25×10 -3 2、1mMのEDTA、pH8.0で、10%グリセロール、1mMのDTT、50μg/mlの/ mlのBSA、1mMのPMSFおよび。 30分間室温でインキュベーション後、試料を6%ネイティブアクリルアミドゲル上にロードされ、4℃で0.5×TBE緩衝液中で実行

図9
図9。フレッシュ(左パネル)の構造的組織を示す電子顕微鏡写真と高齢者(右パネル)Mgm101。ネガティブ染色透過型電子顕微鏡にて200 kVのJEM-2100透過型電子顕微鏡(JEOL)動作を用いて行われる。高齢Mgm101の染色陰性のために、タンパク質は4℃で保存するGFバッファー(20mMリンMOPS、pHは7.0でC; 150mMのNaCl、5mMのβ-メルカプトエタノール、1mMのEDTA、pHが7.4、および0.2 mMのPMSF)、分析される前に4週間。 (博士ステファンウィルキンスの提供)。

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Discussion

これは、Eから安定した、ネイティブ換えMgm101タンパク質を産生するために課題となっている細菌細胞におけるその不溶性が原因の可能性大腸菌 。本稿では、MBP融合戦略はタンパク質が適度に高いレベルで発現されることができることを示している。ネガティブ染色透過型電子顕微鏡およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、我々は以前にMBP-融合タンパク質は、インビトロ 18 均一なオリゴマーを形成することが示されている。それはMgm101のフォールディングおよびオリゴマーはミトコンドリアマトリックスと比べて細菌細胞内に遅くなる可能性があります。 unoligomerized Mgm101はすぐにインビボで毒性である凝集体を形成してもよい。 MBP-タギングは、生産的なオリゴマー化を可能にし、その毒性を減少させる水溶性のコンフォメーションでMgm101を保つかもしれない。

良質Mgm101の調製のための重要な基準は、DNAによる最小限の汚染を持つことである。 280 / 260分の280比がこのレベルを下回っている場合は、DNアーゼと拡張消化は私がお勧めします。将来的には、S1ヌクレアーゼおよびRNアーゼによる消化は、さらに、核酸を汚染低減することができるかどうかを見るために有用であり得る。

我々は以前4でMgm101のそのストレージを示している°数週間のためにCは長いらせんフィラメント17の形成を誘導する。フィラメント形成のメカニズムはよく理解されていない。過フィラメントは、タンパク質の溶解性に影響を与えます。したがって、それは強く作りたてMgm101タンパク質のアリコートを迅速に-80℃で保管が続く液体窒素中で凍結されていることをお勧めします℃のタンパク質のDNA結合活性は、ストレージ、uの6​​-12ヶ月後に変更されないままこれらの条件をNDER。

このプロトコルはまたMgm101の変異体タンパク質を調製するために使用することができる。オリゴマー化状態とMgm101の安定性は、しばしば突然変異によって影響を受ける。軽度の変異はMBPから切断時の精製タンパク質の部分的な降水量を引き起こす可能性があります。これらのケースでは、図6リットルの培養液量を増やすと、サイズ排除クロマトグラフィーから安定した精製タンパク質の十分な収率を可能にすることができる。オリゴマー化に影響を与える深刻な変異は、MBP融合形で​​タンパク質の生産を可能にするかもしれませんが、タンパク質は、MBPを除去した後に安定しないことがあります。

要約すると、現在のプロトコルは、E.の大きなMgm101オリゴマーリングの高レベルの発現を可能にする信頼性が高い大腸菌 。このプロトコルは、これらのタンパク質の溶解度が細菌細胞が低い場合は特に、Mgm101オルソログ20,21およびその他のオリゴマータンパク質の産生に適合させることができる。

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Disclosures

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

Acknowledgments

私たちは、透過型電子顕微鏡で助けステファンウィルキンスに感謝。この作品は、健康グラントR01AG023731の国立研究所によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expression vector pMAL-c2E New England Biolabs #N8066S
PreScission Protease GE Healthcare Life Sciences #27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells Strategene #230245
Leupeptin Roche Applied Science #11034626001
Pepstatin Roche Applied Science #11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Applied Science #10837091001
DNAse I Sigma #DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roche Applied Science #11411446001
Amylose resin New England Biolabs #E8021L
Econo-Column chromatography column BIO-RAD #7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) BIO-RAD #732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS15RH02
Superose 6 prep grade column Amersham Bioscirnces #17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS0611

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References

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