Измерение Ослабление натяжения в процессе лазерного поражения Индуцированные Axon для оценки аксонов адгезию к основанию и Piconewton в миллисекундах

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы измеряли напряжение выпуска в аксон, который был частично поврежденных с помощью лазера рассекатель одновременное измерение силовой спектроскопии проводили на оптически-ловушки зонд приклеен к мембране аксона. Разработанный экспериментальный протокол оценивает аксон адгезию к культуральной подложки.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vassalli, M., Basso, M., Difato, F. Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution. J. Vis. Exp. (75), e50477, doi:10.3791/50477 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Формирование функциональных соединений в разработке нейронной сети зависит от внешних сигналов. Нейрита роста развивающихся нейронов подлежит химической и механической сигналов и механизмы, с помощью которых он чувствует и реагирует на механические сигналы плохо изучены. Выяснения роли силы в камере созревания позволит конструкции каркасов, которые могут способствовать клеточной адгезии и цитоскелета связи с подложкой, и, следовательно, улучшить способность различных типов нейронов к регенерации после травмы.

Здесь мы опишем метод применять одновременные измерения силовой спектроскопии при лазерном клетки, вызванное поражением. Мы измеряем снимающее напряжение в частично поврежденных аксонов одновременным интерферометрическом отслеживания оптической ловушке зонда придерживался мембране аксона. Наш экспериментальный протокол определяет снимающее напряжение с чувствительностью piconewton и динамика ослабления натяжения намиллисекунду временным разрешением. Поэтому оно предлагает высокое разрешение способ изучить, как механическая связь между клетками и субстраты могут быть модулированы по фармакологическому лечению и / или различные механические свойства подложки.

Introduction

Оптическая микроскопия является одним из менее инвазивных система визуализации доступны для наблюдения живых клеток. С эксплуатацией эффекты, такие как давление излучения (как в оптических пинцетов 1), или высокой энергии потока фотонов (как в лазерных диссекторе 2), эта технология была распространена на нано-манипуляции. Оптической системы дает точного контроля для визуализации и управления суб клеточных мишеней 3. В то же время, благодаря точной калибровки поставляемых мощности лазера и оптических инструментов достижения мягкой или инвазивные манипуляции образца с беспрецедентной воспроизводимости.

Несколько лабораторий интегрированы в той же экспериментальной установке, оптических пинцетов и лазерной рассекатель для того, чтобы удалять органелл 4, соединить вместе различные ячейки 5, или стимулировать клетки оптически приводом грузов 6,7. В то время как оптический пинцет, после калибровки оптического жесткость, позволяютконтроль приложенной силы к ячейке по шкале piconewton, лазерных систем вскрытия может модулировать оптическое манипулирование, которое колеблется от мембраны фото-порации абляции одной органеллы или рассечение субклеточных структур. Однако, лазерное рассечение калибровки опирается на качественную оценку субъекта оптическое манипулирование по отношению к энергии, подводимой к образцу, в основном на основе анализа изображений иллюстрирующие морфологические изменения, вызванные к образцу 8. В предложенном методе, мы покажем, как выполнить силовой спектроскопии измерения в течение лазерного рассечения аксональное развивающихся нейронов, в количественном выражении, по шкале piconewton, сила, создаваемая измененное равновесие в структуре цитоскелета субклеточном камеры 9. Искусственный нейронов прилипать к подложке, и поляризации в процессе разработки. Поляризации фазы происходит в течение первых пяти дней в пробирке. На втором этапе поляризации, одна из extrudния нейритов становится больше, и она будет дифференцироваться, чтобы стать аксона 10. Удлинение аксонов в ответ на силу буксировки на конус роста ранее моделируется модель Dennerl 11. В последнее время эта модель была расширена, чтобы включить 12 роль нейритов адгезию к внеклеточной матричных субстратов. Это биофизические модели, предложен после экспериментальных наблюдений 13, показал, что тяговое усилие на конус роста, распространяющихся вдоль аксонов, которые модулируются фокальные адгезии к подложке. Кроме того, поражение аксональное производит местный снятие напряжения, продвигаясь к телу клетки. Таким образом, мы предположили, что такие измерения напряженности выпустили в месте, вдоль аксона между поражением и клетка сома дает возможность оценить увлажняющего результат влияет фокальные адгезии.

