عزل وتوصيف المواد الكيميائية من الدهن من البكتيريا سالبة الجرام

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

عزل وتوصيف الدهون ومجال عديد السكاريد الشحمي (LPS) من البكتيريا سالبة الجرام يوفر نظرة ثاقبة الآليات القائمة على سطح الخلية المقاومة للمضادات الحيوية، وبقاء البكتيرية واللياقة البدنية، وكيف كيميائيا الدهون المتنوعة والأنواع الجزيئية تعدل تفاضلي المضيف الاستجابات المناعية الفطرية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Henderson, J. C., O'Brien, J. P., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria. J. Vis. Exp. (79), e50623, doi:10.3791/50623 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

عديد السكاريد الشحمي (LPS) هو رئيسي جزيء سطح الخلية من البكتيريا سالبة الجرام، تترسب على النشرة الخارجي من طبقة ثنائية الغشاء الخارجي. ويمكن تقسيم LPS في ثلاثة مجالات: القاصي O-السكاريد، وهو قليل السكاريد الأساسية، والدهون والمجال تتكون من الدهون والأنواع الجزيئية وبقايا حمض ديوكسي 3-D-مانو أكتوبر-2-ulosonic (KDO). الدهون والمجال هو العنصر الوحيد الضروري لبقاء الخلية البكتيرية. التوليف التالية لها، والدهون غير معدلة كيميائيا في استجابة للضغوط البيئية مثل درجة الحموضة أو درجة الحرارة، لتعزيز المقاومة لمركبات المضادات الحيوية، والتهرب من الاعتراف من قبل وسطاء من الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة. بروتوكول التالية تفاصيل العزلة الصغيرة والكبيرة الحجم والدهون A من البكتيريا سالبة الجرام. ثم وتتميز المواد معزولة كيميائيا بواسطة طبقة رقيقة اللوني (TLC) أو مطياف الكتلة (MS). بالإضافة إلى مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين وقت لوضوء (MALDI-TOF) MS، ونحن أيضا تصف جنبا إلى جنب MS بروتوكولات لتحليل الدهون والأنواع الجزيئية باستخدام التأين electrospray (ESI) بالإضافة إلى الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) والإنحلال الضوئي فوق البنفسجية المستخدمة حديثا (UVPD) الأساليب. بروتوكولات MS دينا تسمح لتحديد لا لبس فيه من التركيب الكيميائي، أهمية قصوى لتوصيف جزيئات الدهون والتي تحتوي على التعديلات الكيميائية الفريدة أو الرواية. نحن أيضا وصف تسمية بالنظائر المشعة، والعزلة لاحقة، من الدهون (أ) من الخلايا البكتيرية لتحليلها من قبل TLC. نسبة إلى بروتوكولات يستند إلى MS-، TLC يوفر طريقة توصيف أكثر اقتصادا وسريع، ولكن لا يمكن أن تستخدم لتعيين بشكل لا لبس فيه الدهون والبنى الكيميائية دون استخدام معايير التركيبة الكيميائية المعروفة. على مدى العقدين الماضيين أدى عزل وتوصيف الدهون A إلى العديد من الاكتشافات المثيرة التي تحسنت فهمنا للعلم وظائف الأعضاء من البكتيريا سالبة الجرام، آليات المقاومات للمضادات الحيويةوقد وفرت اتجهت الاستجابة المناعية الفطرية الإنسان، والعديد من أهداف جديدة في تطوير مركبات مضادة للجراثيم.

Introduction

عديد السكاريد الشحمي (LPS) هو جزيء السطح الخارجي رئيسية من الكائنات سالبة الجرام تقريبا كل ويتكون من ثلاثة مجالات الجزيئية: أ-O مستضد السكاريد البعيدة، وهو قليل السكاريد الأساسية، والدهون المرتبطة الغشاء والمجال تترسب على النشرة الخارجي لل الغشاء الخارجي طبقة ثنائية 1،2. الدهون والمجال يتكون من 3 ديوكسي-D-مانو أكتوبر-2-ulosonic (KDO) المخلفات والدهون والأنواع الجزيئية، حيث الدهون ويمكن تعريفها بأنها جزء من كلوروفورم للذوبان من LPS على التحلل خفيفة حمض 1، 2. الدهون القياسية جزيء يمكن تعريفها كيميائيا بمثابة العمود الفقري diglucosamine هذا هو ومكرر فسفرته-acylated سداسي؛ متسقة مع الأنواع الدهنية والتي لوحظت في نموذج كائن كولاي (كولاي) 1،2. تسعة جينات أعرب جوهري، الحفظ في جميع أنحاء البكتيريا سالبة الجرام، هي المسؤولة عن إنتاج الدهون مجال (الشكل 1) 1،2. معظم البكتيريا لديها مجموعة إضافية من الجينات، التي تختلف في درجة الحفظ النشوء والتطور، التي تشارك في مزيد من التعديل الكيميائي للدهون A 3. نزع الفسفات، وإزالة السلاسل أسيل، وإضافة الأنصاف الكيميائية مثل السكريات الأمينية (على سبيل المثال aminoarabinose) و / أو phosphoethanolamine هي الأكثر شيوعا لوحظ الأنشطة (الشكل 1). يتم تنشيط العديد من الإنزيمات المسؤولة عن الدهون والتعديل مباشرة عن طريق إشارات البيئية، مثل الكاتيونات ثنائي التكافؤ، أو ينظم التعبير عنها من قبل اثنين من أنظمة الاستجابة منظم مكون 3.

وتتوسط الاعتراف الأنواع الدهون A من قبل المضيف نظام المناعة الفطرية التي تول مثل مستقبلات عامل التمايز 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) شارك في مستقبلات 4. قوات مسعور بين MD2 والدهون وسلاسل أسيل، وكذلك بين TLR4 و 'مجموعات الفوسفات 1 و 4 من الدهون وتعزيز علاقة قوية من الشفةمعرف A مع TLR4/MD2 4،5. التعديلات التي تغير حالة أسيلة أو شحنة سالبة من الدهون والدهون تأثير TLR4/MD2 يستند الاعتراف والتحفيز المصب من الاستجابة المناعية الفطرية تفعيل NF كيلوبايت وسطاء الالتهاب مثل TNFα وIL1-β 6،7. التعديلات التي تحجب شحنة سالبة من الدهون وأيضا منع جراثيم الببتيدات المضادة للميكروبات الموجبة من الربط إلى سالبة الجرام سطوح الخلايا 3،8. وافترض كثير من الدهون وتعديلات لزيادة اللياقة البدنية البكتيرية تحت ظروف بيئية معينة، مثل داخل المضيف الإنسان أو في مكانة الايكولوجية. لهذا السبب كثير من الإنزيمات تعديل أهدافا جذابة في تطوير عقلانية من المركبات المضادة للميكروبات. التنوع الكيميائي للهياكل الدهون A، فيما يتعلق الحي و / أو البيئة، والآثار البيولوجية من هذه الهياكل المتنوعة جعل توصيف الهيكلية من الدهون ومسعى هاما في روقال انه يدرس من البكتيريا سالبة الجرام.

عزل جزيئات الدهون A من البكتيريا كله ينطوي على استخراج LPS من سطح الخلية البكتيرية، وهي خطوة المائي لتحرير الدهون A، يليه إجراء تنقية النهائي 9-11. الإجراء استخراج LPS في معظم الأحيان واستشهد هو الإجراء استخراج المياه الساخنة الفينول، لأول مرة من قبل ويستفال جن 10. بعد تعرض استخراج LPS كله إلى خفيفة حمض المائي الذي يفصل كيميائيا KDO من الهيدروكسيل-6'من السكر الجلوكوزامين البعيدة من الدهون A (الشكل 1). وجود مطبات عديدة لإجراء المياه الساخنة الفينول بما في ذلك استخدام كاشف المخاطر العالية، يطلب ضرورة للحط من الأحماض المستخرجة التعاون النووي والبروتينات، وعدة أيام لاستكمال البروتوكول 10.

وقد مختبرنا تطويرها استخراج وعزل الدهون وكما وضعت أول من Caroff ورايتز وهو 12،13. مقارنة مع الإجراءات المياه الساخنة الفينول، وطريقة المقدمة هنا هي أكثر سرعة وكفاءة ويستوعب مجموعة واسعة من وحدات التخزين الثقافة من 5 مل ليتر متعددة. وعلاوة على ذلك، على عكس الاستخراج المياه الساخنة الفينول، أسلوبنا لا تحديد لأنواع السلس الخام أو من LPS، وتوفير الانتعاش الأمثل من أنواع الدهون A. في بروتوكول لدينا، يتم تنفيذ تحلل المواد الكيميائية من الخلايا البكتيرية كله باستخدام مزيج من الكلوروفورم والميثانول والماء، حيث يمكن مكعبات LPS بواسطة الطرد المركزي. وتستخدم مجموعة من التحلل خفيفة الحمضية والاستخراج بالمذيبات (بلاي-داير) لتحرير الدهون A من السكاريد المرفقة تساهميا. تم تطبيق أسلوب بليغ وداير أولا إلى استخراج أنواع الدهون من مجموعة متنوعة من الأنسجة الحيوانية والنباتية 14 أو تعديلها هنا لفصل السكاريد تحلل من الدهون A. في هذه الخطوة الانفصال النهائي، والكلوروفورم الدهون القابلة للذوبان تقسيم انتقائي في أقل العضوية المرحلة. لمزيد من تنقية الدهون A، عكس المرحلة أوأنيوني عمود التبادل اللوني يمكن استخدام 12.

بعد عزلة من نوع الدهون من الخلايا بأكملها، عددا من الأساليب التحليلية يمكن استخدامها لتوصيف التركيب الكيميائي للمواد المعزولة مثل الرنين المغناطيسي، TLC، وتحليل يستند إلى MS-. NMR يسمح للتوضيح الهيكلية غير مدمرة، ويقدم تفاصيل الهيكلية المتعلقة الروابط غليكوزيدية، الاحالة لا لبس فيه من مواقف سلسلة أسيل، وتعيين مواقع المرفقات للA التعديلات الدهون مثل aminoarabinose أو phosphoethanolamine 15-17. لم يتم مناقشتها تحليل NMR من الدهون وضمن بروتوكول لدينا، ولكن تم صفها على نحو كاف في أماكن أخرى 15،16. للتحليل السريع TLC استنادا تستخدم أساليب كثير من الأحيان، لكنه يفشل في تقديم معلومات مباشرة حول التركيبة الكيميائية غرامة. بروتوكولات MS تستند هي الطريقة الأكثر شيوعا المستخدمة لتوصيف والهياكل الدهون 18،19. المصفوفة المرتبطة الليزر الامتزاز التأين (MALDIوكثيرا ما يستخدم)-MS لمسح الأنواع في البداية سليمة الدهون A. يتم إنشاء الأيونات المشحونة منفردة من الحليلة أعدت وفقا للإجراءات استخراج لدينا. كما هو مطلوب التحليل البنيوي أكثر غرامة، على أساس أساليب MS / MS تكون أكثر إفصاحا من MALDI-MS. إلى جانب لالتأين electrospray (ESI) الدهون اتهم منفردة أو ضرب A أيونات السلائف هي مزيد مجزأة عن طريق الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) أو الإنحلال الضوئي فوق البنفسجية (UVPD)، لتوليد أيونات المنتج بالمعلومات هيكليا 18،20،21. وكثيرا ما ولدت أيضا المنتجات وفقدان محايدة من الدهون والأيونات السلائف خلال ESI-MS توفير طبقة إضافية من المعلومات الهيكلية.

وقد ثبت جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (MS / MS) لتكون وسيلة لا غنى عنها وتنوعا لتوضيح هياكل الدهون A. خلال MS / MS، يتم تنشيط أيونات لانتاج نمط تجزئة التشخيصية التي يمكن استخدامها لتوضيح هيكل أيون السلائف. لافا على نطاق واسعilable طريقة MS / MS هو CID. وتنتج هذه الطريقة الأيونات عبر جزء اصطدام السلائف أيون اختيارها بغاز خامل الهدف، مما أدى إلى ترسب الطاقة الذي يؤدي إلى التفكك. وقد ثبت CID أداة حاسمة في تخصيص الدهون هيكل لمجموعة واسعة من الأنواع البكتيرية 22-33.

على الرغم من أن إدارة البحث الجنائي هو الأكثر تنفيذا عالميا طريقة MS / MS، فإنه يولد مجموعة محدودة من الأيونات المنتج. 193 نانومتر UVPD هو البديل والتكميلي الأسلوب MS / MS. يستخدم هذا الأسلوب الليزر لأشرق الأيونات، وامتصاص الفوتونات النتائج في energization من الأيونات والتفكك اللاحقة. هذه الطاقة أعلى MS / MS تقنية تنتج مجموعة أكثر تنوعا من المنتجات من الأيونات CID وبالتالي يوفر أنماط تجزئة أكثر بالمعلومات. على وجه الخصوص، UVPD يتيح المعلومات حول التغييرات الطفيفة في أنواع الدهون وبناء على الانشقاقات في غليكوزيدية، أمين، أسيل وCC ربط السندات 18،21،34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وينبغي إعداد كل الحلول مع الماء عالى النقاء وHPLC الصف الميثانول والكلوروفورم. حلول أعد التي تحتوي على المذيبات العضوية مثل الميثانول، والكلوروفورم، أو البيريدين والأحماض المركزة أو قواعد ينبغي إعداد واستخدامها تحت غطاء الدخان الكيميائية. ويمكن تخزين جميع الحلول في RT. ينبغي قياس المذيبات في اسطوانة تخرج الزجاج وتخزينها في الزجاج والزجاجات مذيب مع السليكوون اصطف مباراة دولية. للتخزين على المدى الطويل يجب أن يتم تخزين المذيبات التي تحتوي على الكلوروفورم في ملون الزجاجات العنبر لتجنب إنتاج الفوسجين، كلوريد حمض شديدة التفاعل. يجب شطف الأنابيب السليكوون الطرد المركزي وقوارير المبخر الدوار مع الميثانول والكلوروفورم قبل الاستخدام. اتباع اللوائح اللازمة الاتحادية والولائية و/ أو التخلص من النفايات المؤسسية عند التخلص من المذيبات و / أو النفايات المشعة.

1. على نطاق واسع الدهن استخراج (50 مل إلى 1.5 L)

  1. إعداد مرحلة واحدة بليغ-داير خليط: كلوروشكل الميثانول-1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ودرجة الحموضة 7.4؛ 1:2:0.8 ت / ت). الجمع بين 200 مل من الكلوروفورم، 400 مل من الميثانول و 160 مل من برنامج تلفزيوني في 1 لتر زجاجة مذيب. زجاجة كأب وتخلط بواسطة قلب (> 30X). ترخي الغطاء بشكل دوري خلال خلط للتنفيس وتخزين مختومة.
  2. إعداد معايرتها قبل مرحلتين بليغ-داير خليط كلوروفورم: الميثانول: المياه (2:2:1.8 ت / ت). الجمع بين 400 مل من الكلوروفورم، 400 مل من الميثانول و180 مل من الماء في زجاجة 1 لتر المذيب. غطاء زجاجة وتخلط بواسطة انقلاب، والتأكد من أن ترخي غطاء دوريا خلال خلط للتنفيس. دعونا تتوازن O / N وتخزين مختومة.
  3. إعداد خفيفة التحلل حمض العازلة (50 ملي خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.5، 1٪ دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)). ل500 مل من العازلة خفيفة التحلل الحامض، يزن 2.05 غرام من خلات الصوديوم ونقل إلى دورق 500 مل. إضافة الماء إلى وحدة تخزين من ~ 350 مل ويحرك، ثم يضاف 50 مل من 10٪ SDS. خلط وضبط درجة الحموضة إلى 4.5، ونقل إلى الاسطوانة، وإضافة الماء إلى 500 مل.
  4. إعدادالكلوروفورم: الميثانول (4:1، ت / ت): قياس 100 مل من الكلوروفورم ونقلها إلى زجاجة مذيب. قياس 25 مل من الميثانول وتخلط مع الكلوروفورم. تخزين في العنبر زجاجة.
  5. تطعيم 5 مل من وسائل الإعلام (مرق لوريا أو غيرها) من مستعمرة بكتيرية واحدة. تنمو O / N عند 37 درجة مئوية، أو في حاجة ° C للنمو. ويظهر رسم تخطيطي لإجراء الاستخراج في الشكل 2.
  6. في اليوم التالي، وقياس OD 600 واستخدام ثقافة 5 مل O / N لتطعيم 200 مل من ثقافة إلى OD بدءا من 600 0.05. تنمو الخلايا حتى يتم OD يتم التوصل إلى 600 من 0.8-1.0.
  7. خلايا الحصاد عن طريق الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة. يدور أطول قد تكون هناك حاجة لسلالات أن بيليه سيئة. تخلصي من طاف وسائل الإعلام.
  8. غسل بيليه الخلية مع 50 مل من الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS). تكرار الطرد المركزي لبيليه الخلايا. تخلصي من طاف بيليه الخلية وتخزينها في -20 درجة مئوية، أو انتقل إلى الخطوة 1.9.
  9. خلايا resuspend في 40 ملمن برنامج تلفزيوني 1X والفجوة بين اثنين 250 مل أنابيب الطرد المركزي السليكوون (الغلة 20 مل من تعليق خلية / أنبوب). إضافة 25 مل من الكلوروفورم والميثانول 50 مل من كل أنبوب، لمرحلة واحدة بليغ-داير (كلوروفورم: الميثانول: الماء؛ 1:2:0.8 ت / ت) (الشكل 2). مزيج من قبل انقلاب واحتضان على RT ل> 20 دقيقة كاملة لضمان تحلل الخلية.
  10. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 2،000 x ج لمدة 20 دقيقة. سوف LPS بيليه جنبا إلى جنب مع البروتينات والأحماض النووية (الشكل 2)، ومع ذلك، سوف الدهون الفوسفاتية والدهون isoprenyl، والببتيدات مسعور صغيرة تبقى في طاف. تجاهل طاف.
  11. غسل بيليه مع LPS ~ 100 مل مرحلة واحدة بليغ-داير الخليط. أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 20 دقيقة. تجاهل طاف. عندما عزل الدهون A من E. كولاي أو السالمونيلا، مطلوب غسل واحد فقط، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى خطوات غسل إضافية للحد من التلوث فوسفورية عندما عزل الدهون A من بعض الكائنات الحية.
  12. إضافة 27 مل من ميلحمض دينار عازلة المائي (50 ملي خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.5، 1٪ SDS، وانظر الخطوة 1.3) لLPS بيليه، ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا حتى تبقى فقط جزيئات صغيرة. يصوتن ل resuspend متجانس LPS بيليه في حل مع تلميح التحقيق sonicator في دورة العمل المستمر لمدة 20 ثانية في إخراج 50٪. تكرار صوتنة من 2X العينة (20 ثانية / انفجار، ~ 5 ثانية بين رشقات نارية).
  13. عينات يغلي في حمام مائي لمدة 30 دقيقة. تحذير: تأكد من قبعات ضيقة، ولكن ليس مختومة بالكامل. بعض الكائنات الحية، مثل ضمة الكوليرا (ضمة الكوليرا) تتطلب مرات حضانة أطول (1 ساعة) لزيادة العائد الكلي من الدهون A. إزالة زجاجات من الحمام المائي والسماح لتبرد العينة إلى RT قبل المتابعة.
  14. لاستخراج الدهون بعد التحلل، وتحويل الحل SDS إلى مرحلتين بليغ-داير (الشكل 2) خليط بإضافة 30 مل من الكلوروفورم والميثانول 30 مل من، لكلوروفورم: الميثانول: المياه (2:2:1.8، والخامس / ت) خليط. مزيج من قبل انقلاب وأجهزة الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقيقة في 2،ز × 000. استخراج مرحلة انخفاض في السليكوون أنبوب الطرد المركزي نظيفة باستخدام ماصة الزجاج.
  15. إجراء استخراج الثانية بإضافة 30 مل من المرحلة الدنيا من قبل معايرتها مرحلتين بليغ-داير الخليط (الخطوة 1.2)، إلى المرحلة العليا من الخطوة 1.14. المزيج، ثم الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 10 دقيقة. استخراج مرحلة أقل، وتجمع مع المرحلة أقل باستخراج في الخطوة 1.14.
  16. غسل مراحل أقل المجمعة (60 مل الكل) بإضافة 114 مل من معايرتها قبل مرحلتين بليغ-داير المرحلة العليا (الخطوة 1.2) لإنشاء مرحلتين بليغ-داير خليط (كلوروفورم: الميثانول: الماء؛ 02:02: 1.8، ت / ت). المزيج. أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 10 دقيقة.
  17. إزالة مرحلة أدنى إلى كوب نظيف الدوارة قارورة المبخر والعينة الجافة باستخدام التبخر الدوارة (الشكل 2).
  18. إضافة 5 مل من الكلوروفورم: الميثانول (4:1، ت / ت) إلى قارورة الدوارة، وحمام يصوتن (> 30 ثانية) للمساعدة في وقف الدهن من الجانبين من القارورة. استخدام ماصة نقل الزجاج لنقل الدهون لنظيفأنبوب زجاجي (13 × 100 مم أو أكبر) توج مع السليكوون اصطف الفينولية قبعات المسمار. عينة الجافة تحت تيار من النيتروجين باستخدام مجفف النيتروجين.
  19. في resuspend الدهون المجففة في 1 مل من الكلوروفورم: الميثانول (4:1، ت / ت). نقل إلى قارورة صغيرة عينة الزجاج (12 × 32 ملم) مع وجود قاعدة مدبب لمزيد من إعادة تعليق الكمي باستخدام كميات صغيرة (انظر الجدول المعدات / الكواشف). تجف باستخدام مجفف النيتروجين.
  20. ويمكن تخزين العينة المجففة في -20 درجة مئوية حتى لاحقة TLC (بروتوكول 2) أو MS تحليل (بروتوكول 3، 4، 5 أو). (ملاحظة: يقترح المبلغ من مادة معزولة واستخدامها في البروتوكولات اللاحقة على أساس ما هو كاف بالنسبة لمعظم الكائنات الحية يمكن استخدام نموذج الدهون في نفس البروتوكولات 2-5، مع ملاحظة المواد٪ إزالة انظر مناقشة لمزيد من التفاصيل.).

2. التصور من الدهون وأنواع عبر طبقة رقيقة اللوني

  1. إعداد نظام الطور المتحرك TLC المذيبات (كلوروفورم: البريدين: حمض الفورميك 88٪: المياه؛ 50:50:16:5 ت / ت). COMBINه 200 مل من الكلوروفورم، 200 مل من البيريدين، 64 مل من حمض الفورميك 88٪، و 20 مل من الماء في زجاجة 1 لتر المذيب. زجاجة كأب، ومزيج من قبل انقلاب عدة مرات، وتنفيس.
  2. استخدام خزان TLC من شأنها أن تستوعب 20 × 20 سم لوحات. خط خزان TLC مع ~ الورق 40 سم اللوني.
  3. إلى خزان TLC إضافة 200 مل من الكلوروفورم: البريدين: 88٪ حمض الفورميك: المياه (50:50:16:5، ت / ت) خليط. السماح للدبابات إلى ما قبل تتوازن ل> 3 ساعة، وغالبا ما يفضل O / N وأكثر ملاءمة.
  4. إزالة الدهون عينات مجففة من الثلاجة (الخطوة 1.20) والسماح الحار RT.
  5. بشفرة الحلاقة إزالة السيليكا من الحافة العلوية من هلام السيليكا TLC 60 لوحة. باستخدام قلم رصاص مملة، ورسم خط مواز إلى أسفل لوحة، 2 سم من أسفل. هذا الخط هو الأصل لاكتشاف العينات. علامة بزيادة طول هذا الخط إشارة إلى بقعة عينات 1 سم عن بعضها البعض.
  6. تذوب الدهون المجففة من الخطوة 2.4 في 200 ميكرولتر من كلوروفورم: الميثانول (4:1، ت / ت)، دوامة ويصوتن (3X، ~ 15 ثانية لكل منهما)، والمحاصيل ~ 100 -500 نانوغرام / ميكرولتر الدهون المستخرجة من A إذا E. القولونية.
  7. باستخدام الماصة الزجاج microcapillary، بقعة واحد على عشرة من حجم (20 ميكرولتر) على لوحة TLC كما تميزت في الخطوة 2.5. تسمح عينات للهواء الجاف على TLC لوحة ل~ 15 دقيقة. (ملاحظة: العينات في قوارير زجاجية صغيرة يمكن أن تجفف باستخدام مجفف النيتروجين وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا في بروتوكولات 3-5 يحيط علما مواد إزالة٪).
  8. وضع TLC لوحة تحتوي على عينات رصدت في خزان معايرتها مسبقا. بعد أن يصل جبهة المذيب الجزء العلوي من لوحة TLC (~ 2.5-3 ساعة)، وإزالة لوحة والهواء الجاف (> 60 دقيقة). بندقية الهواء البارد يمكن استخدامها لضمان جفاف كاملة.
  9. بينما لوحة يتم تجفيف، بدوره على طبق ساخن عند 250 درجة مئوية لمدة تفحيم.
  10. في التهوية غطاء الدخان الكيميائية، وإعداد 10٪ حمض الكبريتيك مزيج الإيثانول لتفحيم الدهون تحل على لوحة السيليكا TLC (حمض الكبريتيك المركز: الإيثانول بنسبة 100٪؛ 01:09 ت / ت). قياس 10 مل من حمض الكبريتيك وإضافة ببطء إلى 90 مل من الإيثانول بنسبة 100٪. رعايةمزيج بالكامل ونقلها إلى كوب الكروماتوغرافي كاشف رذاذ.
  11. في غطاء الدخان، واستخدام الزجاج الكروماتوغرافي كاشف رذاذ للرش لوحة TLC المجفف مع 10٪ الكبريتيك مزيج حمض الايثانول. رش الخليط بالتساوي في جميع أنحاء اللوحة.
  12. وضع لوحة TLC على 250 درجة مئوية لوحة الساخن حتى تظهر عينات الدهون متفحمة كما / بقع بنية اللون الأسود (<1 دقيقة). لا إفرط في التعريض لوحة، وهذا سوف يسبب لوحة كاملة لتحويل البني وجعل التصور من الأنواع الدهنية وصعبة.

3. توصيف الهيكلية من الدهون A-TOF MALDI عبر الطيف الكتلي

  1. من الخطوة 1.20، (أو الخطوة 2.7) إزالة الدهون عينة من الفريزر والسماح الحار RT. في resuspend الدهون المجففة عينة في ~ 20 ميكرولتر كلوروفورم: الميثانول (4:1، ت / ت) ودوامة الحصول على ~ 1-5 ميكروغرام / ميكرولتر الدهون الحل إذا المستخرجة من E. القولونية. (ملاحظة: 10٪ أقل تركيزا إذا المواد المستخدمة من الخطوة 2.7).
  2. إعداد مكونات المصفوفة ATT. مشبعة 6 عزة-2-thiothymine في 50٪ أسيتونتريل: إضافة 500 ميكرولتر من المياه و 500 ميكرولتر من أسيتونتريل إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، ثم قم بإضافة> 10 ملغ 6 ازا-2-thiothymine بحيث أسيتونتريل 50٪ هو السوبر المشبعة. المشبعة ثلاثى سترات الأمونيوم الحل: إضافة> 1 ملغ إلى 500 ميكرولتر المياه، ينبغي أن يكون واضحا يعجل بسهولة. دوامة الطرد المركزي والحلول قبل الاستخدام، ويستخدم طاف المشبعة فقط.
  3. إعداد مصفوفة خليط ATT: المشبعة 6 ازا-2-thiothymine في 50٪ أسيتونتريل، سترات الأمونيوم المشبعة ثلاثى (20:01، ت / ت). خلط مكونات المصفوفة معا عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من الحل ATT إلى 1 ميكرولتر المشبعة ثلاثى حل سيترات الأمونيوم في 500 ميكرولتر أنبوب microcentrifuge، دوامة خلط، وأجهزة الطرد المركزي قبل تطبيق لوحة MALDI.
  4. إعداد لوحة MALDI بإضافة 0.5 ميكرولتر مزيج calibrant إلى لوحة MALDI على بقعة قرب حيث سيتم إيداع العينات، لتوفير أدق الشامل تهمة / تقرير النسبة.
  5. إيداع 0.5 ميكرولترمن ATT مصفوفة على لوحة MALDI على كل بقعة حيث سيتم إيداع الدهون عينة.
  6. إيداع 0.5 ميكرولتر من العينة (2.5٪ من إجمالي العينة) على بقعة من ATT مصفوفة، لخلط على لوحة، والحصول على أطياف من قبل عينة المسح لإشارات أيون الأمثل (الشكل 3). ملاحظة: المبالغ لمعظم الأمثل MS إشارة يمكن أن تختلف مع الكائن الحي ويجب أن يتم تحديد تجريبيا. لإضافة المزيد من المواد يمكن للمرء أن بقعة 0.5 ميكرولتر عدة مرات السماح خليط رصدت لتجف بين إضافة المزيد من العينة. ويمكن أيضا أن تتركز العينة (الجافة وresuspend في حجم أصغر) أو تضعف عند الضرورة. ويمكن أيضا أكثر انطلاق المواد (حجم بدءا ثقافة الخلية) أن تستخدم (انظر مناقشة).

4. قداس الطيف Electrospray التأين وتصادم المستحثة تفكك الدهون و

  1. إعداد الكلوروفورم: الميثانول خليط المذيبات (1:1، ت / ت) عن طريق خلط مخزون 200 ميكرولتر من HPLC الصف الميثانول مع 200 مل HPLC الصف الكلوروفورم في سول الزجاجتنفيس زجاجة.
  2. نقل 200 ميكرولتر من كلوروفورم: الميثانول خليط المذيبات إلى القارورة مع الدهون A (على سبيل المثال من الخطوة 1.20، 2.7، أو المجففة بعد بروتوكول 3) ويصوتن الدهون حل لمدة 5 دقائق أو حتى يذوب جميع المواد.
  3. إعداد مطياف الكتلة لوضع السلبية التأين electrospray.
  4. باستخدام حقنة 250 ميكرولتر وضخ حقنة، ولبث مباشرة الدهون المخففة عينة بمعدل تدفق 2،0-3،5 ميكرولتر / دقيقة.
  5. تحسين وتعزيز الدهون إشارة أيون عن طريق ضبط البصريات أيون. ويمكن الآن لكامل الطيف الكتلي يتم جمعها من الدهون والأنواع (الشكل 4).
  6. عزل وتفعيل الهدف الدهون A عن طريق تحديد CID كأسلوب MS / MS.
  7. زيادة الجهد CID (أو طاقة الاصطدام تطبيع، NCE) حتى الدهون السلائف والأنواع هي الوفرة النسبية حوالي 10٪ مقارنة مع أعلى ايون المنتج.
  8. اكتساب ومتوسط ​​الأطياف حتى يتحقق يكفي الإشارة إلى الضوضاء عن الالأيونات المنتجات الإلكترونية. عدد بالاشعة حاجة تعتمد على كثافة إشارة من السلائف الأصلي ويمكن أن تتراوح 3-300 بالاشعة (الشكل 5A).

5. MS / MS على الدهن بواسطة الأشعة فوق البنفسجية الإنحلال الضوئي

  1. تحضير العينة ومطياف الكتلة كما في الخطوات 4،1-4،5.
  2. بدوره على الليزر ربطه إلى مطياف الكتلة. تم تجهيزه مطياف الكتلة مع 193 نانومتر الهيجان الليزر وتعديلها لتسمح للأشعة فوق البنفسجية في تفعيل الخلية HCD الصك. تم تنفيذ الإنحلال الضوئي بطريقة مماثلة لتلك التي سبق وصفها 35. نستخدم متعددة فراغ تعديل مع نافذة البصرية الكاف 2 لنقل الفوتونات في الطاقة أعلى C-فخ التفكك (HCD) الخلية. يتم تشغيل الليزر خلال MS / MS من خلال منطق الترانزستور الترانزستور (TTL) إشارة من مطياف الكتلة لمولد النبض / تأخير.
  3. إعداد البرنامج أداة بحيث الليزر سوف يؤدي يزر عندماالأيونات دخول الخلية HCD. وهذا يتطلب تعديل متواضعة من البرنامج.
  4. تشغيل مولد النبض مثل أن الليزر هو نابض كل 2 ميللي ثانية (500 هرتز).
  5. عزل الدهون A أيون السلائف من خلال تحديد HCD كطريقة MS / MS وضبط الطاقة الاصطدامية إلى 1٪ NCE. وهذا يسمح للعزل أيونات أولية لتفارق فوق البنفسجية داخل الخلية HCD. على الرغم من أن يتم استخدام الخلايا HCD، يتم تعديل البرنامج لأداء UVPD خلال هذه الفترة.
  6. تفعيل الدهون معزولة A أيون عن طريق زيادة طاقة الليزر وضبط عدد من نبضات الليزر. سيتم تنفيذ تجربة نموذجية باستخدام عشرة UVPD 6 مل البقول.
  7. كما في الخطوة 4.8، والحصول على متوسط ​​الأطياف حتى يتحقق الضوضاء إشارة إلى ما يكفي لأيونات المنتج UVPD. عدد بالاشعة حاجة تعتمد على كثافة إشارة من السلائف الأصلي ويمكن أن تتراوح 3-300 بالاشعة (الشكل 5B).

6 32 P-صفهامن الدهن والعزلة اللاحقة

  1. تطعيم 5 مل من وسائل الإعلام (مرق لوريا أو وسائل الإعلام الأخرى) من مستعمرة واحدة. تنمو O / N عند 37 درجة مئوية أو على درجة الحرارة المطلوبة.
  2. في اليوم التالي، وقياس OD 600 واستخدام الثقافة O / N لتطعيم 7 مل من ثقافة إلى OD بدءا من 600 ~ 0.05، ونمت في معيار 20 × 150 ملم الزجاج القابل للتصرف أنبوب الثقافة. إضافة 2.5 μCi / مل من غير العضوية 32 P. تنمو الخلايا حتى يتم OD يتم التوصل إلى 600 من 0.8-1.0. يرجى اتباع الاتحادية وحكومات الولايات، و / أو المبادئ التوجيهية المؤسسية لأمان المناولة والسليم للمواد المشعة.
  3. خلايا الحصاد في 16 × 125 ملم أنابيب الطرد المركزي الزجاج مع السليكوون اصطف غطاء باستخدام أجهزة الطرد المركزي السريرية زاوية ثابتة في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف في حاوية النفايات المشعة المناسبة. يجب التخلص من جميع النفايات المشعة (مثل السائل والزجاج واقية) ولدت في الخطوات اللاحقة وفقا للدولة اتحادية، و / أو واجهة المستخدم الرسومية المؤسسيةdelines.
  4. غسل بيليه الخلية مع 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS). أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1،500 ز س. تجاهل طاف.
  5. خلايا resuspend في 5 مل من مرحلة واحدة بليغ-داير خليط (الشكل 2)، ويتألف من كلوروفورم: الميثانول: المياه (1:2:0.8، ت / ت). دوامة لخلط، واحتضان على RT ل> 20 دقيقة كاملة لضمان تحلل الخلية.
  6. أجهزة الطرد المركزي في أجهزة الطرد المركزي السريرية في 1،500 x ج لمدة 20 دقيقة. تصب بلطف طاف، والذي يحتوي على الدهون الفوسفاتية والدهون isoprenyl.
  7. resuspend الكرية LPS في 1.8 مل من 50 ملي خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.5، 1٪ SDS العازلة من قبل vortexing. يصوتن العينة باستخدام sonicator حمام حتى يتم فرقت بالتساوي بيليه (~ 30 ثانية).
  8. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة في حمام ماء يغلي. جعل متأكد من قبعات ضيقة ولكن ليس مختومة.
  9. إزالة من حمام الماء والسماح لتبريد العينة على RT لمدة 5-10 دقيقة.
  10. تحويل الحل إلى مرحلتين بليغ-داير الخليط بإضافة 2 مل من الكلوروفورم و 2 مل منالميثانول، مما أسفر عن الكلوروفورم: الميثانول: مائي (2:2:1.8 ت / ت) خليط. دوامة لخلط، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في أجهزة الطرد المركزي السريرية في 1،500 x ج لمراحل منفصلة.
  11. استخراج مرحلة انخفاض في أنبوب زجاجي نظيف الطرد المركزي باستخدام ماصة الزجاج (استخراج أول).
  12. إجراء استخراج الثانية على العينة بإضافة 2 مل من معايرتها قبل مرحلتين بليغ-داير المرحلة الدنيا (أعد كما في الخطوة 1.2) إلى المرحلة العليا المتبقية من الخطوة 11. دوامة وأجهزة الطرد المركزي 10 دقيقة. إزالة المرحلة الدنيا وتتحد مع المرحلة أقل من استخراج الأولى.
  13. إلى انخفاض مرحلة تجميع (~ 4 مل الحجم الكلي)، إضافة 7.6 مل من قبل معايرتها المرحلة العليا (الخطوة 1.2)، مما أسفر عن مرحلتين بليغ-داير حل (كلوروفورم: الميثانول: الماء؛ 2:2:1.8، والخامس / ت). دوامة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة.
  14. إزالة مرحلة أدنى إلى أنبوب زجاجي نظيفة وجافة باستخدام مجفف النيتروجين. ويمكن تخزين العينات المجففة في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

7. Visualiاالنترنت من 32 ف المسمى الدهن الأنواع عبر طبقة رقيقة اللوني

  1. إعداد 32 ف المسمى الدهون عينة، خزان TLC، وألواح TLC كما هو موضح في الخطوات 2،1-2،8.
  2. حل 32 ف المسمى عينة في 500 ميكرولتر 4:1 كلوروفورم الميثانول (ت / ت). دوامة وحمام يصوتن لإذابة الدهون تماما المواد. إضافة 5 ميكرولتر من عينة لالتلألؤ قارورة تحتوي على 5 مل من التلألؤ كوكتيل. عد في عداد التلألؤ وحساب التهم الكل / دقيقة من العينة.
  3. عندما تصور أنواع الدهون رديولبلد، 10 × 20 سم أو 20 × 20 سم لوحات TLC يمكن استخدامها. لوحات 10X20 سم، ينبغي أن رصدت عينات على طول المنشأ ملحوظ في الخطوة 2.5 بحيث أطول لوحة البعد هو العمودي (أي عينات رصدت في الأصل علامة 2 سم فوق 10 سم الحافة).
  4. باستخدام ماصة microcapillary، بقعة 10،000-20،000 نسخة في الدقيقة / عينة على لوحة والسماح لتجف البقع (> 15 دقيقة). قد تحتاج العينات إلى التركز من خلال تجفيف تحتالنيتروجين ومعلق في حجم مناسب، لتحقيق 10،000-20،000 التهم / دقيقة / بقعة (2 ميكرولتر ميكرولتر أو 2 في وقت ل<10 ميكرولتر المجموع).
  5. وضع TLC لوحة تحتوي على عينات رديولبلد في خزان معايرتها مسبقا. بعد أن يصل جبهة المذيب الجزء العلوي من لوحة TLC (~ 3 ساعة)، وإزالة لوحة والهواء الجاف (> 60 دقيقة). الحذر: لوحات TLC تشغيل في وجود البيريدين يجب أن تجفف جيدا في غطاء الدخان الكيميائية، وكميات ضئيلة من البريدين يمكن أن تلحق الضرر شاشات phosphorimaging. بندقية الهواء البارد يمكن استخدامها لضمان جفاف كاملة.
  6. التفاف لوحة في غلاف بلاستيكي وفضح لشاشة phosphorImager في تصوير الإشعاع الذاتي كاسيت O / N. في صباح اليوم التالي، مسح الشاشة للحصول على الصورة (الشكل 6). باستخدام صورة برمجيات تحليل كثافة، ويسمح هذا الأسلوب للدقيقة، الكمي النسبية للأنواع الدهون A.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الكنسي الدهون ألف من E. كولاي والسالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية هو ديساكهارايد-acylated سداسي الجلوكوزامين مع مجموعات الفوسفات في 1 - 4 و'المواقف. خلال النمو في وسائل الإعلام الغنية (مثل لوريا مرق) جزء من الدهون ويحتوي على مجموعة بيروفوسفات في موقف 1 مما أسفر عن الأنواع تريس فسفرته 36 (الشكل 1). KDO (3-ديوكسي-D-مانو octulosonic حامض)، ويرد على الهيدروكسيل-6'وبمثابة جسر لربط الدهون والكربوهيدرات إلى المجالات المتبقية (أي قليل السكاريد الأساسية والمجالات O-مستضد) من LPS. على الرغم من أن البكتيريا سالبة الجرام مشاركة مسار الحفظ عن الدهون والحيوي مماثلة لتلك التي E. القولونية K-12، وهناك كمية كبيرة من التنوع في الهياكل الدهون A. ينشأ هذا التنوع من عمل انزيمات الكامنة التي بتعديل هيكل الدهون، والتي يتم تفعيلها في الاستجابة للمؤثرات البيئية. لأمثلجنيه، في S. يمكن تعديل الملهبة للمجموعات الفوسفات من الدهون والسكر مع الموجبة L-4-aminoarabinose (الشكل 1، أزرق) أو مع بقايا phosphoethanolamine (الشكل 1؛ أرجواني). في السالمونيلا يتم تنظيم هذه التعديلات من قبل أنظمة منظم استجابة ثنائي مكون، وأضاف ردا على انخفاض [2 ملغ +]، خفيفة الحمضية درجة الحموضة، ووجود الببتيدات المضادة للميكروبات الموجبة. بالإضافة إلى ذلك في السالمونيلا، ويمكن أن يضاف بالميتات لتشكيل-acylated سباعي الدهون A، الذي يعزز مقاومة الببتيدات المضادة للميكروبات الموجبة (الشكل 1؛ الأخضر) 8. وتشمل التعديلات الأخرى، ولكن لا تقتصر على، وإزالة مجموعات الفوسفات وسلاسل أسيل، أو دي أكسيجيناز المحفزة إضافة مجموعة الهيدروكسيل إلى سلسلة أسيل الثانوية المرتبطة 3'وحظ في عدد من الكائنات الحية 1،3.

عزل سليمة من خلايا الدهون وكله عن طريق تعديل لدينا من طريقة كارويوصف وما يليها ورايتز وهو في البروتوكول 1 (الشكل 2). وقد استخدمت هذه الطريقة لتقدير العزلة أن 10 6 جزيئات الدهون وتوجد في الخلية البكتيرية من E. القولونية 37. البروتوكولات التالية 1 و 3، والأيونات السالبة MALDI-TOF الطيف الكتلي من الدهون A من E. القولونية K-12 (W3110) تعطي أيون deprotonated منفردة ([MH] -) في م / ض 1،796.20 كنوع وحظ مجورلي (الشكل 3). تم إجراء MALDI-TOF MS في وضع السلبية reflectron لتحسين القرار الطيفية. بدلا من ذلك، نفس العينة الدهون تعرض إلى وضع سلبي نانو ESI (البروتوكول 4) ينتج في الغالب deprotonated مضاعفة الدهون والأيونات في م / ض 898.1 الرمز بواسطة [M-2H] 2 - (الشكل 4). deprotonated منفردة الدهون والأيونات [MH] - في م / ض 1،796.20 يمكن ملاحظتها، ولكن هي من الوفرة النسبية أقل إلى [M-2H] 2 - الأيونات (الشكل 4). اتهم الأنواع تتكاثر predomiنيت عند استخدام ESI. تم تنفيذ تجزئة من قبل إدارة البحث الجنائي (الشكل 5A) أو 193 نانومتر UVPD (الشكل 5B) على [MH] - الدهون A أيون م / ض 1،796.20. هذه التقنيات يمكن أن تستخدم لتعيين أفضل البنى الكيميائية، وخاصة الأنواع التي تحتوي على الدهون وتركيبات معقدة من تعديلات أو التعديلات الكيميائية uncharacterized سابقا. وتظهر ملامح تجزئة مع الخطوط المتقطعة تمثل مواقع الانقسام والمتطابقة مع القيم م / ض أدناه كل بنية المقدمة (الشكل 5). سلط الضوء على القيم م / ض ومواقع انشقاق في الخط الأحمر تمثل أيونات منتج فريد من نوعه المرتبطة UVPD.

كما هو موضح في البروتوكولات 6 و 7 و 32 من المادة الدهنية المسماة P-A معزولة عن اثنين من مختلف E. تم تحليل القولونية K-12 سلالات من قبل TLC (الشكل 6). W3110 معظمها يحتوي على مكرر تريس، وفسفرته الدهون A (الشكل 6؛ حارة اليسار)، في حين لوحظ وجود نمط TLC أكثر تعقيدا مع 32 P-A الدهون معزولة عن E. سلالة القولونية WD101 (الشكل 6؛ الممر الأيمن) 38. WD101 تنتج الدهون وتعديل بشكل كبير مع aminoarabinose (L-Ara4N) وphosphoethanolamine (بيتين). لأن كلا من 1 - 4 و'- الفوسفات هي متاحة للتعديل، والدهون من WD101 يمكن وصفها بأنها تعديل منفردة، تحتوي فقط L-Ara4N واحد أو بيتين في أي الفوسفات، أو مضاعفة معدلة حيث يتم تعديل كل من الفوسفات بطريقة اندماجي. بالإضافة إلى التعديل في 1 - و 4 '- الفوسفات، بالإضافة إلى ذلك لوحظ بالميتات أيضا (انظر الشكل 1)، ويزيد من قيمة و R الأنواع الدهون (أ) في هذا النظام المذيبات (الشكل 6). إذا رغبت في ذلك، وتحليل كثافة استخدام phosphorimager، يمكن أن تستخدم لتقدير كميات كميا النسبية للأنواع الدهون وضمن نفس العينة.

س: together.within المحافظة على صفحة = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. الدهون ممثل والهياكل المجال من E. القولونية K-12 و S. الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية. يتم عرض التعديلات على الدهون بنية الحفظ (يمين)، كما هو موضح في نتائج الممثل. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 2
الشكل 2. التخطيطي من الدهون والعزلة الإجراء. المخطط يصور تحلل المواد الكيميائية من بيليه الخلية البكتيرية باستخدام مرحلة واحدة بليغ-داير الخليط، الطرد المركزي من المحللة لتكوير LPS، خفيفة و إدارة البحث الجنائي المائي لتحرير الدهون A من السكاريد المرفقة، وتنقية النهائي من الدهون وباستخدام اثنين من مرحلة استخراج بليغ-داير. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 3
الرقم 3. تحليل MALDI-MS من الدهون ومعزولة عن E. القولونية K-12 (W3110). الأطياف الحصول عليها من المتوسط> 300 الطلقات. اتهم منفردة [MH] - لوحظ الدهون A ك أيون الجزيئية في م / ض 1،796.2، والتي تتطابق مع الأنواع deprotonated هيكل معروض على حق.

0623/50623fig4.jpg "/>
الشكل 4. تحليل ESI-MS من الدهون ومعزولة عن E. القولونية K-12 (W3110) فرديا [MH] واتهم مضاعف [M-2H] 2 - لوحظ الأنواع الدهنية وكما أيونات الجزيئي للم / ض و1،796.2 م / ض 898.1، على التوالي.

الرقم 5
الرقم 5. تحليل MS / MS من الدهون ومعزولة عن E. واستخدمت القولونية K-12 (W3110). تفارق التصادم الناجم (A) أو الإنحلال الضوئي فوق البنفسجية (B) لتفتيت السلائف أيون م / ض 1،796.2. يشار إلى أيونات منتج معين UVPD باللون الأحمر. ويرد خريطة تجزئة (C)، حيث انطلق أسود خطوط تشير إلى تجزئة يرتبط مع كل من إدارة البحث الجنائي وUVPD، وأحمر متقطع خطوط تشير UVPD جمعية مهندسي البترولتجزئة cific. القيم المدرجة تحت الخريطة تجزئة تتوافق مع الجماهير الدقيق لل[MH] - أيونات المنتج انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 6
الرقم 6. الفصل المبني TLC من الأنواع الدهنية ومعزولة عن E. القولونية K-12 32 ف المسمى الدهون وتم عزل من W3110 (حارة اليسار) أو WD101 (حارة اليمين) وفصل في نظام المذيبات التي تحتوي على خزان TLC الكلوروفورم: البريدين: 88٪ حمض الفورميك: المياه (50:50:16 : 5 ت / ت).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول قمنا المفصل عزلة هناك أنواع الدهون من الخلايا كاملة من البكتيريا، ووصف TLC أو الأساليب التحليلية القائمة على MS لتوصيف هذه المواد كيميائيا معزولة. جنبا إلى جنب مطياف الكتلة هو استراتيجية قوية لدي نوفو توصيف الهيكلية من المركبات البيولوجية، ولا تقدر بثمن لتوصيف الكيميائية للغطاء واق من جزيئات الدهون لوحظت في الطبيعة. CID وUVPD طريقتان تفعيل التكميلية التي تخلق أنواع مختلفة من أيونات المنتجات التي توفر بصمات الرئيسية للدهون والجزيئات. MS / MS تجزئة باستخدام كل من إدارة البحث الجنائي وUVPD يسمح استجلاء الفروق الدقيقة من هياكل الدهون A، وتوفير أدق التفاصيل لمهام التركيب الكيميائي. ضرورية بيانات من هذا النوع لإقامة علاقات هيكل المتعلقات / وظيفة محددة في علم الأحياء من الدهون والأنواع الجزيئية. وصفناها أيضا إجراء 32 نوعا A-الدهون radiolabeling P في لياليالثقافات البكتيرية مول النطاق، حيث يمكن تصور نمط الكيميائية من 32 نوعا ف الدهون وباستخدام TLC وتصوير الإشعاع الذاتي.

هناك عدد من الميزات لهذا البروتوكول أن أي مستخدم يجب أن تكون على علم. لواسعة النطاق الدهون والاستعدادات (بروتوكول 1)، ويمكن أن يكون الأمثل نسبة بدءا المذيبات لكمية بيليه البكتيرية لتحسين العائد الكلي. ولكن هذه النسبة لا يمكن تحديدها إلا تجريبيا. المبالغ المبينة في هذا البروتوكول يمثل نقطة انطلاق جيدة لمعظم سلالات البكتيريا. ويمكن أيضا كميات الدهون والثقافة لاستخراج والعزلة تعديلها تبعا لسلالة بكتيرية كنت تعمل مع. على سبيل المثال، V. يتطلب الكوليرا لا يقل عن 200 مل من الثقافة من أجل الحصول على جودة عالية أطياف الشامل، إلا أن حجم الثقافة لE. القولونية يمكن زيادتها إلى 5 مل. مطلوب مزيد من انطلاق مواد (الثقافة أحجام أكبر) بالنسبة لبعض الأنواع البكتيرية لأن hydrolysوالخطوة التي تطلق الدهون A من LPS كله هو أقل كفاءة. على سبيل المثال الكائنات الحية تحتوي على دي أكسيجيناز KDO ظيفية أو KDO كيناز المعرض انخفضت الدهون وغلة خفيفة بعد التحلل حمض 39. في كثير من الأحيان، المسوخ مع الهياكل A LPS / الدهون محورة أو الأنواع البكتيرية خاصة غالبا ما تكون صعبة لتكوير أثناء الحصاد الخلية. لهذه السلالات، ويمكن تمديد طول الطرد المركزي لزيادة الغلة. أيضا من ملاحظة، بعد تحلل الخلية في مرحلة واحدة بليغ-داير الخليط وLPS ومكعبات (انظر الخطوة 1.9)، قد تكون هناك حاجة خطوات غسل إضافية للحد من التلوث فوسفورية. عندما عزل الدهون A من E. كولاي أو السالمونيلا، مطلوب واحد يغسل فقط. ومع ذلك، إذا عزل الدهون A من الكائنات الحية الأخرى (مثل ضمة الكوليرا أو هيليكوباكتر بيلوري)، والخطوات المطلوبة غسل إضافية.

بعد التحلل حامض معتدل في SDS، العائد من الأنواع الدهنية ومع انخفاض للا مائية (أي أكثر بومجموعات sphate> 2 أو أقل سلاسل أسيل <5) يمكن تحسين باستخدام استخراج بليغ-داير الحمضية. للكميات المستخدمة في البروتوكول الباب 1، إضافة 225 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المركز إلى حل SDS تحتوي على تحلل الدهون وتليها 30 مل من الكلوروفورم والميثانول 30 مل من لاثنين من المرحلة بليغ-داير خليط من كلوروفورم: الميثانول: 0.1 M حمض الهيدروكلوريك (2:2:1.8، ت / ت). للكميات المستخدمة في بروتوكول القسم 6 إضافة 15 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المركز إلى حل SDS تحتوي على تحلل الدهون وتليها 2 مل من الكلوروفورم و2 مل من الميثانول مما أسفر عن الكلوروفورم: الميثانول: 0.1 M حمض الهيدروكلوريك (2:2:1.8، والخامس / ت) خليط. بعد استخراج بليغ-داير الحمضية، يمكن إضافة البيريدين إلى مراحل أقل المجمعة لتحييد الحامض (1 قطرة من البريدين / 2 مل من حجم العينة النهائية). يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة إضافية قبل تجفيف العينة، في غطاء الدخان الكيميائية. يجب الحرص على عدم استخدام البيريدين الزائدة، التي يمكن أن تؤدي إلى إزالة الأحماض الدهنية المرتبطة استر. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان عصيدة الدهونلو صعب لتجف تحت النيتروجين، إضافة بضع ملليلتر من الكلوروفورم: الميثانول (4:1، ت / ت) إلى قارورة والاستمرار في تجفيف العينة على الانتهاء.

عدم تجانس كيميائية معقدة من الأنواع والدهون لوحظ في بعض الكائنات الحية (مثل ضمة الكوليرا، يرسينيا الكاذبة) يمكن أن تجعل في بعض الأحيان تحليل يستند إلى MS-TLC أو صعبة. ويمكن استخدام اللوني العمود المنبع من هذه التقنيات التحليلية إلى ما قبل يجزئ الأنواع المعزولة الدهون A في مخاليط أكثر بساطة. تبادل أنيون مع diethylaminoethyl يستخدم (DEAE) السليلوز الأكثر شيوعا 40. كمبدأ توجيهي عام الدهون وتعديل في أي موقف الفوسفات، مع مجموعات غير الحمضية مثل aminoarabinose أو phosphoethanolamine، elutes قبل معدلة الأنواع الدهون A 40. -فسفرته تريس بالمثل الدهون وelutes جيدا بعد الأنواع bisphosphorylated معدلة 36،40. عكس المرحلة اللوني يمكن استخدامها ليجزئ الدهون ومسكوكةق من درجات متفاوتة من للا مائية 41. اللوني العمود مفيد أيضا في إزالة المتبقي بعد التحلل SDS حامض معتدل واللاحقة بليغ-داير الدهون على بعد خطوات الاستخراج. يمكن لمستويات عالية من SDS المتبقية المساهمة في إشارة قمع في الأطياف التي حصلت عليها لدينا الحساسة بروتوكولات ESI-MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل عن طريق منح AI064184 وAI76322 من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) وغرانت 61789-MA-MUR من مكتب أبحاث الجيش للبحوث MST كان مدعوما أيضا من قبل مؤسسة ولش منحة المعاهد الوطنية للصحة منح F1155 وR01GM103655 إلى JSB

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Thermo Fisher Scientific C607 HPLC Grade
Methanol Thermo Fisher Scientific A452 HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles Thermo Fisher Scientific 05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates EMD Biosciences 5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper Whatman 3030700
Orbitrap Elite Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters New Obectives ≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200 Barnstead/Thermolyne HPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes Corning Pyrex 99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 Corning 9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager) BioRad 170-9400
Autoradiography Cassette Thermo Fisher Scientific FBCS810
Phosphorscreen SO230 Kodak
Peptide Mass Standards Kit Sequazyme P2-3143-00
Sonifier S250-A Branson 101063196
1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial Thermo Fisher Scientific C4000-V1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
  2. Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
  3. Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria. Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).
  4. Kim, H. M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell. 130, 906-917 (2007).
  5. Rietschel, E. T., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).
  6. Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immunity. The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).
  7. Dinarello, C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood. 77, 1627-1652 (1991).
  8. Guo, L., et al. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell. 95, 189-198 (1998).
  9. Yi, E. C., Hackett, M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. The Analyst. 125, 651-656 (2000).
  10. Westphal, O. aJ., K, Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).
  11. Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).
  12. Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).
  13. Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides. The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).
  14. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).
  15. Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).
  16. Wang, X., et al. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida. Biochemistry. 45, 14427-14440 (2006).
  17. Strain, S. M., et al. Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance. The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).
  18. Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures. Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).
  19. Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).
  20. Hankins, J. V., Trent, M. S. Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo. The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).
  21. Hankins, J. V., et al. Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition. Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).
  22. Chan, S., Reinhold, V. N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).
  23. Boue, S. M., Cole, R. B. Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).
  24. Kussak, A., Weintraub, A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).
  25. El-Aneed, A., Banoub, J. Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).
  26. Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A. Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).
  27. Lee, C. -S., Kim, Y. -G., Joo, H. -S., Kim, B. -G. Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).
  28. Wang, Z., Li, J., Altman, E. Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide. Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).
  29. Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution. Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).
  30. Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -L., Afonso, C., Tabet, J. -C. Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions. Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).
  31. Silipo, A., et al. Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).
  32. Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).
  33. Jones, J. W., Cohen, ie, Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).
  34. Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).
  35. Han, S. W., et al. Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium. Nature. 3, 1153-1110 (2012).
  36. Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate. Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).
  37. Galloway, S. M., Raetz, C. R. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis. The Journal of biological chemistry. 265-6394 (1990).
  38. Trent, M. S., et al. Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).
  39. Chung, H. S., Raetz, C. R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).
  40. Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate. The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).
  41. Raetz, C. R., et al. Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4. Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics