A Metodologia Decelularização para a produção de um Intestinal Matrix Natural Acellular

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Bioengineering
 

Summary

O artigo descreve um método para a produção de uma matriz acelular a partir de intestino de rato. A derivação de andaimes intestinal é importante para futuras aplicações em engenharia de tecidos, biologia das células estaminais e testes de drogas.

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Maghsoudlou, P., Totonelli, G., Loukogeorgakis, S. P., Eaton, S., De Coppi, P. A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix. J. Vis. Exp. (80), e50658, doi:10.3791/50658 (2013).

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Abstract

Engenharia de tecidos bem sucedido envolve a combinação de andaimes com células adequadas in vitro ou in vivo. Os andaimes podem ser sintéticos, de origem natural ou derivados de tecidos / órgãos. Estes últimos são obtidos utilizando uma técnica chamada de descelularização. Descelularização pode envolver uma combinação de métodos enzimáticos física, química, e. O objetivo desta técnica é remover todos os vestígios de telefonia celular, mantendo a arquitetura micro-macro e do tecido original.

Engenharia de tecidos intestinais, até agora utilizados andaimes relativamente simples que não reproduzem a arquitetura complexa do órgão nativo. O foco deste artigo é descrever uma técnica eficiente para decellularization rato intestino delgado. O isolamento do intestino delgado, de modo a assegurar a manutenção de uma ligação vascular é descrito. A combinação das soluções químicas e enzimáticas para remover as células whilª preservando o eixo vilosidade-cripta no aspecto luminal do andaime também está definido para fora. Finalmente, é discutida a avaliação de andaimes produzidos para as características apropriadas.

Introduction

A engenharia de tecidos (TE) oferece uma alternativa terapêutica ao transplante de órgãos, ignorando questões de imunossupressão e escassez de órgãos. TE teve, recentemente, aplicações bem sucedidas na clínica, com a substituição de órgãos como a bexiga 1, 2 uretra e traquéia, tanto em adultos 3,4 e crianças 5.

Construção de um órgão de engenharia de tecidos, requer a combinação de um andaime, com as células apropriadas. Um andaime pode ser preparado usando de origem natural (por exemplo, colagénio) e (por exemplo, ácido poli-L-glicólico; PLGA) sintética materiais, ou ser obtido através da descelularização de órgãos e de tecidos nativos. Os andaimes que têm sido utilizados até agora para TE intestinais têm sido principalmente quer descelularizado (submucosa de intestino delgado) ou sintético (ácido poli-L-ácido glicólico e ácido poli-láctico) 6-13. Estes biomateriais são muito simples, tanto macro-e micro-arquitetura, quepode não ser ideal se intestino engenharia de tecidos deve ser traduzido clinicamente. Um biomaterial ideal para o intestino deve ter uma árvore vascular inata, que pode ser conectado ao fornecimento de sangue do hospedeiro, de uma parede tubular de camadas com diferentes propriedades de modo a reflectir as camadas da parede intestinal e um eixo vilo-cripta no lado luminal para auxiliar com repovoamento de células estaminais epiteliais.

Decelularização é uma nova metodologia que produz andaimes, removendo as células de órgãos inteiros, mantendo sua arquitetura original 14. Isto é preferível para andaimes já existente, uma vez que não só a mesma estrutura do órgão, mas também contêm sinais químicos incorporados no interior da matriz extracelular (ECM), que ajuda a proliferação e diferenciação celular. Em 2008, um traquéia cadavérico foi descelularizados 14, semeado com células do próprio paciente, e transplantadas para substituir brônquio principal esquerdo em um homem jovem 15, 16,17 fígado, pulmão e 18-20 em animais pequenos e grandes.

Nós também se adaptaram a mesma metodologia para produzir um pequeno andaime descelulada intestinal 21. O objectivo do método aqui descrito é para produzir matrizes intestinais descelularizados que mantêm as características macroscópicas do tecido original, tais como o fornecimento de sangue, bem como a arquitectura microscópica do eixo vilo-cripta no lúmen intestinal. Acreditamos que essa metodologia poderia finalmente ser adotado para outros órgãos para melhorar a eficiência de descelularização.

Protocol

1. Isolamento de Rato Intestino

  1. Prepara-se uma solução de 1 L de salina tamponada com fosfato (Sigma, Reino Unido) com 1% de antibiótico / antimicótico (Sigma, Reino Unido) (PBS / AA). Coloque a bomba peristáltica (velocidade variável Masterflex L / S) com dois tubos. Executar etanol a 70% (EtOH), através dos tubos da bomba peristáltica durante 15 minutos à velocidade máxima, seguido de PBS / AA por mais 15 min.
  2. Eutanásia adultos ratos Sprague-Dawley pesando aproximadamente 250-350 g por inalação de CO 2 e deslocamento cervical, de acordo com as diretrizes locais de origem animal e aprovações (no Reino Unido, as orientações do Ministério do Interior sob os Animais (Scientific Procedures) Act 1986).
  3. Autoclave os instrumentos cirúrgicos antes de usar. Spray e limpe o abdômen do animal usando etanol 70%.
  4. Realizar uma incisão laparotômica xifo-púbica no abdômen para garantir um campo cirúrgico claro.
  5. Eviscerar do intestino delgado, no lado direito do animal sobre uma toalha de papel pulverizado com 70% de EtOH. Take cuidado para molhar continuamente o intestino com PBS / AA, de modo a evitar a desidratação do tecido e a desnaturação da matriz extracelular (ECM).
  6. Localizar a artéria mesentérica superior (SMA) provenientes de um ângulo de 90 ° a partir da aorta para o intestino. Usar um G cânula 27 para entrar no SMA da aorta e rapidamente retirar a agulha para evitar rasgar a parede do vaso. Avançar o tubo plástico da cânula para a SMA e segura usando suturas (Vicryl 5/0).
  7. Confirme punção, injetando 1 ml de PBS / AA. Use uma tesoura de mola para o inciso proximal aorta e distal à SMA, de modo a liberar a cânula.
  8. Para evitar a fuga das fezes quando dissecando o intestino grosso, coloque um (seda 5/0) nó de sutura na extremidade proximal da junção ileocecal e uma na extremidade distai do cólon sigmóide. Em seguida, retira o íleo terminal e dois pontos entre as duas cabeças e remover o intestino grosso.
  9. Cortar o intestino no jejuno-duodenal junção umaª liberar o intestino de qualquer conexão do tecido conjuntivo que pode ter com o abdômen.
  10. Transferir o intestino delgado em uma placa de Petri com PBS / AA. Canular seção proximal do intestino com uma pipeta Pasteur de plástico (LSL Laboratório de consumíveis) e fixá-lo no lugar com suturas. Corte a pipeta por isso vai caber a Luer-Lok de uma seringa de 60 ml (BD Plastipak). Lave o lúmen intestinal 2x com 60 ml de PBS / AA para remover fezes e detritos.

2. Metodologia Decelularização

  1. Conecte a cânula vascular a um torneira de três vias. Isto irá facilitar o manuseamento, a minimizar a tensão sobre a árvore vascular e permitir a remoção de bolhas a partir da tubagem.
  2. Comece a correr água deionizada (resistividade 18,2 mohms / cm) através da bomba de roletes de velocidade variável Masterflex L / S de 0,6 ml / h. Garantir que não haja bolhas de ar dentro do tubo antes de se conectar com a torneira lúmen intestinal. Algumas bolhas podem estar presentes dentro do lúmen do passo1.9, o que pode prejudicar o processo de decelularização. Variar a velocidade da bomba e manipular o tecido com uma pinça com cuidado para garantir que a saída de bolhas a partir da extremidade distal. Não conecte a cânula vascular até que esse processo for concluído, uma vez altas velocidades pode danificar a árvore vascular.
  3. Transferir para o aparelho de câmara fria, uma vez que o passo seguinte de descelularização é realizada a 4 ° C. A baixa temperatura permite a remoção de células, minimizando a decomposição do tecido. Coloque a placa de Petri em um recipiente que irá recolher a solução transbordante. Perfundir ambos os lúmen intestinal e a árvore vascular com água deionizada (resistividade 18,2 mohms / cm) durante 24 horas a 0,6 ml / h. Para conferir a primeira hora o aparelho regularmente para garantir que todas as ligações são seguras, o vazamento é mínima e sem bolhas estão presentes no intestino.
  4. Após 24 horas de tratamento com água deionizada, mova aparelho decellularization fora da sala fria, como o resto dos passos sãorealizada em temperatura ambiente (RT).
  5. Pesar o desoxicolato de sódio (Sigma, Reino Unido) para preparar 300 ml de uma solução 4% em água desionizada. Pesar o desoxicolato de sódio, sob uma capa de sucção, uma vez que é um agente irritante oral e olho. Misturar utilizando um vortex até que a solução é límpida. A solução pode ser mantida a 4 ° C durante até 1 mês.
  6. Altere a solução deionizada para desoxicolato de sódio, verifique as conexões, remover quaisquer bolhas e perfuse em 0,6 ml / h durante 4 h.
  7. Seguindo o passo de lavagem com PBS, o desoxicolato de sódio / AA por 30 minutos para evitar a interacção entre o desoxicolato de sódio e de DNase I.
  8. Pesar desoxirribonuclease-I (DNase I, Sigma) e preparar 250 ml de uma solução 2,000 kU em cloreto de sódio 1 M, pH 7,4. Misturar utilizando um vortex até que a solução é límpida. Esta solução deve ser preparado imediatamente antes da utilização e não pode ser armazenado.
  9. Perfundir com ADNase-I, durante 3 horas à temperatura ambiente a uma velocidade de 0,6 ml / hr.
  10. Seguindo o passo de DNase I, transferir oscaffold num capuz de cultura de tecidos e alteração placas ou instrumentos. Sugere-se usar uma técnica asséptica.
  11. Lavar com PBS / AA por 30 min para assegurar que todos os restos das soluções decelularização são removidos. Coloque o andaime em uma nova placa de Petri e transferir para um Crosslinker UV (Spectroline, EUA). Execute dois ciclos de esterilização. Guarde em 5% PBS / AA e alterar a solução a cada 3 dias.

Representative Results

Após a descelularização bem sucedida (Figura 1), o andaime deve ter uma aparência macroscópica semelhante ao do intestino nativo, mas com paredes translúcidas (Figura 2A). A preservação da macro-arquitetura também deve ser evidente por a desobstrução da árvore vascular. Quando corante é injectado através da cânula da SMA, ele deve distribuir uniformemente por todo o andaime e atingir a árvore capilar (Figura 2B). O andaime deve estar livre de material nuclear e citoplasmática, algo que pode ser avaliada através de um kit de quantificação de DNA e análise histológica simples. Hematoxilina e eosina (H & E) deve demonstrar a ausência de material nuclear e citoplasmática, preservando as pequenas camadas intestinais (Figura 3A). Em particular, a manutenção das criptas e vilosidades do lado luminal deve ser evidente a seguir a microscopia electrónica de varrimento (Figura 4). Aconservação de componentes da matriz extracelular, tais como o colagénio, a elastina e os glicosaminoglicanos também deve ser esperado. Por exemplo, de tricromo Masson exibe tecido conjuntivo intacto no andaime (Figura 3B).

Figura 1
Figura 1. . Plano Experimental Timeline do procedimento decellularization; PBS / AA: tampão fosfato com antibiótico-antimicótico, NaDeoxy: desoxicolato de sódio, RT: temperatura ambiente, DNAse-I: desoxirribonuclease-I. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 2
Figura 2. Andaime macroscopic características. aparência macroscópica do intestino delgado de ratos após decellularization sucesso (A). A injeção de Rosso Ponceau corante através da SMA demonstra uma rede vascular intacto (B); SMA: artéria mesentérica superior Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 3
Figura 3. . Histologia H & E (A) e MT (B) coloração indicam uma ausência de material celular com a preservação da arquitetura do tecido conjuntivo; H & E: hematoxilina e eosina, MT: Masson. Barra de escala:. 100 mm Clique aqui para ver a imagem ampliada . Figura 4
Figura 4. . Microscopia eletrônica de Microscopia Eletrônica de Varredura indica a arquitetura das vilosidades-crypt preservada no lúmen andaime; Barra de escala:. 100 mm Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Discussion

As etapas mais difíceis na criação deste experimento envolve a punção da SMA e do estabelecimento e manutenção de esterilidade. Canulação da SMA em roedores sem romper a parede pode ser bastante difícil devido ao tamanho ea posição do navio. Alternativamente, um fio de sutura pode ser colocada ao redor da aorta proximal antes da origem SMA, seguido por canulação da própria aorta distais, dirigindo a cânula de plástico para a SMA. Durante decellularization uma combinação de colocação de cânula pobres e altas taxas de fluxo pode resultar na perda do acesso vascular. A esterilidade é um problema importante, devido à quantidade da flora bacteriana do intestino delgado. A lavagem com PBS / AA a seguir à colheita é muito importante, e qualquer sinal de matéria fecal ou restos deve ser removido a partir do lúmen. Colocar uma porção do andaime num tubo Falcon com DMEM na incubadora após a esterilização de UV deverá ser um indicador se esterilidade foi alcançado. No casode colonização bacteriana, a mídia vai mudar o pH com a sua cor passando de vermelho para amarelo. Para lidar com isto, ciclos adicionais de UV são aconselhados, bem como a lavagem com PBS, contendo uma elevada concentração de antibiótico / antimicótico.

Uma modificação possível obter um andaime com acesso tanto vascular venoso e seria canular a veia cava inferior (IVC), bem como a SMA. Decelularização dos lados venosos e vasculares deve ser tentada de forma intermitente para as três soluções. Decellularization contínua pode estourar os vasos capilares fazendo com que a pressão positiva em ambos os lados.

Ao longo dos anos, tem havido uma série de esforços no intestinal TE usando diferentes combinações de células-andaime in vitro e in vivo 6,9,12. A maioria dos trabalhos foi realizada utilizando tubulares não tecido 95% PGA-5% PLGA andaimes revestidos com colágeno tipo I 6,7,13,22. Após a sementeira com intestinalunidades epiteliais organóide (OU) e um período de implantação no omento de ratinhos, que formam cistos com músculo do lado de fora e do epitélio por dentro, que pode então ser tubulares. No entanto, a porosidade e a simplicidade na concepção destas estruturas não permite a geração de grandes pedaços de intestino artificial, em um ambiente in vitro, tais como a de um bio-reactor. Além disso, a falta de uma rede vascular inata, que pode ser conectado ao recipiente limita ainda mais o uso de este andaime para tradução clínica. Além dos experimentos com os andaimes PGA-PLGA, outros grupos têm usado de colágeno ou SIS andaimes, sendo que ambos não replicar a complexidade do trato intestinal. SIS em particular, é a única metodologia publicada anterior de engenharia de tecido intestinal e tem sido usado em mais de 150 ambientes médicos, demonstrando a capacidade de andaimes descelularizados para proporcionar estabilidade mecânica e promover o crescimento celular, enquanto chumboção de resposta imunogênica. No entanto, a falta de macro-e micro-arquitetura apropriada, levou a resultados ruins em sua "utilização para fins TE intestinais 9-11,23.

Os benefícios da metodologia de descelularização temos descritos incluem a preservação das características microscópicas, tais como a arquitectura cripta-vilosidade luminal que representam um ambiente adequado para o repovoamento do nicho de células estaminais intestinal. No aspecto macroscópico, a presença de uma rede vascular hierárquica irá permitir ligação ao recipiente, permitindo fornecimento de nutrientes e oxigénio para toda a camada de a-TE intestino 21. Além disso, a manutenção de componentes da matriz extracelular, como colágeno, elastina e glyocosaminoglycans tem um papel importante não só para as características mecânicas, mas também dirigir proliferação e diferenciação celular. Mais importante, a capacidade de a metodologia de descelularização de ser melhorados em grander tecidos, enquanto mantendo as mesmas características é uma característica importante para a tradução clínica da TE.

O desenvolvimento de uma matriz intestinal natural com uma rede vascular permite a criação de grandes segmentos do intestino artificial, que pode ser ligado ao hospedeiro.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Os autores agradecem ao Instituto Wake Forest de Medicina Regenerativa por sua ajuda com o desenvolvimento deste protocolo. Reconhecemos o apoio por doações da caridade Great Ormond Street Hospital, a Fundação Eugenio Litta (Genebra, Suíça), o Conselho de Pesquisa Médica, o Colégio Real de Cirurgiões da Inglaterra, as faíscas Infantil Medical Caridade, o Ministério do Exterior britânico para o Reino Unido / EUA Stem Cell Collaboration Award e ao Fundo de Investigação Mittal. Gostaríamos também de agradecer à Fundação Royal Society / Wolfson para a engenharia de tecidos concessão remodelação laboratório obtidos para o Departamento de Cirurgia Pediátrica do Instituto de Saúde da Criança. PDC e SE são suportados por caridade o Great Ormond Street Hospital da Criança.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol solution, 70% in H20 Sigma 02877
Phosphate buffered saline tablets Sigma 79382
Antibiotic Antimycotic Solution (100x) Sigma A5955
Sodium deoxycholate Sigma D6750 Oral and eye irritant; use protection
Sodium chloride
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma D5025

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