Мы калибровку необходимой энергией фотонов потока лазерного диссекторе контролировать степень нанесенного аксональное повреждающихе, от полной перерезки частичного поражения. После калибровки, мы повторили частичного поражения в аксонах несколько дифференциации нейронов и разработали протокол для количественной оценки напряжения выпуска, и полученные таким образом количественный параметр для оценки адгезии аксон к подложке 14.

В настоящей работе мы подробно разработанный протокол, который представляет собой точную экспериментальную методику для оценки и сравнения с чувствительностью piconewton аксонов адгезию к подложке в различных экспериментальных условиях, таких как химическая обработка 14, или различные типы клеточных поддержки культуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Оптическая схема

Вся оптическая система была описана ранее 15. Кратко, оптическая система пинцетом основана на иттербия непрерывной волны (CW) операционной волоконным лазером на длине волны 1064 нм (IPG Laser GmbH). Пространственный модулятор света (ПМС) (LCOS-SLM, модель X10468-07 - Hamamatsu) изменяется фаза входящих ИК лазерный луч для управления положением захвата точка фокусировки на чашку для культивирования при компьютером голограммы. Свободном доступе Blue-пинцет программного обеспечения (веб-ссылка на оборудовании таблицу) синтезированных голограмм проецируется на пространственный модулятор света. Интерферометр для измерения силовой спектроскопии была основана на четырехквадрантные фотодиод (QPD, S5980 с 6041 C5460SPL доске - Хамамацу) и фотодиод (PD, PDA100A-EC - Thorlabs).

Лазерный источник рассечение было импульсным субнаносекундном УФ Nd: YAG лазера на длине волны 355 нм (ПНВ-001525-040, Powerchip нано-Pulse УФ лазер - Teem Photonics). Акусто-модулятор (MQ110-A3-УФ, 355 нм плавленый кварц-AA-Оптико-электронные), контролируемые мощности УФ лазерной переданной образцу.

Голографического оптического пинцета и лазерных микро-диссекторе были интегрированы на модифицированном прямой микроскоп (BX51 - Olympus), оснащенных 60X, 0.9 NA водным погружением objective.The столик микроскопа состоит из 3-осевая линейная двигатель постоянного тока микро-позиционирование системы (M-126.CG1, физика-Instruments), перевозящих отдельные 3-осевой пьезоэлектрических нано-позиционирования этап (P-733.3DD, физика-Instruments), чтобы объединить грубой перемещение образца с суб-нанометровым разрешением пьезо- стадии. Система столике микроскопа был оснащен двумя контуров управления синергически, направленные на сохранение захвата точечной фокусировки в нужное положение, в зависимости от выбранного режима работы (должность или усилие смыкания, статический или динамический) 16. В частности, внутренний контур обратной связи воздействует на пьезоэлектрический этапе сохранить шарик на выборЭд расстояние от центра ловушки. Другой внешний контур управляет положением платформа автоматизированного использовать регион, натянутое на пьезоэлектрический привод на большей площади, чем имеющиеся у него инсульт 17. Когда пьезоэлектрический стадии достигает предела доступных хода в одном направлении, внешний контур перемещается микро этап в противоположном направлении, при этом пьезоэлектрический восстанавливается к его центральному положению, поскольку она отслеживания бусинка ловушке приклеен к образцу. Когда пьезоэлектрические этапе достигает центрального положения своего курса диапазона, микро этапе остановилась. Более подробная информация о системе приведены в Guiggiani др. 16,17.

Устройство Пельтье (QE1 резистивного нагрева с TC-344B двойной контроллер нагревателя канал - Warner Instruments) контролирует температуру культуре клеток под микроскопом (37 ° C). В культуре, рН и влажность поддерживают на уровне физиологических условиях путем проветривания специально разработанный полидиметилсилоксановых (PDMS) Втулка (интеграции объектива микроскопа) увлажненным карбогена (95% O 2, 5% СО 2).

2. Подготовка клеточной культуры

Все экспериментальные протоколы были одобрены итальянским министерством здравоохранения. Первичные культуры были получены из гиппокампа мышей (C57BL6J, Charles River) на эмбриональный день 18 (E18).

  1. Нейроны высевали при концентрации 25000 клеток / мл на стеклянным дном чашки Петри (P35G-0-14-C - Matek Corporation). Низкая концентрация культивируемые клетки необходимо, чтобы избежать образования густой сети уже в первые дни в пробирке. В указанной концентрации клеток, вероятность нахождения изолированных клеток с аксонами больше не подключен к другим клеткам гораздо выше.

3. Покрытие бисера

  1. Полимер микросфер (диаметр 4 мкм, СООН-концевой Bangs лаборатории, код продукта PC05N/6700) покрывали поли-D-лизином по методике, описанной в белка polyLink Муфта Kit (Polysciences, код продукта 19539). Гранулы покрывают той же молекуле использоваться для покрытия поддержки культуры и адгезия пользу клеток.

4. Выберите изолированного нейрона. Снимите бисера от культурального субстрата, ловушку и переместите его рядом с Neuron

  1. Поставьте блюдо культуры Петри на столик микроскопа. После установки фокуса на образце этапе движения, корректировать положение освещающего конденсатор целью установить Колер освещения. Выравнивание освещенности оптики установить Kolher-освещения условие является необходимым для улучшения качества изображения яркие области. Использование таких условий выравнивания, необходимо также, чтобы максимизировать сбор ИК КПД лазера (через объектив конденсатора), от рассеивающего ловушке зонда, для выполнения своих интерферометрический слежения по QPD и PD.
  2. Пипетки несколько мкл покрытых раствора микросфер вк культуре блюдо. Микросферы сдаст и придерживаться культуры подложке. Количество мкл вводили в культуральную чашку зависит от микросфер концентрации маточного раствора. Идеальное состояние, чтобы иметь от одного до двух микросфер за изображения поля зрения. Когда слишком много микросферы будут добавлены в культуральную чашку, они уже могут придавать случайно в культивируемых нейронах.
  3. Перемещение в чашку с культурой, в поисках изолированного нейрона с более длинной нейритов (аксон), а также сохранять положение столик микроскопа.
  4. Передвигаться и искать шарик придерживался поддержки культуры.
  5. Включите ИК лазерного захвата. На данном этапе, не голограммы не проецируются на ОДС, и положение места ИК лазерного совпадает с УФ положение лазерного пятна. Установка осевого положения пятна ИК 2-3 мкм над поверхностью поддержки культуры, под микроскопом движение стадии.
  6. Установите мощность УФ лазерной переданной образцу до менее 1 мкВт.УФ лазер рассекатель ранее была откалибрована 14:
    5-6 мкВт стеклянной подложки подвергается абляции
    4 мкВт нейронные связи полностью расчлененные
    2,5 мкВт нейрита частично поврежденных
    <1 мкВт ударная волна в культуре блюдо. Оптические ударная волна достаточно сильна, чтобы снять шарик из стеклянной подложки.
  7. Включите УФ лазер, оставляя ИК лазер включен, и переместите УФ месте над придерживался шарик под микроскопом движение этапе. Шарик отделяется от поверхности, а его часть удерживается ИК лазерным. Затем выключите УФ лазер.
  8. Переместить захваченных шарик несколько микрометров над стеклом поддержки (20-30 мкм). Подъем шарик эта позиция будет Ограничить контакт с другими клетками во время его двинулась к выбранной ранее нейрона. Принесите шарик к ранее сохраненной этапе положение. Установить этап скорость до низкого значения (10 мкм / сек), так что сила сопротивления жидкости не превышает оптическую ловушкуПинг силой.

5. Переместить Ловушка положение относительно лазерного пятна Dissector и Axon позиции по генерируемые компьютером голограмма, и откалибровать оптический пинцет Жесткость

  1. Перемещение шарика в сторону стеклянной подложки для визуализации аксона. Шарик удерживается выше ячейки, чтобы избежать контакта с ним (приблизительно 5 мкм над стеклом поддержки).
  2. Перемещение столик микроскопа, чтобы переместить УФ точка фокусировки по центру ширины аксона. Сохранить текущее положение этапе.
  3. Переместить позицию ИК точечная фокусировка по компьютерной голограммы. На этом этапе стадии остановлен в положении, выбранного в предыдущем шаге. Когда компьютерная голограмма проецируется на ОДС, пойманным шарик перемещается по отношению к аксона. Перейдем ИК лазерного пятна иметь захваченных шарик выровнен по центру нейритов, с УФ лазерного пятна по центру же нейритов тоже. ИК месте и, таким образом захваченных шарика расположены вдоль аксонов5-10 мкм от УФ месте. Мы переместить положение ИК по отношению к УФ место в зависимости от нейритов геометрии. В случае оптических пинцетов не оснащены системой SLM, положение может быть изменено путем наклона зеркала, оптические или акустические дефлекторы, на ИК оптического пути. Локальный ИК-лазер может быть расположен 5-10 мкм от УФ месте, чтобы избежать оптического взаимодействия рассекает луч с захваченными зонд, который может влиять на его броуновского движения и изменить следы силовой спектроскопии.
  4. После определения новом месте ИК-положении по отношению к УФ месте и аксон положение перемещения этап в положение захваченного шарик от аксонов и избежать столкновения с ним. Перемещение осевого положения захваченного шарик до около 2 мкм выше покровного стекла.
  5. Совместите QPD в центре интерференционных полос на нем: х и у сигналов QPD дифференциальные нулей при QPD по центру. Приобретать 5 сек броуновского движения захваченных шарик по интерферометраметр, при частоте дискретизации 50 кГц. Получение жесткость (пН / нм) и чувствительность (В / нм) оптических ловушек методом спектра мощности 18.

6. Прикрепите шарик аксона. Выполните аксотомии и одновременная Измерение силы

  1. Поднимите захваченные позиции шарик примерно 4 мкм над крышкой стекла, и переместить его к ранее сохраненной этапе положение (см. п. 3.2).
  2. Переместить в ловушку шарик вниз к аксона до его соприкосновения с аксонов. Столкновение между ловушке шарик и аксон контролируется сигнал г QPD обнаружения перемещения захваченной шарик в осевом направлении.
  3. Подождите 10 сек с захваченными шарик прижимается к аксона в пользу его адгезию к нейрита мембраны.
  4. Перемещение микро этап смещать шарик захваченных из аксонов и, таким образом проверить его адгезию к клеточной мембране. Если шарик придерживались, оно ускользает от оптической ловушке.
  5. Отодвиньте лазерная ловушка на придерживались шарики включить силу зажима петли с силой состоянии равна нулю. Таким образом, пьезоэлектрические этап перемещает шарик, прикрепленный к клетке, на оптическом центре ловушки. Если система не имеет контроль обратной связи, положение лазерной ловушки можно перемещать предметный столик микроскопа его в центр на придерживались зонда. Центре ловушки достигается, когда QPD сигналы такие же, как когда шарик в ловушку и не привязан к ячейке (х и у QPD сигналов равна нулю, и Z QPD сигнал дает такую ​​же сумму напряжения из четырех квадрантов как тогда, когда шарик в ловушке далеко от поверхности).
  6. Установить сила зажима условие на оси Z, позиционирование захвата лазерного чуть более центре шарик (около 100 нм), для создания претензией на придерживались ловушке зонда. В случае, если система не имеет с силой зажима управления, оптические ловушки положение может быть поднята с шагом 25 нм на предметный столик микроскопа. Сигнал Z QPD позволяет осуществлять мониторинг. Таким образом, использование Тхис сигналом, чтобы установить положение лазера ловушка по отношению к придерживались зонда. Такое предварительное натяжение необходимо ощущать напряжение на мембране аксона после поражения, и, как следствие снижением броуновского движения придерживались зонда. Аналогичный подход был предложен для измерения ослабления натяжения в мембране троса на видеоизображения 19.
  7. Выключения силу зажима обратной связи для измерения силы на придерживались зонда в положении зажима условие (пьезо-каскад заблокирован).
  8. Начать одновременной записи захваченных позиции зонда через интерферометр (20 кГц частота дискретизации) и клетки во время лазерной аксотомии покадровой светлом поле визуализации (20 Гц частоты кадров).
  9. Включите УФ лазер для доставки лазерного импульса, пока поражение не станет видимым на изображении аксона (обычно 200-400 оптических импульсов необходимы энергия импульса: 25. Нью-Джерси), затем выключите УФ лазер.
  10. Продолжить запись на интерферометра в течение приблизительно 3 милиN, до X, Y и Z QPD следов не выходит на плато.

7. Определить общую снять напряжение

  1. Преобразование записанных QPD следы (в вольтах) на калиброванной чувствительность оптической ловушки, для получения соответствующих следов в нанометрах.
  2. Фильтр х, у, г и следы смещения фильтра верхних частот с отрезанными на частоте 10 Гц.
  3. Рассчитайте общую дисперсию фильтруется следы представляющих броуновское движение захваченного шарик. Вычисляет дисперсию, при 25 мс шаги для перекрытия временных окон 500 мс (10 000 точек данных) 20. Фильтрации верхних частот следов исключает изменение броуновское движение из-за колебаний мембраны или корковой движения актина. Броуновское движение шарика уменьшается на оптических сил и сил адгезии в клеточной мембране. Когда мембрана напряженными из-за ослабления натяжения ее вязкость повышается, и, следовательно, броуновское движение шарика, обнаружены сразуже после аксотомии, начинает уменьшаться.
  4. Определить T0: начала снижения броуновского движения дисперсии, после поставки УФ лазерной энергии. Момент времени t0 указывает на начало мембраны штамма.
  5. Определение t1: конец уменьшение дисперсии броуновское движение (когда он достигает плато). Момент времени t1 указывает конец мембраны штамма.
  6. Видео выполнять отслеживание остатков или царапину на поддержку стеклянной крышкой, для измерения любых дрейф образца во время измерения силы. Чтобы отслеживать частицы на стекле поддержку, мы сначала применить пороги светлого поля изображения, чтобы получить стек бинарных изображений с частицей в белом на черном фоне. Тогда, мы отслеживаем частиц центра масс с суб-пиксельной точностью (с помощью бесплатного программного обеспечения ImageJ).
  7. Вычтите измеренное дрейфуют от смещения QPD следов. Умножьте дрейф коррекцией QPD следы соответствующими калиброванный оптический жесткости (K х, к Z), чтобы получить Fx, Fy, Fz следы в piconewtons.
  8. Рассчитайте общую след силу F общ = √ (2 + Fx Fy 2 + Fz 2).
  9. Рассчитайте общую релизе силы между T0 и T1 как F = F выпустила TOT (T1) - F TOT (t0). Сила, измеренная в момент времени t0 должно быть вычтено, потому что это из-за смещения зонда от центра ловушки, когда шарик прилипает к нейритов.
  10. Вычислить нейритов площадь контакта между ловушку шарик и УФ положение лазерного пятна: на яркой мерой поля изображения длинные (L) и короткие (D) осей нейритов между ловушку шарик и УФ положение лазерного пятна. Площадь контакта аксона аксона = L х Г
  11. Нормализация общего выпущен силы F выпущен площадь контакта аксона аксона.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Элемент генерирует тяговых усилий на подложке ее фокальные адгезии. Сила, порожденная элементами цитоскелета находятся в равновесии с противодействующей силой культуры подложке. После лазерной индуцированной повреждением аксонов, некоторые из напряженной кабелей цитоскелета разрушаются и их уравновешенной напряжение снимается, поскольку противоположные силы субстрата адгезии устраняется. Выпустила напряженность частично распределяется по неповрежденную фокальные адгезии, и шарик прикреплен к клеточной мембране, которая состоялась в оптической ловушке, измеряет часть такого релиза не противодействует элементов цитоскелета клетки крепления к основанию (см. схему рисунок 1) .

Мы сообщаем, на рисунке 2, представителя результате вышеописанных экспериментальных протоколов. Нейрона, на рисунке 2а левой панели, представляет собой больше аксонов, которая идентифицирует аксона дифференцирующие NEURON. На рисунке 2а правая панель, тот же нейрон, показанные после индуцированного аксонального поражения (указано белой стрелкой). показывает записанный шарик следы смещения по х, у, и Z направлениях. Фиг.2с сообщает видео отслеживание нуля на стеклянной подложки, учесть и устранить этап дрейф во время измерения.

На рисунке 3а, на левой панели, мы показываем поврежденных аксонов, и белую линию вверх поражения сайт, где мы вычислим кимографа из аксонов диаметра во время измерения снять напряжение. На правой панели кимограф, показывающий, как нейритов диаметр слегка возрастает сразу после поражения, а затем становится тоньше за счет высвобождения напряжения к клетке сома. На фигуре 3b, мы количественно кимограф результат. Нейритов кажется более ярким по отношению к фону, так как мы расположены аттаЧед шарик в центре центра цели, и, следовательно, аксона немного не в фокусе. Действительно, в отчетности суммы интенсивности пикселов вдоль линии кимографа каждый кадр покадровой записи видео, мы получим оценку нейрита диаметра во время выпуска напряженности. На панели 3с, мы сообщают полную дисперсию прилагаемой шарик во время ослабления натяжения, рассчитывается на основе следов записанных интерферометра (на рисунке 2, б) после фильтрации верхних частот с частотой 10 Гц частоты отсечки. Мы можем наблюдать, что дисперсия возрастает с увеличением диаметра нейрита по мере накопления материала вверх по течению от поражения сайта. Затем дисперсию начинает уменьшаться (в момент времени t0 на рисунке 3, в) когда мембрана напряжена, а нейритов диаметр уменьшается тоже. Дисперсия снижение достигает плато (при t1 на рисунке 3, в), когда напряжение высвобождение прекращается. После T1, броуновское движение начинает увеличиваться, потому чтомембранных релаксации возможно из-за экзоцитоза 21 (см. рис 3в).

На рисунке 4а, белая коробка показывает оценка нейрита площадь контакта аксона с культурой поддержки. Аксон рассчитывается между УФ положение лазерного пятна и центр захваченного зонда. отчеты амплитуды следов от общего выпущен сила F выпущен полученный после умножения дрейфа коррекцией QPD смещение трасс (на рисунке 2b) путем соответствующего калиброванный оптические ловушки жесткости (K х, к у, к Z). Мы вычисляем разницу между сила, измеренная в момент времени t1 и t0 (ΔpN на рисунке 4, б), а затем, мы делим на аксона, чтобы получить напряженность выпущена в условиях PN / мкм 2.

Повторив тот же протокол на разных нейронов в образце, мы можем начатьсессий экспериментов на нескольких культурах, обработанных химическими факторами или высевают на различных носителях и, наконец, сравнение средней величины, полученные в различных экспериментальных условиях. На рисунке 5 мы показываем снятие напряжения после аксональное поражение омрачено фокальные адгезии на подложке, при этом более высокое значение означает ослабления натяжения аксона менее прикреплен к подложке. Потому что мы вызывать частичный, а не полный, поражения аксона, исследовалась зависимость измеренного ослабления натяжения от полной энергии поставлено, и на нейрита площадь контакта между поражением сайте, и захваченный шарик. Мы стремились уничтожить более элементов цитоскелета, обеспечивая более высокое число световых импульсов, а следовательно, вызывать более высокие снятие напряжения. В противном случае, с увеличенной площадью контакта нейритов, мы ожидали, чтобы измерить меньшее количество натяжении. На рисунке 5 показано, что зависимость от двух вышеупомянутых параметровне ясно. Поэтому вывод, что индуцированное частичного поражения (с предварительно калиброванный низкой энергии за импульс, см. протокол шагом 4,5), связан с размерностью абляции место 8, который не меняется при использовании той же цели микроскопа и той же энергии в импульсе на образце. Кроме того, тот факт, что снятие напряжения не коррелирует с контактной области не удивительно, поскольку хорошо известно, что такие показатели не представляют собой хорошую оценку клеточной адгезии к подложке, а фокальные адгезии занимают лишь 1% базальной поверхности 22.

Рисунок 1
Рисунок 1. Графическое представление нарушено равновесие цитоскелета при лазерной аксотомии. Придерживается клетки на подложку фокальные адгезии. Синие стрелки сpecify тяговых сил, генерируемых элементами цитоскелета (указаны источники). Голубые стрелки указывают противодействия сил, возникающих при жесткой подложке культуры. В упрощенном сценарии, перед поражением, цитоскелета и подложкой сил в паре и уравновешивают. После лазерной поражением нейритов, соединения между некоторыми пружинами и подложки нарушена. Таким образом, подложка уже не противодействует сила тяги из cytoskletal элемента. Захваченные шарик, прикрепленный к мембране отслеживает направление выпущен силы цитоскелета.

Рисунок 2
Рисунок 2. Интерферометрические отслеживание ловушку шарик, прикрепленный к мембране аксона нейронов гиппокампа при поражении лазерно. (А) Светлое поле изображения, полученные во время абляции аксона. Перед повреждение на левой панели. После поражения на правой панели. Поли-D-лизин покрытием шарик прикреплен к мембране (полистирола шарик, диаметр 4 мкм) и провела в оптической ловушке. Средняя мощность лазерного ИК на образце 14 мВт. Белая стрелка указывает на месте повреждения. Бар 5 мкм. (Б) записи следов на задней фокальной плоскости интерферометрии шарик положение в оптической ловушке. Синие, зеленые и красные следы представляют собой шарик положение вдоль х, у, и Z. соответственно. Частота дискретизации 20 кГц. (C) Смещение царапину на поддержку культуры измеряется видео слежения для мониторинга этапе дрейф. Синий и зеленый следы X и Y позиции получены видео слежения. Частота кадров составляет 5,5 Гц.

77fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Анализ диаметра аксона при натяжении, и мембрана штамм поврежденного аксона. (А) Яркое изображение области поврежденного аксона, на левой панели. Белый, перпендикулярной к аксона указывает на положение, кимограф вычисляется. На правой панели, кимограф диаметра аксона, вверх по течению месте повреждения. Каждая строка кимографа соответствует 0,18 сек. (Б) Сумма интенсивности пикселов каждого ряда кимографа представлении оценки диаметра аксона во время ослабления натяжения. (C) общей дисперсии броуновское движение шарика прикреплены к Аксон (T0 и T1 указывают соответственно в начале и в конце отпуска натяжения в аксона после вскрытия).

0477/50477fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Количественная оценка напряженности освобожден после аксотомии. (А) Яркое изображение области поврежденного аксона. Белый квадрат обозначает оценку нейритов площадь контакта между месте повреждения и центр захваченного шарик. (Б) следов от общего Амплитуда силы измеренные после аксотомии (F общ = √ (Fx ​​Fy 2 + 2 + Fz 2)). Fx, Fy и Fz были рассчитаны по закону Гука (F = кх), где смещение следы показанным на фиг.2b. Жесткости, в трех ортогональных направлениях, оптической ловушки были рассчитаны по методу спектра мощности (к х, у = 7,9 PN / мкм, К г = 2,3 PN / мкм). ΔpN указывает измеренное выпущен силы между моментов времени T0 и T1.

Рисунок 5 Рисунок 5. Зависимость измеренного ослабить натяжение количество энергии переданной образцу, а на площадь контакта аксонов. Данных с 26 экспериментов, проведенных на аксоны нейронов мыши hippocamapal на 3 DIV. (А) Точечная диаграмма ослабления натяжения по сравнению с площадью контакта аксонов между поражением и захваченных шарик местах. (B) Точечная диаграмма снятие напряжения по сравнению с общим количеством энергии доставлены площадь контакта аксонов образца.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы сообщаем в этой работе количественные методы для сравнения нейрита адгезией к подложке культуры, при проведении одновременных измерений силовой спектроскопии при лазерном клетки, вызванное поражением. Измеренные снятие напряжения связан со степенью адгезии клетка с подложкой: клетки с более высоким числом фокальные адгезии должен освободить меньше напряжения. Измерение снятие напряжения с точки зрения piconewtons обеспечивает физическую величину, с помощью которых можно оценить аксонального адгезию к культуре поддержку в различных экспериментальных условиях 14.

Несколько лабораторий интегрированный лазерный рассекатель с оптической системой, пинцет, принимая различные оптические конструкции 23. Наш выбор был установки с фиксированным оптического пути и движение столик микроскопа. Чтобы достичь этого, мы вводим пространственный модулятор света на пути луча ИК лазерным для перемещения захвата месте по отношению к УФ положение лазера. Хотя galvanometrМикросхема зеркала позволяют рулевого управления положением фокуса лазера без перемещения образца, они могут привести к механическим шума в системе, влияющих на измерение силы спектроскопии. Кроме того, мы решили вновь позиционировать фокуса инфракрасного лазера в образце, так как броуновское движение анализа позволяет быстро повторной калибровки оптических жесткости. Перемещение УФ положение лазерного пятна на образце может производить сферические аберрации, влияющих на качество УФ точка фокусировки непосредственно, который можно пренебречь только для малых смещений пучка от центральной позиции. Таким образом, изменение оптических свойств лазерного рассекатель может потребовать калибровки заново поставляемой мощности лазера в зависимости от повреждения лица.

Под измерением силовой спектроскопии, мы могли наблюдать, что напряженность релиз состоит из быстрой фазы несколько секунд, и медленной фазы, которые могут длиться несколько десятков секунд. Как сообщалось в предыдущих работ 14, иногда медленныефаза может длиться несколько минут. По этой причине, мы должны были исправить измерение силы с помощью видео-слежения царапину на поддержку культуры. В будущем, лучше было бы, чтобы отменить этап дрейфа с обратной связью, которая автоматически исправляет положение столику микроскопа с помощью видео или интерферометрическом отслеживание шарик прикрепляется к крышке стекла. Этот тип конфигурации, уже сообщалось в литературе, требует второго лазерного луча с центром на прилагаемые шарик, и обеспечивает стадию стабилизации с суб-нанометровой точностью 24,25.

В будущем мы хотим применить разработанный протокол для сравнения аксонов адгезией к культуре поддержку на различных стадиях дифференцировки и в различных патологических состояниях, чтобы обеспечить количественный анализ фармакологического лечения. Кроме того, тот же протокол может применяться к конструкции имплантируемого леса, сравнивать нейронов адгезию к различным типам материалов с различными мехветствующий квантовомеханический или химических свойств 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Альберто Guiggiani для развития реального времени система управления, Эвелина Chieregatti и Ханако Цусима для обсуждений проницательный, Джакомо Pruzzo и Алессандро Пароди для разработки пользовательских электроники и программного обеспечения, и Клавдия Chiabrera и Марина Нанни за их экспертные консультации и помощь в подготовке ячейки культуры.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated Bangs laboratories PC05N/6700
PolyLink Protein Coupling Kit Polyscience 19539
EQUIPMENT
IR laser IPG Laser GmbH YLM-5-SC-LP ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization
Spatial light modulator Hamamatsu LCOS-SLM 10468-07
Blue-tweezers software Optics group, University of Glasgow Free downloadable software http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/
ImageJ Hamamatsu Free downloadable software http://rsbweb.nih.gov/ij/
QPD Thorlabs S5980 with C5460SPL 6041 board Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement
PD Teem Photonics PDA100A-EC Photodiode to measure z trapped probe displacement
nano-Pulse UV laser AA-optoelctronics PNV-001525-040 Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps
Acoustic Optic Modulator Olympus MQ110-A3-UV, 355nm fused silica
Upright microscope Andor BX51 Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective
CCD Warner Instruments V887ECSUVB EMCCD
Peltier device Physic Instruments QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller
Microscope stage: micro+piezo stage National Instruments Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD
Daq NI PCI-6229 Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
  2. Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
  3. Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
  4. Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
  5. Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
  6. Pinato, G., Raffaelli, T., D'Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
  7. Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
  8. Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
  9. Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
  10. Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
  11. Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
  12. O'Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
  13. O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
  14. Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1, (183), (2011).
  15. Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. 191-216 (2011).
  16. Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
  17. Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. (2011).
  18. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).
  19. Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
  20. Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
  21. Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
  22. Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
  23. Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
  24. Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
  25. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
  26. Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics