成年小鼠静脉高压型号:颈总动脉,以颈外静脉吻合。

1Department of Anesthesia and Perioperative Care and Center for Cerebrovascular Research, University of California, San Francisco, 2Department of Neurological Surgery, University of California, San Francisco, 3Department of Neurology, University of California, San Francisco
Medicine

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Summary

我们描述了在成年小鼠产生的脑静脉高血压可靠的模型的方法。该模型已被广泛描述和试验的大鼠。在小鼠中这个新的对应打开利用遗传修饰的动物的可能性,从而拓宽了该模型的应用程序。

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Yang, S. T., Rodriguez-Hernandez, A., Walker, E. J., Young, W. L., Su, H., Lawton, M. T. Adult Mouse Venous Hypertension Model: Common Carotid Artery to External Jugular Vein Anastomosis.. J. Vis. Exp. (95), e50472, doi:10.3791/50472 (2015).

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Abstract

脑动静脉畸形和动静脉瘘的病理生理的认识有了提高得益于动物模型。大鼠模型创建颈总动脉(CCA)和外部颈静脉(合资企业)之间的人工瘘已被广泛描述和证明了在技术上是可行的。该构建激起一个一致脑静脉高血压(CVH),因此,已帮助学习静脉高压,以形成,临床症状,和脑动静脉畸形和硬脑膜动静脉瘘的预后的贡献。相当于小鼠模型已经只有很少描述和证明与瘘管狭窄的麻烦。一个既定的小鼠模型将允许不仅病理生理学的研究,但也是潜在的基因疗法,这些脑血管疾病。

我们提出的动静脉瘘的模型,产生一个持久的颅内静脉高​​血压的鼠标。显微外科吻合术Øf显示鼠CCA和合资企业可以是困难的,因为小型的解剖学和经常导致非专利瘘。在该步骤中的分步协议中,我们解决所有在此过程中所遇到的重大挑战。在曝光过程中避免了静脉过度内陷,用11-0缝线,而不是10-0,并作出精心策划端侧吻合是一些关键步骤。虽然这种方法需要先进的显微技术和其等效在大鼠,可以一致地开发了一种更长的学习曲线。

这种新颖的模型已被设计为转基因小鼠技术结合起来已经证明,研究脑动静脉畸形和硬脑膜动静脉瘘有用一个预先既定的实验系统。通过打开使用的转基因小鼠的可能性,有效模型的一个更广泛,可以实现和遗传治疗也可进行测试。该实验的构建体也可以被进一步适配以OT的研究她静脉高压,如偏头痛,短暂性失忆,瞬态单眼失明相关的脑血管疾病

Introduction

脑静脉高压动物模型已被证明是脑动静脉畸形和动静脉瘘1-7的病理生理的认识的重要工具。最广泛使用的是通过颈总动脉(CCA)和颈外静脉(合资企业),这引发了一致脑静脉高血压(CVH)在大鼠1,8-10之间的人工瘘创建的大鼠模型。相当于小鼠模型,通过打开使用转基因小鼠品系不同的可能性,将允许不仅病理生理学,但也是潜在的基因疗法,这些脑血管疾病的进一步研究。此外,实验结构还可以进一步适应于与静脉压增高,如偏头痛,短暂性失忆,瞬态单眼失明 11然而,以前的尝试相关的其他脑血管疾病的研究,构建这些小鼠模型ħAVE展示与瘘管通畅的困难,由于身材矮小的解剖5,12。在这里,我们描述一步一步的协议,用于小鼠CCA和合资企业的转化为长期的专利瘘和鼠标耐用静脉高压的成功吻合。

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Protocol

1.准备鼠标

  1. 诱发全身麻醉的小鼠异氟醚气。注0.15毫升腹腔brupenorphine的疼痛管理。在开始之前,检查麻醉水平通过刺老鼠的爪子令人满意。
  2. 把鼠标在背卧与四肢固定胶带。除去颈部的头发和用剪刀上胸部。通过皮下注射,辖0.2-0.4毫升0.9%盐水中,以保持鼠标的外科手术过程中水合。
  3. 准备手术视野下了严格的消毒方法。的皮肤切口的面积应为90%的醇进行清洗。

2.解剖颈总动脉和颈外静脉

  1. 使整个鼠标的下颈部区域的水平中线颈切口。深化伤口后,用在提升唾液腺及颈部软组织raction缝合( 图1)。暴露右侧颈外静脉(EJV)横向到胸锁乳突肌(SCM)。这一步应该在显微镜下进行,因为过度牵拉过静脉可能会损坏,并诱导其血栓形成。
  2. 小心地从锁骨到颅底解剖沿其课程的权利合资企业。通常电双极钳,凝聚和分裂的任何分支机构,准备了充足的长度为后来的临时安置夹子吻合。
  3. 外侧到气管和内侧到SCM,探索颈总动脉(CCA)。它应该从锁骨小心接触到刚超过其分叉成外部和内部颈动脉。在此步骤期间,应注意再次给予,以避免过度牵引到合资企业可能购买损害吻合的通畅。

3.准备吻合

  1. 结扎CCA与10-0尹恩惠LON刚好接近其分叉。接着,应用一个临时剪辑在近端CCA尽可能靠近锁骨越好。
  2. 一旦流已经被中断,横切动脉正下方分叉结扎并用盐水灌溉它洗出任何残留的血液的管腔内。避免双极电凝在这个步骤中,由于热损伤动脉壁可以把将来吻合处于危险之中。
  3. 为了提高合资企业的边缘的可见性,内侧壁标有沿计划venotomy的过程中一个蓝色标记笔。一旦合资企业被标记,用10-0缝线结扎前端作为尾尽可能和应用上的近端颅尽可能临时血管夹。
  4. 用细地下30针0.5毫升注射器,使最初的光圈在合资企业的标志区,并立即灌溉管腔用生理盐水,避免血栓形成。接下来,延长与microscissors的venotomy直到该长度是CCA约2-3倍的直径。避免剧烈拉伸,注意保持锋利,整洁的前沿。
  5. 近似​​CCA的结束合资企业。使侧切切口CCA的施主端与直径调整到长度与venotomy大小( 图2)。

4.终端侧吻合

  1. 用11-0尼龙单丝缝合的CCA到EJV端侧吻合。缝合内侧壁吻合的craneo脚方向是初始步骤。每一针应放在从外到内的静脉壁的第一( 图3),并从内到外的动脉壁( 图4)下一个。这将保持结上的吻合血管的时刻( 图5)的外表面。任一间断或连续的缝合线都可以使用,但所有的连续的缝合线应紧固作为最终步骤。
  2. ØNCE内侧墙已被缝合,从尾重复该过程颅与侧壁。现在每一个线迹应放在从外到内的动脉壁的第一和从内到外的静脉壁旁边。生理盐水冲洗将有助于在手术过程中保持在任何时候都可见吻合的管腔。
  3. 在完成吻合的所有步骤之后,第一个和下一个从动脉除去从静脉临时剪辑。动脉血液会流入合资企业没有或很少渗出从吻合(见视频VH模式和VH模式2)。最小的出血应该停止不使用棉花的压缩比吻合。这必须避免,以防止微妙静脉血栓形成。
  4. 一旦搏动流经吻合确认并没有明显的出血观察,灌溉手术区域用盐水和用6-0尼龙缝线闭合颈切口。最后,管理0.15毫升更多intrap的eritoneal brupenorphine术后疼痛管理和0.2-0.4毫升皮下0.9%盐水的手术过程中,以补充任何血液损失。

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Representative Results

该模型的一个成功的结果是一个专利动静脉瘘诱导静脉高压在小鼠大脑。为了验证该模型,我们最初测定小鼠的矢状窦的颅内静脉压力在2,3和4周后手术。 6种不同的小鼠被分配到每一个时间组。窦的压力为8.8±1.2毫米汞柱的组中测得的两个星期后手术。在手术后第3周测量的6只小鼠中,鼻窦压为4.7±1.4毫米汞柱。最后,将6只小鼠测定4周手术具有3.9±0.6毫米汞柱( 图6)一窦压力后。术后2周窦压力比在3周和4周窦压(二者P <0.001)显著高。

然而,为了测量窦压力所需要的复杂的技术是没有必要的,以确保定期瘘通畅和静脉高血压。相反,所期望的结果可以是c由瘘口直接检查,并在小鼠静脉高压症的临床症状hecked。

瘘管的通畅可通过两种方法来直接检查在外科手术过程的末尾。第一个由临时阻碍EJV颅到ana​​stomsis面积珠宝商的镊子。这一点现在是血液从CCA未来的唯一外流。如果端 - 侧吻合术是专利中,可扩张合资企业将立即气球出如图所示的通畅测试视频1的第二种方法是通过阻断静脉移植远端吻合并缓慢排空,或“挤奶”,它执行一对珠宝商的镊子。图所示,对于通畅试验第二视频,一旦闭塞被释放时,一个专利吻合应该迅速重新填充空段。

如果该模型是工作,鼠标眼的扩大应指出在手术后24小时。此马y为因头部和颈部由静脉引流。虽然手术后双眼得到放大,这种现象是在被操作侧更突出的如在图7中观察到。

图1
图1:皮肤切口横跨鼠标和唾液腺的软牵引的下颈部区域A的水平中线颈切口暴露右颈外静脉(合资企业)。请注意,值得细细切开皮肤,以防止任何伤害娇嫩的静脉EJV的位置表浅。

图2
图2:准备吻合的内侧壁的合资企业已经标有沿计划venotomy的过程中,以蓝线。 A面切INCI锡永在CCA的供体端进行到动脉的直径调整到长度与venotomy。

图3
图3:由外而内的内侧壁吻合被缝合在craneo脚方向与线圈11-0第一置于从外到内的静脉壁。

图4
图4:由内而外的针此处从动从内到外的动脉壁以完成缝合在内侧壁上以适当的方式,以保持结上的吻合的外表面。

图5
图5:保持外结豪注意瓦特选择在这种情况下,被中断的缝合线的结停留在血管的内腔中,以避免血栓形成,将闭塞瘘管外面。

图6
图6:窦压力分析此巴特图表以图形方式显示在2,3和4周后手术测定毫米汞柱颅内静脉窦的压力差。

图7
图7:在手术后眼球突出一天,双眼被放大,但右眼放大(同侧手术)更突出。

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Discussion

持续脑静脉高血压已密切相关的更严重的临床表现及预后差的患者硬脑膜动静脉瘘和脑动静脉畸形3。 CVH这些作用已被广泛研究在大鼠模型1,2,8。在鼠标的等效模型将允许使用转基因动物这将最终允许参与对静脉高压的发病机制及其与硬脑膜动静脉瘘,脑动静脉畸形的关系分子途径的分析。

这里,我们报告用于通过终端到侧颈颈静脉瘘创建在成年小鼠脑静脉高血压的方法。这种新的模型通过其转换成鼠标和由此允许调查分子途径和基因疗法的上述可能性增强了大鼠的充分描述颈颈静脉瘘的模型。

遇到的常见问题及建议

另一种常见的亲blem被破坏与过度牵拉,压迫,或夹层沿其当然的静脉。因此,合资企业曝光必须小心地在显微镜下进行的,以确定夹层的合适平面。所有的小分支排入还应当确定和凝固。这将避免不受控制的出血,需要静脉的压缩,并提供足够的冗余,以避免过大的张力。

这并非罕见移除临时剪辑后具有瘘功能差。在这种情况下,第一个步骤应该是寻找在CCA紧张或成角的可能点。动脉或胸锁乳突肌部分切除的进一步解剖将解决这个问题。然而,如果功能差继续这些演习之后,吻合部位的血栓形成,必须怀疑。在这种情况下,代替重新打开吻合部位并除去血栓的,我们建议在执行一个新的吻合颅前一个。根据我们的经验,第三吻合是不可能的。没有足够的长度EJV和鼠标不耐受麻醉的时间这么长的时间。

该技术的局限性

该技术的主要限制包括:(1)血管的身材矮小解剖学需要先进的显微技术和比对在大鼠的等效模型更长的学习曲线; (2)吻合的通畅通常由血栓形成和鼠标合资企业的长度受到损害将只允许一个额外的试图解决这个问题;及(3)外科手术可能需要长达三个小时,暴露鼠标长麻醉期间。然而,随着技术的建议上面提出并保持鼠标温暖和水合的过程中,专利CCA到合资企业可以成功地执行,并且在我们的经验取得的动物的成活率高。

在小鼠中建立了可靠而耐用的脑静脉高血压模型是可以服务于脑研究13-16的用途广泛的数字的一个重要工具。加入转基因小鼠的基因敲除技术,这种新的模式应该进一步促进基因相关的体内研究所有的脑静脉高血压相关的病症。

此前,其他作者所描述的大鼠静脉高压模型,并用它来 ​​研究硬脑膜动静脉瘘,脑动静脉畸形4,5,8,9的病理生理学。现在我们描述的方法来成功地把这种同一模型的小鼠,因此开放其潜在的应用,以各种基因治疗试验。

结论

我们在这里展示的协议,实现了专利CCA到EJV吻合的成年小鼠。这瘘提供持久的脑静脉压增高已是一个有用的工具来开发不同的脑血管疾病模型大鼠。通过提供该初始步骤来开发这些相同的模型中的小鼠中,我们打开测试遗传治疗那些脑血管疾病的可能性。

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Disclosures

实验程序,实验动物批准了加州大学的机构动物护理和使用委员会,旧金山分校(UCSF)。

作者有没有潜在的利益有关此过程中使用的药物和物质的冲突。

Acknowledgements

该项目由美国国立卫生研究院T32 GM008440到埃斯彭·沃克,R01 NS27713威廉L.Young,P01 NS44155威廉L.Young和华缩,R21 NS070153华SU和美国心脏协会AHA 10GRNT3130004到华苏部分支持。医生安娜·罗德里格斯·埃尔南德斯从“OBRA社会的La Caixa银行”支持赠款

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-0 Sterile Microsuture Arosurgical Ic. VT5A010Q10
11-0 Sterile Microsuture Arosurgical Ic VT4A00N07
DUROTIP Scissors Aesculap BC210R
Micro-Adson Tissue Forceps Aesculap BD510R
Microscissors Aesculap OC496R
Micro Forceps #5 Jewelers Aesculap BD331R
Angled Jewelers Forceps Aesculap BD329R
Micro Suture Forceps Aesculap BD338R
DUROGRIP Needle Holder Aesculap BM009R

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