Non-invaziv Hipertermi Kanser Tedavisi için Altın Nanoparçacıklannm ve Biyolojik Sistemleri ile Radyofrekans Etkileşimleri değerlendirilmesi için Protokoller

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Biz 13.56 MHz radyofrekans (RF) etkileşimlerini araştırmak için kullanılan protokolleri açıklar hem biyolojik olmayan ve biyolojik sistemlerde (in vitro / in vivo) altın nanoparçacık koloitlerle elektrik-alanlar. Bu etkileşimler, kanser terapisinde uygulamalar için araştırılmaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Corr, S. J., Cisneros, B. T., Green, L., Raoof, M., Curley, S. A. Protocols for Assessing Radiofrequency Interactions with Gold Nanoparticles and Biological Systems for Non-invasive Hyperthermia Cancer Therapy. J. Vis. Exp. (78), e50480, doi:10.3791/50480 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Var olan muadillerine göre daha az toksik ve invazif kanser tedavileri son derece tercih edilir. Minimal toksisite neden vücudun derinlerine nüfuz RF elektrik alanlarının kullanımı, şu anda non-invaziv kanser tedavisinin uygun bir araç olarak çalışılmaktadır. Bu içselleştirilmiş nanopartiküller (NPS) ile RF enerji etkileşimleri sonuçta hücre nekrozu biten, daha sonra hücre (hipertermi) aşırı ısınmaya neden olabilir ısı kurtarmak için düşünülmüştür.

Biyolojik olmayan sistemlerin durumda, son derece konsantre edildi NP koloidler tarafından serbest bırakılan ısı miktarının ilgili ayrıntılı protokolleri mevcut. Biyolojik sistemlerde, in vitro deneylerin halinde, etkili bir şekilde önemli ölçüde verileri örtücü kütle ortam ısıtma yapılar olmadan RF enerjisine kanser hücrelerini açığa çıkarmak için uyulması gereken teknikler ve koşullarını tarif eder. Son olarak, ayrıntılı bir metodoloji F vermeyeceğimveya ektopik karaciğer kanser tümörleri ile vivo fare modelleri.

Introduction

(Nedeniyle doğal elektrik dielektrik etmek üzere) biyolojik doku ile RF enerji emme sonunda hipertermi ile hücre ölümüne yol açan, zamanın bir fonksiyonu olarak, yüksek sıcaklıklarda doku ile sonuçlanır. Kanser hipertermi kanser hücresi içinde, içselleştirme ve sağlam komşu, sağlıklı normal hücreleri bırakarak, RF-ısı dönüştürücüler olarak hareket hedeflenen nanomalzemelerin kullanılarak optimize edilebilir olduğu varsayılmaktadır. Çeşitli raporlar zaten NPlerin çeşitli hangi kanser nekroz 1-4 yardımı gibi etkili RF ısı kaynaklarına hareket olduğunu göstermiştir.

Bu açıdan, altın NPS (AuNPs) 3-5 karbon nanotüpleri 1 ve kuantum noktaları 6, in vitro ve in vivo deneylerde RF kullanıldığında, 7 verici özellikler göstermiştir. Bir RF-alana maruz kalan, bu NPlerin ısıtma mekanizmasının tam doğası halen tartışılıyor olsa da, bir dizi bölgesininAuNPs kullanarak temel deneyler NP büyüklüğü ve toplama iki devlete de büyük önem vermiştir. Bir RF-8 alana maruz kaldığında çapı <10 nm sadece AuNPs ısı olacağı gösterilmiştir. AuNPs toplanır Ayrıca, bu ısıtma mekanizması önemli ölçüde azalırlar. Bu yığılma durum aynı zamanda etkili bir terapi RF 4 endolysomal hücre içi bölmeler içinde AuNP kolloidal kararlılığını optimize üzerine önem in vitro modeller içinde geçerli kılındı. Ancak, bu verileri toplamak ve değerlendirmek için kullanılan teknikler ve deneysel ilkeler özellikle NP taneciklerinden RF ısı profilleri doğrulanması durumunda, sorunlu olabilir.

Çeşitli raporlar, NPS içerisinde süspanse edilir plan iyonik süspansiyonun Joule ısıtma ana RF ısı üretim kaynağı olup NPS kendilerini 9-12 olabilir göstermiştir. Bizim son kağıt 8 t doğrulanmış olmasına rağmenO 10 nm daha az çapları AuNPs ısı üreten RF etkileşimleri kullanmak, bu yazı boyunca daha ayrıntılı olarak bu protokolleri açıklamak hedefliyoruz.

Ayrıca protokolleri ve in vitro ve in karaciğer kanseri modelleri için in vivo ve hem de in hipertermik termal maddeler olarak AuNPs etkinliğini değerlendirmek için gerekli olan teknikleri göstermektedir. Biz sitrat başlıklı AuNPs basit koloitler öncelikle odak olsa da, aynı teknikler bu tür antikor ve kemoterapi ile konjüge kompleksleri gibi diğer AuNP melez uygulanabilir. Bu ilkelere bağlı kalarak Deneyciler umarım hızla etkili bir RF kaynaklı termal Hyperthermic ajan olmak için herhangi bir nanomaterial için potansiyelini değerlendirmek gerekir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bütün deney bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir.

Daha fazla detay aşağıda 1-3 adımları tasvir edilmiştir.

1.. NP Colloids Değerlendirilmesi RF Isıtma: Bir Örnek olarak AuNPs

  1. Genel olarak, her numune NP araştırılmaktadır için, ilk olarak arka plan iyonları ve kirleri çıkarmak için iyonu giderilmiş (Di) su ile santrifüj filtre ile örnek birkaç kez yıkayın. Tüm iyonlar ve kirletici yıkanmış olan sıvı DI su gibi benzer RF ısıtma oranları (HR) sahiptir AuNP süspansiyondan kaldırılmış olacaktır. Bu saflaştırma işlemi, aynı zamanda elde edilecek NPlerin daha yüksek konsantrasyonları sağlar. Bu örnekte AuNPs kullanarak rağmen, temel ilkeler, diğer NP malzemelere uygulanabilir fazlalaştı.
  2. Bir örnek olarak, çapı 5 nm arasında ticari olarak temin edilebilen AuNPs bir 500 ml şişe saflaştırılması ve daha sonra, elektrik-fi bir 13.56 MHz RF alanına tabi tutabilireld gücü 90 kV / m.
    1. ~ Altı 50 kDa santrifüj filtre tüpleri arasındaki stok AuNP solüsyonu ve bölünmüş 125 ml alın. 3.000 rpm'de santrifüj. 2 dakika bekletildikten sonra 5 saniye için. Daha fazla stok solüsyonu ile süzülür tampon ve dolum filtrelerini çıkarın. Tüm 500 ml süzülmüş edene kadar tekrarlayın.
    2. DI su benzer bir hacmi ile filtre tampon ve yaklaşık olarak yerine 8 kez (ya da filtre tampon RF HR DI suya eşdeğer kadar) tekrar edin. UV-Vis analizi de kirletici absorpsiyon tepeleri izlemek için kullanılabilir, dikkat edin. Tampon kirletici tam olarak her filtre içine pipet yaklaşık olarak 0.5 ml DI su çıkarıldı ve tekrar pipetleme AuNPs yeniden süspanse edildikten sonra. Bu tamamen filtreden AuNPs kaldırmak ve tam süspansiyonu için izin vermelidir. Bir 15 ml Eppendorf tüpüne altı süspansiyonlar birleştirin.
    3. AuNPs arıtılmış ve konsantre edildikten sonra, ICP-OES ve / veya ICP-MS, UV-vis ve concentratio veri Zeta potansiyelini kullanarak numuneyi analizn ve NP istikrar, sırasıyla. SEM ve / veya TEM analizi de morfolojik veriler elde etmek için kullanılabilir. Bu tekniklerin ayrıntılı örnek hazırlama 4 literatürde bulunabilir.
  3. Kanzius RF önceki çalışmalarda 8'de tarif sistemi, ya da bu sistemin Türevler, (herhangi bir örnek mevcut olan) havada RF elektrik alanı, ve böylece, bir 1.3 ml silindirik bir kuartz küvet yer ~ küvete içindeki 90 kV / m kullanma. Standart bir örnek için tuzlu su (% 0.9 NaCl) elektrik alanı ~ 1.1 kV / m azaltılmış olacaktır. Bu karşılaştırmalar, farklı sistemler arasında yapılacak izin vermek için kullanılan yaklaşık durumlardır.
    1. Pipet kuartz küvet içine saflaştırılmış AuNP koloidin, 1000 mg / l örneğin 1.3 ml ve RF-alan içine bu tanıtmak. Bu özel bir dahili teflon numune tutucu kullanılarak yapılabilir. 120 saniye bir süre için ya da örnek elektrik arkı ya da hızlı kaynamasını önlemek için 70 ° C ulaşana kadar RF-alana örnek Açığa. CaIR kamera ve ilgili yazılım kullanılarak termal görüntüleme verileri (aynı zamanda kontrol alanlarını) pture. Bu işlemi üç kez tekrarlayın.
    2. DI su tamponundan AuNPs elde etmek için bir 50 kDa santrifüj filtre ile filtre örneği. Üç kez tekrar, RF-alanına tampon yeniden ortaya. AuNP kolloidin ve plan DI su tampon arasında HR'ler farkı nedeniyle AuNPs kendilerini HR belirler. ~ HRS elde etmek için bekleyebilirsiniz 0.3 ° C / sn ve ~ 0.25 ° C / sn bir AuNP bağımlı İK vermek için 0.05 ° C / sn. In vitro / in vivo deneyler için 1.3 ml su içinde filtreden kalan AuNPs yeniden süspanse edin.

2. Nanopartikül destekli RF kaynaklı Hipertermi: In vitro çalışmalar

  1. Bu in vitro çalışmalar, 2B tekli katmanlar meydana getirmeyen hücre kanser türü her türlü uygulanabilir. Bu deneyde, Hep3B hücre kaynaklı insan hepatoselüler karsinom kullanın.
    1. Plaka ~ 50.000 celbüyüme ortamı içinde 1 ml bir 12-yuvalı plakanın ön üç kuyu ls. Bu 6 kez (kontrolleri olarak NP çalışmalar için üç tabak ve üç tabak kullanın) tekrarlayın. NPs tanıtmadan önce 24 saat boyunca 37.5 ° C'de inkübe edin. 5 dakika için biyogüvenlik kabini UV ışığa maruz kullanarak ilk NPs sterilize edin.
    2. Her içine de, 1000 mg / L AuNP çözeltisi 0.1 ml tanıtmak ve başka bir 24 saat süre ile bırakın. Üç kontrol hücre plakalarının her bir oyuğuna 0.1 ml su eklenir ve de 24 saat süre ile bırakın.
    3. 24 saat geçtikten sonra hücre ortamı aspire ve herhangi bir yüzey-bağlı AuNPs çıkarmak için PBS ile yıkayın. Hücre ortamı değiştirin. Hücreler artık RF maruziyeti için hazırız.
  2. RF-alan içinde her bir 12-yuvalı hücre paketi yerleştirin. Hücreler 31 ° C'ye soğuyana kadar bekleyin RF jeneratör açın ve 3.5 dakika boyunca maruz. Hücre ortamının nihai sıcaklığı ~ 37 ° C olacak RF alanı kapatın. Hücreleri çıkarmak ve analizden önce 24 saat için bir kuluçka makinesi içinde yerleştirin.
      <li> kuvöz ve aspire hücre ortamından hücreleri çıkarın. MTT ayıracı 0.4 ml 'de her bir kuyucuğa hücre ortamının 1.6 ml ilave edilir. 4 saat hücreleri inkübe edin. Ortam aspire ve dimetil sülfoksit (DMSO), 2 ml ile değiştirin. Bir tezgah rocker hücre plakaları yerleştirin ve DMSO MTT reaktifleri çözmek için izin vermek için 10 dakika boyunca bırakın. Son olarak, optik olarak pipet 100 Bir 96-yuvalı plaka her bir ul ve bu SpectroStar Nano plaka okuyucusu gibi bir plaka okuyucusu kullanılarak 570 nm de iyi okuma.

3. Nanopartikül destekli RF kaynaklı Hipertermi: In vivo çalışmalar

  1. Bu in vivo çalışmalar, ortotopik veya dış murin modelinde katı tümörler oluşturan herhangi bir kanser türüne uygulanabilir. Bu deney, bir dış tümör BALB-C çıplak fare modelinde Hep3B karaciğer kanser hücrelerini kullanır.
  2. Not: Tüm in vivo deneyler ilgili tüm kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar ile uyum içinde yürütülür. Ayrıca, göstermiştir ediliyordu protokol Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) rehberliği ve onayı altında gerçekleştirildi.
    1. Uygun büyüme ortamı ile bir doku kültürü şişesi içinde hücrelerin uygun bir sayısı (100 ~ k) büyütün. Hücre kültürü süresince,% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör içinde inkübe edin.
    2. Tripsin (şişeden ayırmak için) hücreleri tedavi ve her bir 25 ul için 2000000 hücre ihtiva eden bir çözelti üretir. (Buz üzerinde) Matrigel eşit miktarda eklenir ve nihai enjeksiyon solüsyonu hazırlamak için iyice karıştırın. Fare sırtında istenilen pozisyon içine bu çözüm enjekte edilir ve tümörler istenilen boyutta (çoğu hücreler için 2-4 hafta) büyümek için zaman uygun miktarda bekleyin. RF maruz kalma öncesinde, BALB-C Çıplak fareler katı ektopik tümörler 0.5-1 cm çapına taşımalıdır.
    1. ANAE tarafından (bu durumda BALB-C çıplak fare) kullanılmak üzere fareler hazırlamakIP enjeksiyon yoluyla ketamin ve ksilazin eden bir çözelti ile sthetizing. Fareler, uykuya dalma olsa da, 37 ° C'de sıcaklığı kontrol edilen bir oda içinde tutmak Toplam 20 fare, tüm rulman benzer boyutta tümörler gerekli olacaktır. No AuNP enjeksiyonları ile her iki grup: geri kalan 10 fare RF-maruz bırakılan ve RF maruz kalan kontrol grubu arasında bölünecektir ise On fare (son olarak adı geçen, sadece PBS enjeksiyonu) ile bağlantılı olarak ve AuNPs olmadan kullanılacaktır.
    2. Bir kez uygun şekilde anestezi, doğrudan bir 27 G iğne ile bir 1-cc şırıngası kullanılarak tümör içine enjekte AuNPs. AuNP Çözelti PBS 0.1 ml 200 mg / L'lik bir konsantrasyonda Au olmalıdır. Enjeksiyonundan sonra, alkollü bir mendille kan emer ve enjeksiyon siteyi silmek için cerrahi bir bez kullanın.
    3. Daha sonra RF jeneratörünün alıcı baş tedavi edilecek olan fare monte edin. Tümör iletim kafasına en yakın olan ve böylece fare konumlandırılmalıdır. Tedavi edilecek olmayan alanları Kalkan, hem de sensibakır şerit ile, bu tür gözler, kulaklar ve ayak parmakları gibi alanları çabaya verilen. Hiçbir yük birikimi oluşur böylece bakır şerit uygun topraklama uçağı temas olduğundan emin olun. Ayrıca, pozlama alan tedavi edilmesi istenen bölgeye boyutundan daha büyük, en az 1 cm'lik bir boşluk olması gerekir.
    4. Pozisyon IR termal kamera tümör ve tedavi alanında görünür böylece. 5 dakika RF açın. Elde edilen sıcaklık eğrisi kaydedilir. Tedavisi derhal sıcaklıkları daha yüksek 42 ° C dur tedavi elde edin.
    1. Onlar bilinçli kadar RF maruz kalma sıcak bir odasında anestezi fareler kurtardıktan sonra.
    2. Daha sonra aynı fareler 48 saat ile deneyi (- 3.4.1 3.3.1 adımlar) tekrarlayın.
    3. Deneyden sonra, kurumsal protokolleri ve prosedürlere uygun olarak fareler euthanize. Tümör ağırlığını kaydedin. Histolojik analiz için formalin kullanılarak tümörler düzeltmek ve parafin onları gömmek. Tümör bölümleri tipik haliyle wit boyanırh hematoksilen ve eozin ve ölçme terapötik etkinlik, örneğin Ki-67 ile ilgili hedefler için, vs, kaspaz-3 ayrılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1.. Bir örnek olarak AuNPs: NP koloitlerin RF ısıtma değerlendirilmesi.

Bölüm 1.1 izledikten sonra - 1.2.3 5 nm ve 10 nm çapında AuNPs son derece konsantre, kararlı, ve saflaştırılmış çözüm bekliyoruz. Stok solüsyonu olarak satın-500 ml kaynaktan, 1.000 mg / L'lik bir konsantrasyonda solüsyonun en azından bir 4 ml elde etmek için beklemek AuNPs ve bu konsantrasyonda plan DI su tampon çözeltisi arasında saatte fark olmalıdır ~ 0.25 ° C / sn 'dir ve Şekil 2'de gösterildiği gibi, sırasıyla 5 nm ve 10 nm AuNPs, 0.1 ° C / sn.

2. Nanopartikül destekli RF Bağlı Hipertermi: In vitro çalışmalar,

Sonuçlar ideal AuNPs içselleştiren bir RF alana maruz kalan hücreleri olmayan AuNP RF maruz kalan hücrelerin daha az geçerli olduğunu göstermelidir. Böyle beklenen sonuçların bir örneği Şekil 3 vurgulanır.

3. NanoparTICLE destekli RF Bağlı Hipertermi: In vivo çalışmalar

PBS-süspanse AuNPs enjeksiyonundan sonra ve ~ 2-3 hafta arasında RF maruziyet tedavisi sonra, ölüm sonrası analizi, tümör büyümesini kontrol ve / veya (Şekil 4 'de gösterildiği gibi), tümör boyutu / kütlesinde bir azalma ortaya gerekir. Aynı zamanda doğrudan hücresel termal ablasyon kanıt olabilir. Basit sitrat başlıklı AuNPs kadar optimize olmaktan ve tümör dokusu içinde toplamak eğilimi Ancak, bu durum olmayabilir. Son yayınlardan görülebileceği gibi, AuNPs RF kaynaklı sitotoksik geliştirmek için hücre içi organellere içinde olmayan toplanmış olması gerekir. AuNPs RF tedaviyi optimize etmek de, son çalışmalar bu tür Gemcitabine gibi kemoterapi ilaçların bu konjügasyonunu göstermiştir. Araştırmacı yine doğrudan bizim grubun daha önceki çalışmaları ile ilgili kendi AuNP-kompleksinin etkinliğini karşılaştırmak için ancak bu protokolleri kullanabilirsiniz.


Şekil 1.. Deneysel bakış. AuNP ısıtma değerlendirilmesi: olarak alınmış AuNPs (1. a) bir 50 kDa filtresi (1. b) içine yerleştirilmiş ve süzüntüden AuNPs ayrılması için santrifüje edilir (1.c). Yüksek derecede konsantre edilmiş ve saflaştırılmış AuNPs (1 d) oluşturulması için bu sağlar. Numune daha sonra ayarlanabilir bir döner aşama (1.e) monte edilmiş bir Teflon numune tutucu ile RF sistemi içine yerleştirilir. AuNPs ısıtma hızları, hem de diğer dört kontrol alanları, bir IR kamera (1.F) kullanılarak kaydedilir In vitro protokol:. Gösterildiği gibi Hep3B karaciğer kanseri hücreleri birkaç 12-iyi hücre paketlerinin ön 3-kuyu yetiştirilen 2 a in (hücre-paketlerinin miktarı dep el Deneyciler uygulanan RF gücü, AuNP konsantrasyon, kontrolleri, vb) açısından araştırmak isteyen ne biter. Her bir 12-gözenekli plaka daha sonra RF alana maruz (2.b). Optimum RF maruz kalma süresi olarak gerekli değildir önceden tespit edilmiş olsa da, akışkan sıcaklığı, aynı zamanda IR kamera (2.c) kullanılarak kaydedilebilir In vivo protokolleri:. Ektopik karaciğer tümörleri taşıyan BALB-C fareleri (3.a) tabi tutuldu Birkaç dakika RF sistemi (3.b) maruz intra-tümöral AuNPs enjeksiyonu ve. Bakır bant cilt yanan önlemek amacıyla fareler şasiye kullanılmıştır. AuNPs dolu bir kuvars küvet ayrıca RF maruz kalma doğrulamak için fare yanında gösterilir. Tümör alanı fare geri kalanından daha yüksek bir sıcaklığa sahip ve genellikle IR resim (3.c) kırmızı görünür olmalıdır.

YS "> Şekil 2,
Şekil 2. 5 nm ve 10 nm çapında AuNPs çözümler ısıtma oranları (C / sn '°). Protokol talimatlarına uygun olarak, ısıtma hızları süpernatan ile AuNPs belirlenmektedir (AuNPs + SN), süpernatanının mevcut olduğunu, AuNPs üzerinden süzüldü (SN) ve bu iki (farkı) arasındaki ısıtma oranlarındaki farkı. Ortalama ısıtma hızları, üç farklı deney (A, B, ve C) vardır.

Şekil 3,
Şekil 3,. . Sırasıyla hücresel içsel AuNPs (A, B, C, ve D nin ilavesi ile RF tek ve RF kontrol (RF), AuNP yalnızca (RF): idealize Hipertermi sitotoksisite canlılığı (MTT tahlili) gösterilmiştir dört hücre deneyleri .)

"> Şekil 4,
Şekil 4. Ektopik farenin tümörlerin Posthumous analizi. Sol tümör hem kontrol numuneleri) hiçbir RF ve hiçbir AuNP enjeksiyon yani beklenir budur. Tek başına RF alana maruz kaldığında orta tümör boyutunda hafif bir azalma göstermektedir. Ancak, sağ tümör RF + AuNP kombine tedavi daha da tümör büyümesini kontrol / azalma göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokoller Deneyciler tam olarak (bu durumda AuNPs) kanser tedavisi için RF kaynaklı hiperterminin artırabilir nano ölçüde analizine izin verir. Birinci protokol spesifik olarak yüksek konsantre edilmiş ve saf hale AuNP örneklerinden ısı üretimini analiz ile ilgilidir. Diğer gruplar öncelikle AuNPs AuNPs kendilerini 9-11 olup süspanse edilir önbelleklerden ısı üretimini bildirmiştir rağmen, bunların RF sistemleri çaplarda AuNPs düşük konsantrasyonlarda> 10 nm, hem de daha düşük işletme RF elektrik güçleri el- alan şiddetleri <AuNPs herhangi bir fark RF ısıtmanın etkilerini görmek için çok düşük olan 90 kV / m. Sadece bu raporda listelenen protokolleri ve parametreleri izleyerek Deneyciler nano ısı fenomen izleyebilirsiniz.

In vitro hücre-RF bölümü,-NP arayüzlerin gelişimi optimize edilmiş RF / NP kaynaklı hiperterminin için çalışılmıştır sağlar. BEFAuNPs ve RF maruz kalma cevher eklenmesi, (bu durumda Hep3B olarak) ile ilgili kanser hücre hatları uygulanabilir bir 2B katman büyüme için bekleyebilirsiniz. Bununla birlikte, her bir hücre hattı için doğru RF maruz kalma süresi, farklı zaman noktalarında RF alana maruz hücrelerin bu deneyler önce önceden belirlenmiş bir olması gereken 2 -8 dk gibi) ve 24 saat sonra yaşayabilirliği profil bakarak. Hücreler ~% 80 canlı nerede kullanmak doğru RF maruz kalma süresi olmalıdır. Hep3B hücrelerin durumunda bu ~ 3.5 dakika olduğu bulunmuştur.

Canlılığı için tercih edilen en basit standard deney, 3 - (4,5-dimethylthiazol2-il)-2.5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) deneyi, bu NPS tahlil tepkin maddeler ile etkileşim olacağı tahmin edilmektedir başka bir deney gerekli olabilir, ancak (MTT tahlili CNTs 13 ile reaksiyona sokulması ile olduğu gibi). Diğer daha gelişmiş ve ayrıntılı tahliller gibi Annexin-V ve propidyum iodid ile FACS analizi gibi hücre ölümü mekanizmasını belirlemek için kullanılabilire (PI) boyama. Bizim gruptaki vitro sistem gelişmeler Gelecek dolayı tamamen hücre medya toplu ısıtma için hipertermi olası kaynakları ekarte etmek için bir ısı kontrollü RF-atıl inkübatör hücreleri yerleştirerek bakacağız. Ayrıca, en fazla hücre ölümü, hem de hücre içi organel içindeki kararlılığı için bir hücre içine yerleştirilebilir gereken AuNPs miktarı, daha detaylı bir şekilde incelenecektir. Bu AuNPs gelişmiş RF-4 tedavisi için lizozomlarında içinde olmayan toplanmış olması gerektiğini gösterdi son çalışmaları ile uyumludur.

Son olarak, in vivo protokoller RF terapisi ile kombinasyon halinde tümör büyümesini ve / veya boyutunu kontrol etmek ya da azaltmak için kabiliyetleri için dış karaciğer kanseri farenin modellerinde AuNPs tam biyo-analizine imkan vermek için tanımlanmıştır. Tartışma için önemli bir nokta nedeniyle yanlış topraklama prosedürleri fare deri yanıkları ikna etmek için RF-alanı için yeteneğidir. Özellikte kullanımıprotokol bölümünde belirtildiği gibi rly, bakır bant topraklı ve yerleştirilmiş, bu yanıklara durdurmak için bir gerekliliktir.

Laboratuarımızda vivo çalışmalarında gelecekteki RF-AuNP maruz tümör ölüm / boyut kontrolü gerçek mekanizmayı değerlendiren üzerinde çalışacak. Bu hipertermi kritik bir rol oynadığı hipotezi de, bu tümör içine optik elyaf ısı sondaları doğrudan yerleştirilmesi ve bu dokuların RF kaynaklı sıcaklık tepki bakmak çevreleyen sağlıklı hücreler gibi kontrollerin kullanımı olsa geçerli olması gerekir . Ayrıca, emisyon dalga boyu sıcaklığının doğrudan bir fonksiyonu olan bir hücre içi fluoresan termal boya geliştirme, bu doğrulama için mükemmel bir araç olacaktır ve aynı zamanda in vitro model için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH (U54CA143837), NIH MD Anderson Kanser Merkezi Destek Hibe (CA016672), V Vakfı (SAC) ve Kanzius Araştırma Vakfı (SAC, Erie, PA) sınırsız araştırma hibe tarafından finanse edildi. Biz idari yardım, Cerrahi Onkoloji Bölümü, MD Anderson Kanser Merkezi'nden Kristine Ash teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
500 ml gold nanoparticles (5 nm) Ted Pella, INC 15702-5
Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa) Millipore UFC805024/UFC910096 (4 ml and 15 ml volumes)
MEM X1 Cell Culture Media Cellgro 10-101-CV (add extra nutrients as necessary)
Fetal Bovine Serum Sigma F4135-500 ml
Copper Tape Ted Pella 16072
Equipment
Kanzius RF System (13.56 MHZ) ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
IR Camera FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA) Contact FLIR
1.3 ml Quartz Cuvette ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
Teflon Sample holder with Rotary Stage ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
SPECTROstar Nano Microplate reader BGM Labtech
UV-Vis spectrometer Applied Nanofluorescence, Houston, TX) NS1 NanoSpectralyzer
ICP-–S PerkinElmer Optima 4300 DV
Zetasizer Malvern Zen 3600 Zetasizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gannon, C. J., et al. Carbon nanotube-enhanced thermal destruction of cancer cells in a noninvasive radiofrequency field. Cancer. 110, 2654 (2007).
  2. Curley, S. A., Cherukuri, P., Briggs, K., Patra, C. R., Upton, M., Dolson, E., Mukherjee, P. Noninvasive radiofrequency field-induced hyperthermic cytotoxicity in human cancer cells using cetuximab-targeted gold nanoparticles. J. Exp. Ther. Oncol. 7, 313 (2008).
  3. Gannon, C. J., Patra, C. R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P., Curley, S. A. Intracellular gold nanoparticles enhance non-invasive radiofrequency thermal destruction of human gastrointestinal cancer cells. Journal of Nanobiotechnology. 6, 2 (2008).
  4. Raoof, M., et al. Stability of antibody-conjugated gold nanoparticles in the endolysosomal nanoenvironment: implications for noninvasive radiofrequency-based cancer therapy. Nanomedicine. 8, 1096 (2012).
  5. Glazer, E. S., Massey, K. L., Zhu, C., Curley, S. A. Pancreatic carcinoma cells are susceptible to noninvasive radio frequency fields after treatment with targeted gold nanoparticles. Surgery. 148, 319 (2010).
  6. Glazer, E. S., Curley, S. A. Radiofrequency field-induced thermal cytotoxicity in cancer cells treated with fluorescent nanoparticles. Cancer. 116, 3285 (2010).
  7. Glazer, E. S., Curley, S. A. Non-invasive radiofrequency ablation of malignancies mediated by quantum dots, gold nanoparticles and carbon nanotubes. Therapeutic Delivery. 2, 1325 (2011).
  8. Corr, S. J., Raoof, M., Mackeyev, Y., Phounsavath, S., Cheney, M. A., Cisneros, B. T., Shur, M., Gozin, M., McNally, P. J., Wilson, L. J., Curley, S. A. Citrate-Capped Gold Nanoparticle Electrophoretic Heat Production in Response to a Time-Varying Radiofrequency Electric-Field. J. Phys. Chem. C. 116, 24380 (2012).
  9. Kruse, D. E., et al. A Radio-Frequency Coupling Network for Heating of Citrate-Coated Gold Nanoparticles for Cancer Therapy: Design and Analysis. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58, 10 (2011).
  10. Li, D., et al. Negligible absorption of radiofrequency radiation by colloidal gold nanoparticles. J. Colloid Interf. Sci. 358, 47 (2011).
  11. Liu, X., Chen, H. J., Chen, X., Parini, C., Wen, D. Low frequency heating of gold nanoparticle dispersions for non-invasive thermal therapies. Nanoscale. (2012).
  12. Sassaroli, E., Li, K. C. P., O'Neill, B. E. Radio frequency absorption in gold nanoparticle suspensions: a phenomenological study. J. Phys. D App. Phys. 45, 075303 (2012).
  13. Worle-Knirsch, J. M., Pulskamp, K., Krug, H. F. Oops they did it again! Carbon nanotubes hoax scientists in viability assays. Nano Lett. 6, 1261 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics