تحديد الطفرات الحمض النووي في الخلايا الجذعية المكونة للدم تنقية / السلف

Immunology and Infection
 

Summary

نحن هنا تصف في الجسم الحي الطفرات فحص لأعداد صغيرة من الخلايا المكونة للدم تنقيته باستخدام اسي نموذج الفأر وراثيا. الجين اسي يمكن عزل لتحديد التردد، والموقع، ونوع من المسوخ الحمض النووي نشأت عفويا أو بعد التعرض لgenotoxins.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Cheng, Z., Zhou, T., Merchant, A., Prihoda, T. J., Wickes, B. L., Xu, G., Walter, C. A., Rebel, V. I. Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (84), e50752, doi:10.3791/50752 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

في السنوات الأخيرة، أصبح واضحا أن عدم الاستقرار الجيني يرتبط بإحكام لكثير من اضطرابات النمو، والسرطانات، والشيخوخة. نظرا إلى أن الخلايا الجذعية هي المسؤولة عن ضمان التوازن وإصلاح الأنسجة في جميع مراحل الحياة، فمن المعقول أن نفترض أن السكان الخلايا الجذعية أمر بالغ الأهمية للحفاظ على سلامة الجينوم من الأنسجة. لذا، قد نشأ اهتمام كبير في تقييم تأثير العوامل الذاتية والبيئية على سلامة الجينوم في الخلايا الجذعية وذريتها، التي تهدف إلى فهم مسببات أمراض الخلايا الجذعية القائمة.

اسي الفئران المعدلة وراثيا تحمل استرداده λ ناقلات فج ترميز نظام مراسل اسي، الذي يخدم هذا الجين كما اسي مراسل الطفرة. نتيجة لاسي الجين المتحور هو إنتاج β-غالاكتوزيداز أن يشق ركيزة مولد اللون، ويحولها الأزرق. نظام مراسل اسي هو أنني نفذتن جميع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجذعية / السلف ويمكن بسهولة أن تعافى واستخدامها لاحقا تصيب E. القولونية. بعد احتضان E. المصابة القولونية على الاغاروز التي تحتوي على الركيزة الصحيحة، يمكن لويحات وسجل؛ ويحات زرقاء تشير إلى وجود اسي الجين الطافر، في حين لويحات واضحة تؤوي من النوع البري. تواتر الأزرق (بين واضح) لويحات يدل على التردد متحولة في عدد السكان الخلية الأصلية تم استخراج الحمض النووي من. سوف تسلسل الجين الطافر اسي تظهر في موقع من الطفرات في جين ونوع من الطفرات.

وراسخة في نموذج الفأر وراثيا اسي باعتبارها في الجسم الحي الطفرات الفحص. وعلاوة على ذلك، تتوفر تجاريا الفئران والكواشف لفحص. نحن هنا تصف بالتفصيل كيف يمكن تكييف هذا النموذج لقياس التردد التي تحدث بشكل عفوي المسوخ الحمض النووي في الخلايا الجذعية التخصيب لين - IL7R - هيئة السلع التموينية-1 + + + cKit (LSK) الخلايا والمجموعات السكانية الفرعية الأخرى التابعة لمنظومة المكونة للدم.

Introduction

في معظم أنسجة وخلايا متباينة لديها محدودة مدى الحياة. للحفاظ على سلامة وظيفية، والخلايا الجذعية الأنسجة محددة الأجل الطويل تنتج باستمرار الخلايا الاصلية التي تعطي بدورها إلى ظهور خلايا متباينة تماما المطلوب للوظيفة أن الأنسجة معينة. الخلايا الجذعية أيضا تجديد المقصورة الخاصة بهم من خلال عملية تسمى التجديد الذاتي. وبالتالي، والخلايا الجذعية هي المسؤولة عن الحفاظ على سلامة وظيفية من الأنسجة التي يقيمون فيها ولذلك، لا بد من أن أنها مجهزة آليات قوية لاستشعار ويحتمل أن إصلاح تلف الحمض النووي. إذا لم يكن كذلك، قد يكتسب متعددة الجيني (يمكن أن تكون ضارة) الاضطرابات، والتي يمكن أن تكون موروثة من قبل ذريتها. فهم كيفية الخلايا الجذعية آمن حراسة الجينوم أثناء العمر الافتراضي للكائن الحي هو السؤال المهم، وربما تساعدنا على فهم لماذا يرتبط عدم الاستقرار الجيني مع السرطان وبعض الأمراض المرتبطة بالعمر أخرى (إعادة النظر في 1،2).

الحمار = "jove_content"> السيطرة على سلامة الجينوم من الأنسجة على مستوى الخلايا الجذعية أو السكان الخلية السلف في وقت مبكر يمكن أن يتحقق إما عن طريق القضاء على عيب الجذعية (أو السلف) الخلايا عبر موت الخلية، الشيخوخة أو التمايز، و / أو عن طريق إصلاح كفاءة الحمض النووي للتلف. وقد أثبتت الدراسات الحديثة أنه من الممكن لقياس أنواع معينة من إصلاح الحمض النووي مباشرة في هؤلاء السكان نادرة 3-6. تم العثور على أنه، على سبيل المثال في نظام المكونة للدم، فواصل الحمض النووي حبلا مزدوجة يمكن إصلاحه من قبل إعادة التركيب مثلي (HR) أو نهاية غير المتجانسة الانضمام (NHEJ)، ويجري هذا الأخير عملية إصلاح الدنيا الإخلاص، وبالتالي زيادة خطر اتخاذ أخطاء. وتستخدم في كل من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) 4،5، ولكن في الفئران يبدو أنها في الغالب NHEJ في HSCs في حين أن الخلايا الأسلاف في وقت مبكر الاستفادة من الموارد البشرية 4. وقدم ملاحظة مماثلة للخلايا الجذعية في الجلد 6. ومن المثير للاهتمام، في الإنسان HSCs الموارد البشرية، لا NHEJ،ويبدو أن آلية إصلاح خيار لفواصل حبلا مزدوجة 3. إذا كان هذا الفرق الوظيفي بين النوعين هو حقيقي أو يمثل الفرق تكنولوجية أو مجرد التجريبية يبقى أن نرى.

مرجع خلية الجذعية لإصلاح تلف الحمض النووي من المرجح أن تشمل آليات إصلاح الحمض النووي الأخرى، مثل إصلاح قاعدة الختان (ديسمبر)، النوكليوتيدات إصلاح الختان (NER) وإصلاح عدم تطابق (MMR). البر وNER هي المسؤولة عن إصلاح الآفات الزوج قاعدة واحدة أو متعددة في الحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل، في حين عدم التطابق إصلاحات MMR قاعدة قاعدة والحلقات الإدراج / حذف؛ هذه الأنواع من الحمض النووي من التلف لا يمكن إصلاحه من قبل NHEJ أو الموارد البشرية. دعم هذه الفكرة العديد من الدراسات من نظام المكونة للدم مما يدل على وجود صلة بين التعديلات في واحدة من هذه الممرات وتشوهات في المقصورة HSC 7-9، فضلا عن زيادة خطر تطور متلازمة خلل التنسج النقوي 10-16، وهو المرض الذي ينشأ فيويرتبط شهادة الثانوية العامة وذلك مع زيادة عدم الاستقرار الجيني كما تقدم المرض 17. اعتبارا من بعد، لم يتم الإبلاغ عن قياسات البر، نير وMMR مباشرة في HSCs.

بالإضافة إلى توضيح العمليات المختلفة التي تتحكم في سلامة الأنسجة على مستوى الآلية، لا بد أن تكون قادرة على قياس مدى تحور الحمض النووي، بحيث يمكن اختبار عواقب الانحرافات في واحدة من هذه العمليات، على سبيل المثال في الحالات العادية مقابل راثيا الخلايا الجذعية هندسيا أو القديمة مقابل الشباب. ومع ذلك، وضع مقايسة ذات الصلة من الصعب بسبب ندرة الخلايا الجذعية الأنسجة محددة وعدم وجود ظروف الثقافة التي تحافظ على "stemness". علاوة على ذلك، ينبغي أن يكون مثل هذا الفحص قابلة للتعديل إلى التلاعب البيئية والوراثية. أحد الحلول الممكنة لهذه القيود والمتطلبات هو استخدام نماذج الماوس التي صممت خصيصا للكشف عن الطفرات الحمض النووي.

مولوقد وضعت نماذج الماوس المعدلة وراثيا tiple للكشف عن الطفرات. على سبيل المثال، اسي الفئران المعدلة وراثيا 18 تحمل استرداده λ ناقلات فج ترميز نظام مراسل اسي، الذي الجين يشفر اسي القامع للمشغل لاك وبمثابة مراسل الطفرة. على تحور الجين اسي، يتم تنشيط المشغل لاك ويتم إنتاج β-غالاكتوزيداز. يشق β-غالاكتوزيداز ومولد اللون الركيزة X-غال (5-برومو-4-كلورو الإلكترونية indolyl-β-D-galactopyranoside)، الذي يحوله الأزرق. مواقع كوس المرافقة ناقلات اسي يسمح الانتعاش سهلة من خلال امدا البروتينات فج والعدوى اللاحقة من E. القولونية. بعد احتضان E. المصابة القولونية على الاغاروز التي تحتوي على الركيزة X-غال، يمكن وسجل لويحات. ويحات زرقاء تحتوي على متحولة المفترضة لاك-I تحمل فج، في حين لويحات واضحة تؤوي غير المسوخ. تردد لويحات زرقاء (من بين اله منها واضح) يدل على التردد متحولة في عدد السكان الخلية الأصلية تم استخراج الحمض النووي من. وعلاوة على ذلك، فإن فج λ استضافة هدف اسي يمكن أن تكون متسلسلة بسهولة باستخدام تقنيات PCR للتحليل إنتاجية عالية نسبيا. وسوف تتابع متعددة الجينات الطافرة اسي تكشف عن معلومات مهمة حول الطيف الطفرة، والتي بدورها قد تشير إلى أوجه القصور المحتملة في مسارات محددة إصلاح الحمض النووي أو الأحداث سمية جينية محددة. تم توحيد نظام المعدلة وراثيا اسي عبر مختبرات متعددة 19 وتتوفر الكواشف تجاريا. واحد العيب الرئيسي لنظام اسي هي قدرة محدودة للكشف عن عمليات الحذف كبيرة أو إعادة ترتيب، وبالتالي، وأساليب أخرى، على سبيل المثال متعددة الألوان FISH على هوامش الطورية حاجة لاستخدامها لتكمل هذا النقص.

داخل ناقلات λ فج من طراز اسي الماوس، هناك الجين أصغر بكثير، CII، وهي متاحة للتحليل الطفرة. حجمها، وحقيقة أن المسوخ يمكن اختيار يجعل هذا أقل كثيفة العمالة وأرخص مقايسة 20 من تحليل الجينات اسي. ومع ذلك، يتم دراسة هذا الجين اسي أكثر على نطاق واسع ل21 الطفرات وحساسية الجينات إلى حدوث طفرات اتسم جيدا حتى لا يكون هناك فهم واضح من مخلفات الأحماض الأمينية التي تولد استجابة المظهري على ركيزة مولد اللون 22-25.

وتشمل نماذج الماوس الأخرى للكشف عن طفرة استخدام ΦX174 أو الجينات المحورة LacZ. نموذج الفأر وراثيا ΦX174، مع A الأصلي: T → G: C طفرة الارتداد مقايسة 26 أو الطفرة مقايسة 27 قدما التي تسمح الكشف عن مجموعة متنوعة من بدائل الزوج القاعدة، يمثل النظام أقل تكلفة من طراز اسي. ومع ذلك، فإن شاشة طفرية في مقايسة إلى الأمام ليست تافهة والمواصفات الطفرةليس كما يتميز جيدا trum من التحوير ΦX174 كما ان من اسي. في نماذج الماوس تحمل الجينات المحورة LacZ، يتم استرداد مراسل طفرية LacZ الاستفادة E. الخلايا المضيفة القولونية التي تعتبر حساسة لالجالاكتوز والمتوسطة التي تحتوي على اللبن 28. ومن عيوب هذا النظام هو أن انتعاش الهدف LacZ ينطوي أيضا على تقييد نوكلياز داخلية الهضم تليها ربط و electroporation من E. تستضيف القولونية، مما يجعل من الصعب على التكيف مع النظام لأعداد صغيرة من الخلايا. على الرغم من أنه ليس شرطا مطلقا للعمل مع السكان الخلايا الجذعية / السلف (واحد يمكن أن تبدأ دائما مع مزيد من الفئران)، إذا كانت هناك حاجة أعداد كبيرة من الخلايا (مثل الملايين أو أكثر) وسوف يصبح غير عملي بسرعة وباهظة التكلفة. أيضا، حجم كبير نسبيا من LacZ، مع توفير مراسل طفرية حساسة، هي مرهقة ومكلفة أكثر للتحليل تسلسل الحمض النووي وdetermination من طفرة الأطياف. والميزة الرئيسية لهذا النموذج ومع ذلك، هو قدرتها على الكشف عن الحذف والإدراج كبيرة، فضلا عن إعادة ترتيب الكروموسومات.

حيث أن جميع الخلايا في نماذج الماوس المعدلة وراثيا اسي، ΦX174 وLacZ تحمل نظام المراسل، أي من هذه النماذج الماوس يمكن استخدامها لقياس الطفرات في أي نوع من الخلايا في المصالح، بما في ذلك الخلايا الجذعية والسلف، طالما أنها يمكن أن تحصد موثوق وبأعداد كافية. لأن كان لدينا خبرة واسعة مع نموذج الفأر اسي واسي فحص الطفرة، قررنا متابعة هذا النظام لتحليل مزيد من الطفرات في الجذعية المكونة للدم والسكان السلف.

الأنسجة المكونة للدم يتميز جيدا من حيث النمط الظاهري سطح الخلية مكوناته الفردية، بما في ذلك إعادة إسكانها الخلايا الجذعية طويلة الأجل، والتي يمكن تحديدها على النحو السكان نادرة للغاية من لين - IL7R + + + cKit (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - الخلايا 29. . Mohrin 4 آخرون أظهرت أن عدد السكان أكبر قليلا من LSK/Flk2 - خلايا لا تزال جيدة لممثلي HSCs وتختلف اختلافا كبيرا من الأكثر بدائية السلف النخاعي ملتزمة (CMP) السكان عندما يتعلق الأمر بدراسة إصلاح الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، عندما LSK HSC المخصب (FLK-2 + وFLK-2 -) وتمت مقارنة الخلايا إلى لين - IL7R - هيئة السلع التموينية-1-cKit + + (الخلايا الاصلية LS-K)، وكان لا يزال هناك اختلاف كبير في NHEJ قدرة 5 بين أقل نقية، وقف التخصيب خلية السكان LSK والخلايا الاصلية. في دراستنا نستخدم HSC التخصيب LSK (FLK-2 + وFLK-2 -) خلايا لأننا وجدنا أن لا يقل عن 2 × 10 5 خلايا مطلوبة ل، نتائج متسقة يمكن الاعتماد عليها في هذا الطفرات فحص، وهذا هو عدد الخلايا في غاية الصعوبةللحصول على واحدة عند فرز LSK/Flk2 - السكان CD150 + CD48 أو حتى LSK/Flk2 - السكان (من حيث الفئران والتكاليف والتطبيق العملي). هذا البروتوكول، على أساس واحد ضعت أصلا من قبل كولر وآخرون 18 يصف بالتفصيل كيف يمكن تحديد عفوية تردد متحولة الحمض النووي في الخلايا LSK والسكان من خلايا الدم النخاعي متباينة وكذلك خلايا نخاع العظم والطحال unseparated محددة.

Protocol

الكريات البيض من اسي الفئران المعدلة وراثيا على C57BL / 6 خلفية لا تعبر عن هيئة السلع التموينية-1 (الشكل 1). لذلك، إذا هيئة السلع التموينية-1 هو علامة تستخدم لتنقية الخلايا، تحتاج إلى أن عبرت مع السلالة المناسبة لاكتساب هيئة السلع التموينية-1 التعبير هذه الفئران؛ في هذا البروتوكول F1 من خليط بين العادية C57BL / 6 (B6) الفئران واسي (C57BL / 6) تم استخدام الفئران المعدلة وراثيا (اسي) (الشكل 1). من السكان الخلية المستخدمة في هذا البروتوكول، وLSKs CMPS تمثل أصغر السكان في نخاع العظام. من أجل تنقية 2 × 10 5 من كل ما لا يقل عن / نوع، والجمع بين ما يقرب من عشرة من نخاع الفئران عندما حصاد نخاع من hindlegs فقط أو من لا يقل عن أربعة الفئران عند الورك أيضا، أمام الساقين والعظام العمود الفقري، وتستخدم القص.

جعل تعليق خلية واحدة من نخاع العظم والطحال. ويتم استخدام نسبة صغيرة من نخاع العظام كما هو، ويستخدم غالبية إلى بور ify LSKs والخلايا الاصلية النخاعي المتباينة، أي CMPS والمحببات / الأسلاف الوحيدات (غمبس) من قبل خلية مضان تنشيط الفرز (FACS). يوصف عزل خلايا نخاع العظام ونظام مراقبة الأصول الميدانية لتنقية هؤلاء السكان في أماكن أخرى 30-32. ويلزم ما يقرب من ستة أنواع مستقلة لتحديد فروق ذات دلالة إحصائية في الترددات الطفرة بين السكان.

ويتم تكييف البروتوكول التالي لقياس عفوية في الجسم الحي التردد متحولة في المجموعات السكانية الفرعية المكونة للدم النقي من عدة كتيبات التعليمات Stratagene 33-35، على أساس العمل الأصلي من كوهلر وآخرون 18 الاختلافات الأكثر أهمية بين 33-35 البروتوكولات القائمة وهذا البروتوكول ، المطلوبة عند استخدام أعداد صغيرة نسبيا من الخلايا، وتشمل الاختلافات في أحجام الكواشف والأوقات ودرجات الحرارة المستخدمة لبروتين K الحضانة.

> 1. عينة التخزين

بعد جمع سكان الخلية، والخلايا قسامة المطلوب في أنابيب الطرد المركزي 1 مل (لعدد الخلايا في قسامة، انظر الجدول 1). أجهزة الطرد المركزي في 266 x ج لمدة 7 دقائق، في 4 درجات مئوية. نضح طاف بعناية. وضع أنابيب في النيتروجين السائل لمدة 5 دقائق ثم نقلها إلى -80 ° C الفريزر لاستخدامها مرة أخرى. ويمكن تخزين العينات لمدة 6 أشهر على الأقل.

2. عزل الحمض النووي الجينوم

  1. أخذ العينات من الفريزر -80 درجة مئوية. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة تحلل الحمض النووي من الجليد البارد (الجدول 3) إلى أنبوب العينة. دوامة الأنابيب لمدة 3-5 ثانية على سرعة متوسطة ووضع أنابيب على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  2. أنابيب الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة، 4،000 x ج، 4 درجات مئوية. تجاهل بعناية ~ 450 ميكرولتر من طاف. تدور أسفل أنبوب لمدة 3-5 ثانية. استخدام أنبوب زجاجي الشعرية لإزالة بعناية ما تبقى من طاف. الهواء الجاف الجدران الداخلية للروقال انه لا يوجد حتى أنبوب قطرات مرئية بعد الآن (~ 2 دقيقة).
  3. إضافة 2 ميكرولتر من RNace-وريبونوكلياز كوكتيل و 10 ميكرولتر من 1 M DTT إلى 100 ​​ميكرولتر من العازلة الهضم الحمض النووي (الجدول 3). ضبط كميات وفقا لعدد من العينات التي سيتم تجهيزها؛ مطلوب 20 ميكرولتر من هذا الحل الهضم الحمض النووي لكل عينة. بعد إضافة 20 ميكرولتر من هذا إلى بيليه الخلية، في محاولة لجعل بيليه فصل نفسها من الأسفل، من خلال استغلال بلطف الأنبوب بإصبعك أو بالقلم.
    ملاحظة: قد يكون من الصعب أن نرى بيليه بسبب انخفاض أعداد الخلايا.
  4. إضافة 20 ميكرولتر بروتين K الحل * (الجدول 3) لكل عينة، اضغط بلطف جدا أنبوب مرة أخرى.
    * ملاحظة: يجب أن تكون درجة حرارة على بروتين K الحل حتى في حمام مائي 50 ° C، 2 دقيقة قبل استخدامها من أجل تفعيل الانزيم.
  5. وضع أنبوب على الفور في 50 ° C حمام الماء. هضم العينة وفقا للمبادئ التوجيهية في ملاحظة: مع هذه الأعداد صغيرة من الخلايا، ودرجة حرارة حمام الماء والأوقات الهضم هي في غاية الأهمية للحصول على الحمض النووي الجيني بنجاح جودة عالية.
  6. إعداد نظام غسيل الكلى الحمض النووي في غرفة باردة (الشكل 2). صب 600 مل TE العازلة (الجدول 3) في كوب 600 مل الزجاج، إضافة شريط مغناطيسي صغير بحيث يمكن أن يحرك المخزن المؤقت أثناء غسيل الكلى والسماح لل(0.025 ملي المسام حجم) الأغشية تطفو على سطح المخزن المؤقت. واحد غشاء لكل عينة؛ 1-4 الأغشية يمكن استخدامها في كوب واحد لغسيل الكلى. جعل علامة على هامش الغشاء مع مقص لتحديد كل عينة.
  7. بعد وقت الهضم المناسبة، إضافة الحمض النووي الجيني الآن لزج جدا * بعناية لمركز الغشاء العائمة (الشكل 2). تغطية الكأس فورا بورق الألمنيوم. Dialyze الحمض النووي الجيني في 4 درجات مئوية لمدة 16-20 ~ساعة، وإثارة المخزن المؤقت بلطف.
    * ملاحظة: عند العمل مع حلول الحمض النووي لزجة، استخدم ماصة نصائح مع فتحة واسعة.
  8. في اليوم التالي صب 600 مل من الطازجة TE العازلة (الجدول 3) إلى كأس زجاجي نظيف ونقل الأغشية إلى دورق جديدة مع ملعقة بعناية فائقة، وتغطية الكأس مع احباط. Dialyze لمدة 2 ساعة أخرى.
  9. إزالة غشاء غسيل الكلى من الدورق مع العازلة TE باستخدام ملعقة ونقل فقط أكثر لزوجة "أجمة" من الحل DNA إلى جديد، معقمة أنبوب 1 مل. تخزين العينة في 4 درجات مئوية. مواصلة فحص الطفرات في اليوم التالي أو في وقت لاحق إلى 1.5 أشهر. للسكان النقى الانتظار ما لا يقل عن 1 في الاسبوع.

3. إعداد صواني لE. القولونية / فج الثقافة (يوم 1)

سوف تحتوي كل علبة اثنين من طبقات مختلفة؛ طبقة أجار في الجزء السفلي وطبقة الاغاروز في الجزء العلوي الذي يحتوي X-غال. وE.ستضاف حل القولونية / فج لهذا الأخير. وعدد ونوع الخلايا المعزولة تحديد عدد الصواني ستكون مطلوبة. استشارة الجدول 1 لحساب عدد من الصواني المطلوبة والمبالغ اللاحقة من الحلول لهذا الجزء من البروتوكول. التالية سوف تولد ~ 60 الصواني، والتي يمكن أن شخص واحد من ذوي الخبرة العملية بسهولة.

  1. إعداد وسائل الإعلام التالية:
    1. للطبقة السفلي، وإعداد 6 × 2 L قوارير مع بعضها تحتوي على 1،600 مل DDH 2 O. إضافة NZY مسحوق (21 جم / لتر) وأجار (15 جم / لتر)؛ تخلط جيدا.
    2. لالطبقة العليا، وإعداد 4 × 1 L قوارير مع بعضها تحتوي على 800 مل ده 2 O. إضافة NZY مسحوق (21 جم / لتر) والاغاروز (7.2 غرام / لتر)؛ تخلط جيدا.
    3. لزراعة E. القولونية، إضافة 2.5 غرام من مسحوق NZY إلى كل من 2 × 250 مل قوارير وتحقيق وحدة التخزين إلى 100 ​​مل مع DDH 2
    4. لتأكيد الصواني المستخدمة في الخطوة 8، إضافة 8.4 غرام من مسحوق NZY و 6 غرام من الآغاص إلى 1 L قارورة وتحقيق وحدة التخزين إلى 400 مل مع DDH 2 O.
  2. تغطية افتتاح قوارير مع رقائق الألومنيوم. تخلط جيدا والأوتوكلاف لهم في 121 درجة مئوية، و 15 رطل لمدة 30 دقيقة.
  3. إزالة قوارير (HOT جدا!) من الأوتوكلاف. دوامة بعناية قوارير لخلط آغار والاغاروز، ثم وضعها في 50 ° C حمام الماء. عندما وصلت إلى حمام الماء 50 ° C مرة أخرى، صب من قوارير L 2 (الخطوة 3.1.1) ~ 150 مل من NZY أجار في كل علبة (الطبقة السفلى).
  4. السماح للأجار لترسيخ في RT لمدة 2 ساعة على الأقل، ثم قلب وفتح الأدراج. وضع الجزء السفلي من الصواني على الغطاء، 45 ° قبالة مركز (الشكل 3) واسمحوا الجافة لمدة 30 دقيقة. إغلاق الأدراج وترك O / N في RT.
  5. وفي الوقت نفسه، وإعداد SCS-8 E. ثقافة القولونية لليوم التالي. من واحدة من 250 مل اثنين من قوارير * (الخطوة 3.1.3)، وتأخذ 5 مل NZY مرق (الجدول 3) ونقل إلى العقيمة 14 مل الأنبوب. الملحق مع 62.5 ميكرولتر من المالتوز / MgSO 4 الحل وإضافة 10 ميكرولتر من SCS-8 E. كولاي الأسهم الجلسرين. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة في حين تهتز في 250-300 دورة في الدقيقة. استخدام 15 ميكرولتر من هذه الثقافة لتطعيم 95 مل من مرق NZY (في 250 مل قارورة أسلحة شخصية)، والثقافة O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز (250-300 دورة في الدقيقة).
    * ملاحظة: غيرها من القارورة 250 مل يمكن استخدامها في وقت لاحق لضبط OD للثقافة إذا لزم الأمر (الخطوة 4.1)
  6. تأخذ 1 L قارورة مع آغار (الخطوة 3.1.4)، وتصب ~ 6-7 مل من NZY أجار في 60 ملم الأطباق (وهذا سوف يكون كافيا ل~ 50 الأطباق، وهناك حاجة لخطوة 8). السماح لتتصلب أجار (~ 10 دقيقة)، ثم قلب والتفاف في البلاستيك. يمكن أن تظل هذه الأطباق في 4 درجات مئوية لمدة تصل الى شهر.

4. إعداد صواني لE. القولونية / فج الثقافة (اليوم 2)

  1. التحقق من OD من SCS-8 E. ثقافة القولونية (الخطوة 3.5) على مقياس الطيف.ضبط OD 600-،6 مع NZY مرق (الجدول 3) (الخطوة 3.1.3)، ووضع القارورة على الجليد لوقف النمو والحفاظ على الجليد حتى جاهزة للاستخدام. هذا وسوف تستخدم لخطوات 6.3 و 8.2. يمكن أن تظل هذه الثقافة لمدة 5 أيام في 4 درجات مئوية.
  2. الهواء الجاف جميع الصواني مقايسة (سكب قبل يوم واحد) ل~ 5 ساعة (الشكل 3).

5. التعبئة والتغليف من الجينوم الحمض النووي (اليوم 2؛ تتمة)

  1. أخذ العدد المطلوب من البرتقال Transpack أنابيب خارج الفريزر -80 درجة مئوية ووضعها على الثلج الجاف حتى جاهزة للاستخدام، واتخاذ واحد البرتقال Transpack أنبوب لكل رد فعل التعبئة والتغليف التي يتعين القيام بها. تسمية كل أنبوب بشكل مناسب. لديها عينات الحمض النووي الجيني (الخطوة 2.9) على استعداد على الجليد.
  2. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة أنبوب واحد في ذلك الوقت. الانتهاء من الخطوة كاملة قبل الانتقال إلى عينة من الحمض النووي المقبل. ذوبان الجليد أنبوب واحد البرتقال * ملاحظة 1 بسرعة: استخدام أصابعك حتى يتم إذابة أكثر من ذلك، ثم وضععلى الجليد. أخذ عينة من الحمض النووي الجيني المقابلة ونقل 8-12 ميكرولتر عينة * ملاحظة 2،3 فورا إلى أنبوب البرتقال. خلط محتويات بواسطة pipetting بلطف صعودا ونزولا 3X، فضلا عن التنصت بلطف الأنبوب بإصبعك. ليس محاولة لإدخال فقاعات عند خلط. وضع أنبوب في 30 ° C حمام الماء لمدة 90 دقيقة.
    * ملاحظة 1: تدور السريع في microcentrifuge قد يكون من الضروري جمع كل المحتويات من داخل الجدران والسقف.
    * ملاحظة 2: حجم العينة واضاف يعتمد على عدد من الخلايا المستخدمة لتوليد تلك العينة: 11-12 ميكرولتر من عينات أعدت 2،0-5،0 × 10 5 خلايا، و 10 ميكرولتر من 1.0 × 10 6 عينات الخلايا، و 8 ميكرولتر 1.5 × 10 6 عينات الخلايا.
    * ملاحظة 3: الحمض النووي لا يزال لزجة جدا، واتخاذ الحمض النووي للخروج، ودفع طرف الماصة إلى أسفل أنبوب العينة وبعناية تحريف تلميح حول ضد الجدار الداخلي للأنبوب.
  3. تأخذ 1 أو 2 الأزرق Transpack تو* بيز خارج الفريزر -80 درجة مئوية ووضعها على الثلج الجاف حتى استخدامها مرة أخرى. ذوبان الجليد عليها بسرعة ونقل 12 ميكرولتر إلى كل من أنابيب البرتقال. مزيج الحل بواسطة pipetting بلطف صعودا وهبوطا 3 مرات. تدور أنبوب أسفل لمدة 2-3 ثانية، ثم اضغط على أنبوب بإصبعك لمزيد من الخلط وعلى الفور إعادته إلى 30 ° C حمام الماء لمدة 90 دقيقة أخرى.
    * ملاحظة: استخدام 1 أنبوب الزرقاء لمدة 5-6 ردود الفعل و2 أنابيب الزرقاء لمدة 10-12 ردود الفعل.
  4. بعد 90 دقيقة، وتمييع كل تفاعل مع العازلة 970 ميكرولتر SM * (الجدول 3) لوقف رد فعل ودوامة على سرعة متوسطة لمدة 5 ثوانى. وضع أنابيب على الجليد حتى استخدامها مرة أخرى.
    * ملاحظة: إذا كان عدد الخلايا ≤ 5 × 10 500 ميكرولتر استخدام SM العازلة (الجدول 3) لوقف رد الفعل؛ 2 أنابيب (من نفس العينة) ثم يمكن الجمع في وقت لاحق (الخطوة 6.4).

6. الطلاء المغلفة الجينوم الحمض النووي (اليوم 2؛ تتمة)

  1. إغلاق أجار ر مقلوبالأشعة التي تم فتحها لتجفيف في الصباح. تسمية الصواني لكل عينة.
  2. حل 4.8 غرام من X-غال في 16.8 مل من N، N-ثنائي ميثيل (اللازمة للخطوة 6.5). يقلب على الفور وضعت على منصة شاكر. حماية ضد الضوء. وينبغي أن يكون حل واضح في 20-30 دقيقة.
  3. قسامة SCS-8 E. الخلايا القولونية. لكل مجموعة من صواني * استخدم إحدى أنبوب 50 مل المخروطية. تسمية أنبوب مع اسم عينة من الحمض النووي تعبئتها. إضافة 2 مل من E. التعليق القولونية لكل علبة.
    * ملاحظة: على سبيل المثال يتطلب 3 × 10 5 غمبس مجموعة من 8 الصواني (انظر الجدول 1). وبالتالي، وهما مأخوذة، تتطلب 8 × 2 = 16 الصواني. إبقاء مأخوذة فصل وبالتالي إعداد اثنين من 50 مل أنابيب، مع كل 8 × 2 = 16 مل E. التعليق القولونية.
  4. إضافة 1 مل من عينة من الحمض النووي * تعبئتها (من الخطوة 5.4) لمناسبة 50 مل أنبوب يحتوي على SCS-8 E. قسامة القولونية وتخلط جيدا. احتضان هذا E. القولونية / خليط فج في incu الهزباتور (250-300 دورة في الدقيقة)، عند 37 درجة مئوية لمدة 23 دقيقة.
    * ملاحظة: إذا تم استخراج الحمض النووي من ≤ 5 × 10 5 خلايا، تم استخدام 500 ميكرولتر من العازلة SM لوقف رد الفعل (الخطوة 5.4). في هذه الخطوة، والأنابيب ويمكن الجمع بين واحدة تضاف إلى 50 مل أنبوب مخروطي.
  5. عندما E. خليط القولونية / فج ويحتضنها، وبدء التحضيرات للقمة طبقة الاغاروز. إضافة 5 مل من X-غال / N، N-ثنائي ميثيل الحل (الخطوة 6.2) إلى كل قارورة 800 مل من أعلى طبقة فحل الاغاروز (من الخطوة 3.1.2؛ يحتفظ بها في 50 درجة مئوية). سوف تركيز النهائي من X-غال يكون 1.5 ملغ / مل. وX-غال قد يعجل قليلا عندما تضاف إلى الاغاروز. دوامة بحل X-غال ووضع الزجاجة مرة أخرى في حمام مائي 50 ° C.
  6. اتخاذ E. خليط القولونية / فج للخروج من الحاضنة (الخطوة 6.4). يتطلب كل عينة الصواني متعددة؛ كل علبة، ويتطلب 50 مل من محلول X-gal/agarose (الخطوة 6.5). صب حجم المطلوب من X-gal/agarose لكل عينة (أي 50 مل سعدد من صواني) في زجاجة بلاستيكية معقمة أكبر وإضافة E. المناسبة القولونية / خليط فج. دوامة الزجاجة إلى المزيج. تقسيم الخليط في aliquots من 45-50 مل في 50 مل أنابيب المخروطية. يجب أن يكون عدد من أنابيب نفس عدد الصواني المطلوبة لتلك العينة.
    ملاحظة: سيتم استخدام الحل X-gal/agarose متبقية في الخطوة 8.3. ويمكن تخزين الحل في 50 ° C حمام الماء حتى استخدامها مرة أخرى.
  7. صب 50 مل من أعلى خليط الاغاروز عبر النصف السفلي من علبة الفحص. وسرعان ما انتشر في الاغاروز عن طريق إمالة علبة مقايسة قليلا في اتجاه واحد.
    ملاحظة: سوف الاغاروز يبرد بسرعة كبيرة وسوف يصبح من المستحيل موزعة على الدرج. وبالتالي، تحتاج هذه الخطوة التي يتعين القيام بها بسرعة نسبيا ومع الاغاروز التي تم الاحتفاظ بها في 50 درجة مئوية.
  8. السماح للالاغاروز الأعلى لتتصلب لمدة 15 دقيقة على الأقل. ثم، عكس وفتح الأدراج مقايسة السماح لهم الهواء الجاف لمدة 30 دقيقة (الشكل 3). إغلاق الصواني، صواني فحص احتضان مقلوب (القاع أجار الجانب طبقة في الأعلى) عند 37 درجة مئوية لمدة 15-16 ساعة. لا كومة أكثر من 5 الصواني.

7. تقرير من التردد المزعومين المسخ (اليوم 3)

  1. إزالة الأدراج من 37 درجة مئوية الحاضنة والسماح لهم يبرد. عد الوحدات شفافة البلاك تشكيل (PFU) على كل علبة؛ عشوائيا اختيار ما بين 2 مواقع على الأدراج، رسم مربع * 2.5 × 2.5 سم 2 أو 5 × 5 سم 2 وتعول كل PFUs في كل مربع مع ​​عداد الخلايا وسم (الشكل 4A، B).
    * ملاحظة: لرسم مربع استخدام جهاز كما هو مبين في الشكل 5. إذا كان ≥ عدد عدها PFUs 40، استخدم مربع أصغر، وإلا فإن استخدام أكبر.
  2. تأخذ متوسط ​​المربعات عد وتتضاعف بنسبة 96 إذا عد مع مربع أصغر، أو مضاعفة هذا العدد بنسبة 24 إذا عد مع واحد كبير. إضافة عدد PFUs تحسب لجميع الصواني من سالي عينة. هذا هو العدد الإجمالي للPFUs المتولدة عن تلك العينة.
  3. المقبل، عد لويحات متحولة في كل علبة. فترت الآن الأدراج أسفل، والتي سوف تساعد على تحديد أماكن لويحات متحولة. لمزيد من تسهيل اكتشاف لويحات زرقاء، حرك علبة على سطح أحمر و / أو أبيض؛ ورقة حمراء وبيضاء تعمل بشكل جيد. دائرة أي اللوحة الزرقاء مع القلم علامة. تسجيل شكل وكثافة اللون الأزرق من كل متحولة (على سبيل المثال الكامل، دائرة، والقطاع؛ الشكل 4C) 36،37.
  4. تحديد وتيرة متحولة المفترضة لكل عينة بقسمة عدد متحولة PFUs (الخطوة 7.3) من إجمالي عدد PFUs (الخطوة 7.2).

8. التحقق من المسخ المزعومين لويحات (اليوم 3-5)

  1. باستخدام ماصة باستور، جوهر كل متحولة (الازرق) PFU ونقل المكونات إلى 250 ميكرولتر العقيمة العازلة SM (الجدول 3). إضافة 25 ميكرولتر من كلوروفورم، دوامة لمدة 5 ثوانى ود تخزينها في 4 درجة مئوية لمواصلة في اليوم التالي أو يترك لمدة 2 ساعة على RT قبل المتابعة إلى الخطوة التالية، للتحقق من أن متحولة PFU هو في الواقع متحولة. ويمكن تخزين العينات في 4 درجات مئوية لمدة لا تقل عن سنة 1.
  2. تسمية واحدة واحدة 1 مل 4 مل أنبوب معقم لكل الطافرة التي تم توصيله. في 1 مل أنبوب جديد، يخفف من فج معلق صدر عن التيار أجار (الخطوة 8.1) 01:50 العازلة في SM العقيمة (2 ميكرولتر من العينة إلى 100 ​​ميكرولتر العازلة SM (الجدول 3))، دوامة لفترة وجيزة، توضع جانبا. إلى 4 مل أنبوب العقيمة إضافة 200 ميكرولتر SCS-8 E. ثقافة القولونية (من الخطوة 4.1) و 2 ميكرولتر من فج مخففة من المقابلة 1 مل أنبوب، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة.
  3. إضافة 2.5 مل من الاغاروز أعلى تحتوي على X-غال (اليسار أكثر من الخطوة 6.6) لكل 4 مل أنبوب، أنبوب دوامة خلط وتصب في الصعود إلى 60 ملم NZY وحة آغار سكب سابقا (الخطوة 3.6). يترك لمدة 10 دقيقة (للسماح رانه أعلى يصلب الاغاروز)، عكس الطبق واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
  4. في صباح اليوم التالي، وإزالة الطبق من الحاضنة وتحديد نسبة من اللون الأزرق PFUs على كل طبق (الشكل 6). عند 70٪ أو أكثر من PFUs هي الأزرق ويعتبر متحولة أكد 38،39. الأساسية للوحة متحولة من الطبق ووضع في أنبوب 1.5 مل المسمار العلوي، تحتوي على 250 ميكرولتر العازلة SM (الجدول 3) و 25 ميكرولتر كلوروفورم، بل هو الآن على استعداد للالتسلسل.
  5. عند 50٪ أو أقل من PFU باللون الأزرق، وأنه لا يعتبر 38،39 متحولة الحقيقي. عندما تردد من اللون الأزرق PFUs ما بين 60-70٪، والتحقق مرة أخرى مع في الملاحظات حول شكل اللوحة، وإذا كان شكل PFU "الكامل"، والمضي قدما مع التسلسل.

9. تسلسل لالطفرات في اسي G إيني

  1. إنشاء تفاعلات PCR في حجم رد الفعل 25 ميكرولتر، بما في ذلك 1.5 μ؛ لتر من طاف وحة (قالب، خطوة 8.4)، التمهيدي إلى الأمام SF1 (5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3 ') وSR2 التمهيدي العكسي (5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3). استخدام عدة البلمرة PCR الموسع طق وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. شروط ركوب الدراجات هي على النحو التالي: 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، ثم 35 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها الخطوة النهائية من 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق .
  2. اتخاذ قسامة 5 ميكرولتر من كل رد فعل وتشغيلها على 0.8٪ agarose هلام، لتأكيد التضخيم.
  3. تنظيف تفاعلات PCR باستخدام طقم تنظيف Augencourt وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  4. Quantitate قالب الحمض النووي.
  5. استخدام ~ 100 نانوغرام من الناتج PCR كما الحمض النووي القالب لتسلسلها. amplicons تسلسل في كلا الاتجاهين باستخدام نفس الاشعال PCR كما الاشعال التسلسل (انظر أعلاه).
  6. تجميع سلاسل وتتماشى مع تسلسل المرجعية اسي 40 للكشف عن mutatiإضافات.

Representative Results

في الجسم الحي الطفرات فحص يقيس حدث نادر (PFUs متحولة) من بين العديد من الأحداث (كل PFUs). عن طريق إجراء فحص مع عدد صغير من الخلايا، فمن الممكن أن حصيلة يتأثر إلى حد كبير من خلال النتائج الإيجابية الكاذبة والسلبية الكاذبة. لمعالجة هذه المسألة أجرينا تجربة التخفيف المتسلسل مع خلايا نخاع العظم غير المجزأ، تحصد من ثلاثة حيوانات مختلفة. قمنا بقياس التردد متحولة في نخاع العظام من هذه الحيوانات باستخدام 1.4 × 10 7.0 × 10 3.5 × 10 و 1.75 × 10 5 خلايا. نتائج (الشكل 7) تبين وجود علاقة خطية بين عدد الخلايا المدخلات وعدد من ولدت في PFU. الأهم من ذلك أن التردد متحولة غير متناسقة، سواء تم قياسه مع أرقام منخفضة أو عالية من الخلايا. على الرغم من عدم اختباره مباشرة (بسبب قلة الخلايا)، وليس هناك سبب للاعتقاد بأن هذا ليس هو الحال بالنسبة لLSKs وغمبس.

ر "> أهم خطوة في هذا الاختبار هو الطفرات عزل الحمض النووي الجيني (الخطوة 2). على الرغم من أن تركيز الحمض النووي ينبغي من الناحية المثالية أن ≥ 500 نانوغرام / ميكرولتر، هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد مع 40-150 نانوغرام / ميكرولتر. الأهم من ذلك هو نسبة 260/280 (هذا ينبغي أن يكون> ​​1.8-2.0) والوزن الجزيئي (يجب أن يكون حول 300-500 كيلو بايت). ومن الموصى به عند واحد ليس على دراية فحص للتحقق من جودة وحجم الحمض النووي المعزولة ويبين الشكل 8 مثالا على المدى الكهربائي من الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي.

علامات من PFUs الفردية على صينية هو مبين في الشكل 4B تمثل كثافة معقولة وقابلة للتحقيق لويحات عندما يبدأ المرء مع عدد صغير من الخلايا تنقيته؛ صينية ينبغي أن تعقد بين 40-150 PFUs / مربع صغير. في هذه التجربة خاصة، مربع صغير في الشكل 4B يحتوي على 103 لويحات. ساحة أخرى على الدرج، كما هو موضح في الزاوية العليا من الشكل 4A 41، لأننا نستخدم صواني أصغر قليلا ولم 12،000 PFUs على هذه الصواني لا تسمح لنا التمييز جيدا بين لويحات الفردية.

الشكل 4C يظهر أمثلة على أنواع مختلفة من اللوحات الزرقاء التي يمكن ملاحظتها. في الطفرات فحص اسي، مورفولوجية لويحات (أي كامل، القطاع أو الدائرة) هو مؤشر على أصل الطفرة؛ الكامل هو طفرة من أصل الماوس، في حين أن من المرجح ويتم إنتاج اثنين آخرين في E. القولونية 36،37. على replating (انظر المرضس الشكل 6)، وكلها تقريبا لويحات "الكامل" استنساخ اللوحات الزرقاء> 70٪ مرة أخرى، في حين سوى جزء صغير جدا من لويحات القطاع القيام به، وتقريبا لا شيء من لويحات دائرية غالبا ما تكون أصغر.

ويبين الجدول (2) واستنساخ تشكيل اللوحة مع أعداد صغيرة نسبيا من الخلايا تنقيته مقارنة بما كان عليه مع أعداد كبيرة من خلايا نخاع العظام (نفس المجموعة من الخلايا حيث تم فرز الخلايا من) وخلايا الطحال.

وأكد PFUs متحولة، أول من replating (ويبين الشكل 6 أمثلة ممثل أطباق لتأكيد متحولة الأساسي (الأزرق) PFUs) وثانيا، عن طريق التسلسل. تأكيد الأطباق في الشكل (6) التي تحتوي على PFUs الزرقاء> 70٪ (أسفل اثنين) أن متحولة نشأت في الماوس (وليس في كولاي). ومع ذلك، يظهر أعلى يسار الطبق لا PFUs الأزرق، وبالتالي، لا ينبغي أن تحسب على PFU الأولية متحولة كما وsequencing ليست ضرورية. يظهر الطبق حق ~ PFUs الأزرق 65٪. اعتمادا على شكل لوحة الأولية، سيتم إرسال هذه العينة من لتسلسل (انظر الخطوة 8.4). وإلا إذا تحور الحمض النووي يمكن التأكد من التسلسل تحسب هذه PFU كما متحولة. إذا لم تكن متأكدا حول شكل PFU، تسلسل!

الشكل 1
الشكل 1. هيئة السلع التموينية-1 تلطيخ على خلايا نخاع العظام من النوع البري الفئران C57BL6 (B6)، والفئران المعدلة وراثيا اسي (اسي) وابنا للعبور بين هذه الخلايا (B6 س اسي). نخاع العظام اثنين من الفئران B6 تعبير عن هيئة السلع التموينية- 1 على سطح الخلية، وهذه الخاصية تستخدم لتنقية الخلايا الجذعية والسلف. الفئران المعدلة وراثيا اسي على خلفية B6، ومع ذلك، لا تعبر عن هيئة السلع التموينية-1؛ يجب أن يكون قد فقدت هذه العلامة ذوي الخوذات البيضاء إيل إنشاء المستعمرة. لإعادة هيئة السلع التموينية-1 في الفئران المعدلة وراثيا اسي، وقد عبرت هذه الفئران مع الفئران العادية B6.

الرقم 2
الشكل 2. نظام غسيل الكلى الحمض النووي. ثلاثة أغشية عقد محلول الحمض النووي لزجة في المركز (باللون الأزرق لأفضل التصور) تطفو على TE العازلة. السهام الحمراء تشير النكات صغيرة في الغشاء، والتي تستخدم لتحديد العينة.

الرقم 3
الرقم 3. كفاءة طريقة لتجفيف 60 أو أكثر أجار / الاغاروز الصواني التي تحتوي على.

gether.within صفحة = "دائما"> الرقم 4
الشكل 4. الكشف عن وحدات تشكيل لوحة (PFUs). مصورة هي (أجزاء) صواني كبيرة أجار (مبين في الشكل 3) مع المستعمرات الأولية للمصاب فج E. القولونية. (A) يظهر هو واحد وحة كاملة مع 2 مربعات صغيرة مرسومة على أنه عد لويحات. يظهر إدراج الحمراء الموسع في (B). (ب) كل فرد أسود علامة نقطة واضحة تشير إلى نوع البرية PFU في لوحة أجار (103 في المجموع). (C) أشكال مختلفة من PFUs يحتمل أن تكون متحولة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

s/ftp_upload/50752/50752fig5highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/50752/50752fig5.jpg "/>
الرقم 5. زجاجي عد المربعات. صورت هي ساحة العد الصغيرة والكبيرة. القياسات الداخلية للمربع كبير هي 5 سم × 5 سم، وذلك من مربع صغير 2.5 سم × 2.5 سم.

الرقم 6
الرقم 6. تأكيد من وحدات متحولة البلاك تشكيل (PFUs). أظهرت هي تلقيح 4 أطباق صغيرة في اليوم السابق مع مخفف من PFU الأزرق. يظهر الطبق العلوي الأيسر لا PFUs الأزرق. يظهر الطبق اليمنى العليا ~ PFUs الأزرق 65٪. تظهر الصواني أقل اثنين PFUs الأزرق 80-90٪ (يسار) وPFUs الأزرق 100٪ (يمين). السهام الحمراء تشير اضحة (النوع البري) PFUs.

إعادة 7 "FO: محتوى العرض =" 4IN "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50752/50752fig7highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/50752/50752fig7.jpg "/>
الرقم 7. تردد المسخ في نخاع العظم غير المجزأ. مصورة هي (A) عدد PFUs، (ب) عدد من المسوخ و (C) تردد متحولة قياس في ثلاثة حيوانات مختلفة (24-26 شهرا)، والتي تمثل بواسطة ألوان مختلفة. لكل الماوس، وأجريت القياسات على أربعة أحجام عينة مختلفة: 1.4 × 10 7.0 × 10 3.5 × 10 و 1.75 × 10 5 خلايا. تشير البيانات إلى أن ضمن هذا النطاق من الخلايا، حجم العينة لا تؤثر تأثيرا كبيرا قياسات التردد متحولة.

الرقم 8
تينلدى عودتهم 8. الكهربائي النبضي الميدان عالية الجزيئية عينات من الحمض النووي من خلايا معزولة الوزن النقي. تم عزل الحمض النووي الجينوم كما هو موضح في الخطوة 2 من البروتوكول وتشغيلها على نظام بيو راد (CHEF-DR الثالث). مختلف العينات تحميلها على هلام هي عينات الحمض النووي المعزولة من الكبد (لي؛ حارة 1)، وخلايا نخاع العظام المنضب من النسب ناضجة + الخلايا (LB؛ ممرات 2 و 14)، وخلايا CD34 + LSK (L؛ حارة 6)، CMPS (الممرات 7-9)، غمبس (الحارات 11 و 12) وهيئة السلع التموينية-1 + الخلايا (S؛ حارة 15). 4 حارات يحمل الحمض النووي للسلم عالية الوزن الجزيئي. يظهر في الصورة أن الغالبية العظمى من الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي (> 600 كيلو بايت).

الجدول 1. عينة المعلمات المتنوعة للسكان تنقيته، ونخاع العظام والطحال كله. استخدام هذا الجدول في الأماكن المحددة في البروتوكول. وأشارت لكل السكان على القمة، وعدد الخلايا (5 × 10) في قسامة، والوقت الهضم الحمض النووي، وحجم عينة من الحمض النوويبعد غسيل الكلى، وأشار عدد من التفاعلات المطلوبة لكل قسامة وعدد من الصواني المطلوبة لكل قسامة على اليسار. الأوقات الهضم عند 50 درجة مئوية هي حاسمة لنجاح التجربة.

الجدول 1

LSK = لين - هيئة السلع التموينية-1 + كيت + + الخلايا؛ CMP = ملتزمة السلف النخاعي؛ GMP = المحببات / الوحيدات السلف؛ WBM = (لم يتم فرزها) نخاع العظام بأكمله. ويتم فرزها خلايا الطحال.

الجدول 2. كفاءة تشكيل لوحة يمكن مقارنتها بين السكان مختلفة من الخلايا. يبين هذا الجدول تشكيل لوحة من بين مجموعات سكانية مختلفة. واستخدمت القديم أشهر ستة C57BL / 6 الفئران لهذه التجارب (عظام الفخذ والظنبوب من 10-11 الفئران في التجربة، 6 تجارب في المجموع). لكن كل واحد من الأعداد المستخدمة في هذه التجارب الجا لقد 1 على الأقل، وتصل إلى 24، (أكد) متحولة PFUs (تشو وآخرون، مخطوطة قيد الإعداد). قد تختلف أرقام PFU في سلالة الفأر.

الجدول 2

LSK = لين - هيئة السلع التموينية-1 + كيت + + الخلايا؛ CMP = ملتزمة السلف النخاعي؛ GMP = المحببات / الوحيدات السلف؛ WBM = (لم يتم فرزها) نخاع العظم كله * خلايا الطحال والتي لم يتم فرزها. SD = الانحراف المعياري.

الجدول 3. تعليمات من أجل التحضير للكواشف إضافية.

الجدول 3

§ من كتيب التعليمات Stratagene من عزل الحمض النووي كيت RecoverEase

> من كتيب التعليمات Stratagene من استخراج التعبئة والتغليف Transpack

Discussion

ويستند في الجسم الحي الطفرات مقايسة الموصوفة هنا على اسي نموذج الفأر وراثيا ولدت في الأصل من قبل كولر وآخرون 18 وهذا النموذج يستخدم ناقلات λ فج يحمل الجين مراسل اسي. اثنين كوس مواقع المرافقة ناقلات تسمح للانتعاش بسيط نسبيا والتعبئة والتغليف لاحقة الى جزيئات فج المعدية، وتستخدم لتصيب E. القولونية. سيتم إنشاء لوحة زرقاء عن طريق المصابة فج E. كولاي التي تحتوي على الجين المتحور اسي. يتم تعيين لوحة زرقاء على خلفية عديم اللون، وبالتالي تبسيط كبير في مهمة التهديف متحولة. ويمكن استخدام تقنيات تسلسل الحمض النووي لتحديد موقف ونوع الطفرة التي حدثت، والتي قد تساعد على مزيد من التحقيقات في الآليات الكامنة وراء الطفرات.

التعديلات التي قطعناها على أنفسنا لبروتوكول هذه الطفرات فحص تسمح لأحد لاستخدامه مع نظام مراقبة الأصول الميدانية hematopoie تنقيته-السكان الخلية عرة. ومع ذلك، وجدنا أن تحليل استنساخه لا يزال يحتاج على الأقل 2 × 10 5 الخلايا المكونة للدم لضمان كميات كافية من الحمض النووي ذات جودة عالية. منذ تواتر طويلة الأجل إعادة إسكانها HSCs منخفضة للغاية 29، إجراء تحليل الطفرات على هذه HSCs عند هذه النقطة لا يمكن تحقيقه. السكان التخصيب الخلايا الجذعية التي نستخدمها في هذا البروتوكول، وخلايا LSK، يحتوي بالإضافة إلى FLK-2 - على المدى الطويل إعادة إسكانها HSCs، كما FLK-2 - على المدى القصير إعادة إسكانها HSCs وFLK-2 + الخلايا، والتي تمثل السلف multipotential الخلايا (ميجابايت في الثانية) 42. على الرغم من هذا القيد نشعر أن استخدام الخلايا LSK بمثابة قراءة التدريجي لHSCs الطفرات في هذا الاختبار هو معقول منذ تبين أن الخلايا LSK تتصرف أشبه LSK-FLK-2 - HSCs من حيث الاستفادة من الخلايا الاصلية NHEJ 5. وعلاوة على ذلك، والعمل من روسي وآخرون. 8 ميجابايت في الثانية تشير إلى أن أفضل في النسخ مع damagالحمض النووي إد من HSCs، وخصوصا عندما يتقدمون في السن، مما يؤدي بنا إلى افتراض أن عدد من المسوخ وجدت في السكان LSK يعكس ذلك من HSCs بدلا من ميجابايت في الثانية.

منذ يتم الحصول على أعداد صغيرة من الخلايا مرتبة في كل تجربة، وهذه مسألة هامة للنظر في مرحلة التخطيط لهذه الطفرات في الجسم الحي الفحص، هو حجم العينة (أي عدد لويحات لكل عينة) اللازمة لتحقيق دلالة إحصائية. وبعبارة أخرى، عندما يكون الهدف هو، على سبيل المثال، مقارنة التردد تحور الخلايا LSK التلاعب بها لمن النوع البري الخلايا السيطرة LSK، كم من لويحات في مجموع مطلوبة من أجل كل السكان LSK لاكتشاف الفرق اثنين أو ثلاثة أضعاف في تردد طفرة؟ من المذكرة، فإن العدد الإجمالي لويحات يمكن الجمع من كل التجارب، منذ وجدنا لا يوجد فرق كبير بين التجارب الفرز، على الأقل في الخلايا من النوع البري، استنادا إلى تحليل الانحدار السلبي ذي الحدين 43. لوحة الأسطواناتBERS هي المهم أن نعرف لأن ذلك سيحدد عدد من أنواع التي تحتاج إلى أن يتم تنفيذ (~ 10،000 لWBM وغمبس و~ 7،000 لالطحال، وLSKs CMPS). منذ ترددات طفرة صغيرة في البرية من نوع الأنسجة 44، تقريب العادي مقارنة إحصائيا هذه ليست دقيقة. لهذا السبب، ونحن نستخدم توزيع بواسون، لأنه يقترب من توزيع ذي الحدين صحيح (من وتيرة الطفرة) عندما يكون هذا التردد هو صغير وحجم العينة هو نسبي كبير؛ هوفمان 45 يوفر الصيغة (المعادلة 4) لحساب حجم العينة على أساس على توزيع بواسون. عندما يطبق على الترددات الافتراضية تحور 2.5 و 4 و 7 الطفرات لكل 100،000 الخلايا في الخلايا السيطرة 44، نطلب 456949 الأوبئة، و285592 163196، على التوالي، لاكتشاف الفرق شقين كبيرة (اختبار عينة اثنين مع اثنين من أهمية الذيل من 0.05 و 0.80 قوة). أقل مطلوبة لويحات للكشف عن ثلاثة أضعاف-الفرق: 122148، 76342، 43624 و، على التوالي. وبالتالي، فإن عدد لويحات المطلوبة لكل السكان من الاهتمام (وبالتالي عدد من أنواع الخلايا اللازمة للحصول على ما يكفي) يعتمد على وتيرة الطفرة التي يمكن توقعها في السكان الخلية التحكم وتوقع أضعاف التغير في عدد السكان مقارنة.

أهم خطوة في هذا الاختبار هو الطفرات عزل الحمض النووي الجيني (الخطوة 2). على الرغم من أنه أمر ضروري لبدء هذا البروتوكول مع عينات الحمض النووي جودة عالية (انظر "نتائج ممثل")، عند العمل مع الخلايا التي تم فرزها، أرقام الخلية غالبا ما تكون محدودة، ولا يمكن أن يضيع على تحديد تركيز الحمض النووي أو حجمها. وجدنا أن مؤشر جيد آخر للجودة عينة من الحمض النووي هو اللزوجة، وفي خطوة 2.9 يجب أن تكون العينة لزج للغاية ويصعب التعامل معها. أنه يتطلب بعض الممارسة للحصول على هذه الخطوة الصحيحة. وبالتالي، فمن المستحسن للعمل على بروتوكول مع أعداد الخلايا الكبيرة، على سبيل المثال مع نخاع العظم كله أو فرزها هيئة السلع التموينية-1 + الخلايا، والحصول على راحة مع عزل الحمض النووي من هذه العينات ومعرفة كيفية الحكم على نوعية الحمض النووي عن طريق اللزوجة.

نوعية وحجم الحمض النووي يؤثر على عدد من PFUs إنشاؤه. عندما يكتمل الخطوة عزل الحمض النووي، وعنصرا هاما المقبلة من تحقيق الاستفادة المثلى من الاختبار هو كثافة PFUs في الدرج. ويبين الجدول 1 عدد الموصى بها من صواني لاستخدام لكل نوع من عينة المقابلة لأرقام الأمثل للخلايا لتلك العينة. ينبغي استخدام هذا المبدأ التوجيهي يؤدي في الصواني حيث لا يزال من الممكن تمييزها ويحات الفردية، ومع ذلك لا تنتشر رقيقة جدا. صينية ينبغي أن تعقد بين 40-120 PFUs في مربع صغير، والمثال هو موضح في الشكل 4B يمثل كثافة معقولة. عملت مع هذه الجوانب الأمثل للخروج، وعدد من PFUs ولدت في العينة كفاءة عالية واستنساخه (الجدول 2).

"> وقد تم استخدام نموذج الفأر وراثيا اسي مع مجموعة متنوعة من الأنسجة الأخرى، ولكن ليس بالتزامن مع أعداد صغيرة نسبيا من السكان العالية النقاء. عندما يطبق على الأخرى (من لدم) الجذعية السكان التخصيب خلية المقيدة الأنسجة، فمن المستحسن على إيلاء اهتمام خاص لإجراءات عزل الحمض النووي؛ أنها قد تختلف من نوع من الخلايا إلى نوع من الخلايا والخلايا المكونة للدم توصية قد لا تعمل بالضرورة لأنواع الخلايا الأنسجة الأخرى والعوامل الحاسمة، مثل كمية من الكواشف، ودرجة الحرارة التي يحتاج بروتين K الهضم لتأخذ مكان، والأهم من ذلك، سوف تحتاج إلى بروتين K الوقت الهضم إلى أن عملت بها لكل نوع من الخلايا، وهذا البروتوكول قد تكون بمثابة نقطة انطلاق.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

نود أن نشكر ديفيد رودريغيز، MA لتصميم الرسوم البيانية والتصوير في هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من خلال تمويل من GCCRI، المعاهد الوطنية للصحة / NIA (5R21AG033339) ودعم مركز السرطان غرانت (P30CA054174) إلى مرفق UTHSCSA التدفق الخلوي الأساسية ومرفق UTHSCSA المتقدم الأحماض النووية الأساسية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LacI transgenic mice  BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail Agilent Technologies (Stratagene) 720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli Agilent Technologies (Stratagene) 200221
DNA size standards – lambda ladder Bio Rad 170-3635
0.025 mM Pore size membranes  Fisher (Millipore) VSWP 025 00
245 mm2 Bioassay dishes (trays)  Fisher (Corning) 07-200-600
NZY broth (powder) Fisher (Teknova) N1144
Agar Fisher BP1423-500
Agarose Fisher E-3120-500
N,N-Dimethylformamide Fisher AC34843-5000
X-gal Research Products Intl Corp (RPI) B71800-10.0
Proteinase K Roche 3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit 5 PRIME 2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit Beckman/Coulter A63880

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim. Biophys. Acta. 1790, (10), 963-969 (2009).
  2. Aguilera, A., Gomez-Gonzalez, B. Genome instability: a mechanistic view of its causes and consequences. Nat. Rev. Genet. 9, (3), 204-217 (2008).
  3. Milyavsky, M., et al. A distinctive DNA damage response in human hematopoietic stem cells reveals an apoptosis-independent role for p53 in self-renewal. Cell. Stem Cell. 7, (2), 186-197 (2010).
  4. Mohrin, M., et al. Hematopoietic stem cell quiescence promotes error-prone DNA repair and mutagenesis. Cell. Stem Cell. 7, (2), 174-185 (2010).
  5. Shao, L., Feng, W., Lee, K. J., Chen, B. P., Zhou, D. A sensitive and quantitative polymerase chain reaction-based cell free in vitro non-homologous end joining assay for hematopoietic stem cells. PLoS ONE. 7, (3), (2012).
  6. Sotiropoulou, P. A., et al. Bcl-2 and accelerated DNA repair mediates resistance of hair follicle bulge stem cells to DNA-damage-induced cell death. Nat. Cell Biol. 12, (6), 572-582 (2010).
  7. Prasher, J. M., et al. Reduced hematopoietic reserves in DNA interstrand crosslink repair-deficient Ercc1-/- mice. EMBO J. 24, (4), 861-871 (2005).
  8. Rossi, D. J., et al. Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age. Nature. 447, (7145), 725-729 (2007).
  9. Reese, J. S., Liu, L., Gerson, S. L. Repopulating defect of mismatch repair-deficient hematopoietic stem cells. Blood. 102, (5), 1626-1633 (2003).
  10. Carney, D. A., et al. Therapy-related myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia following fludarabine combination chemotherapy. Leukemia. 24, (12), 2056-2062 (2010).
  11. Jankowska, A. M., et al. Base excision repair dysfunction in a subgroup of patients with myelodysplastic syndrome. Leukemia. 22, (3), 551-558 (2008).
  12. Tam, C. S., et al. Treatment-related myelodysplasia following fludarabine combination chemotherapy. Haematologica. 91, (11), 1546-1550 (2006).
  13. Webb, S. Xeroderma pigmentosum. BMJ. 336, (7641), 444-446 (2008).
  14. Ben-Yehuda, D., et al. Microsatellite instability and p53 mutations in therapy-related leukemia suggest mutator phenotype. Blood. 88, (11), 4296-4303 (1996).
  15. Casorelli, I., et al. Drug treatment in the development of mismatch repair defective acute leukemia and myelodysplastic syndrome. DNA Repair. 2, (5), 547-559 (2003).
  16. Olipitz, W., et al. Defective DNA-mismatch repair: a potential mediator of leukemogenic susceptibility in therapy-related myelodysplasia and leukemia. Genes Chrom. Cancer. 34, (2), 243-248 (2002).
  17. Haase, D., et al. New insights into the prognostic impact of the karyotype in MDS and correlation with subtypes: evidence from a core dataset of 2124 patients. Blood. 110, (13), 4385-4395 (2007).
  18. Kohler, S. W., et al. Analysis of spontaneous and induced mutations in transgenic mice using a lambda ZAP/lacI shuttle vector. Environ. Mol. Mutagen. 18, (4), 316-321 (1991).
  19. Rogers, B. J., Provost, G. S., Young, R. R., Putman, D. L., Short, J. M. Intralaboratory optimization and standardization of mutant screening conditions used for a lambda/lacI transgenic mouse mutagenesis assay. 327, (1-2), 57-66 (1995).
  20. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, (17), 9073-9078 (1996).
  21. Ward, T. L., Prtenjaca, A., Hill, K. A. A novel Escherichia coli-derived mutation detected with the Big Blue cII mutant selectable assay. Environ. Mol. Mutagen. 51, (4), 344-348 (2010).
  22. Miller, J. H., Coulondre, C., Farabaugh, P. J. Correlation of nonsense sites in the lacI gene with specific codons in the nucleotide sequence. Nature. 274, (5673), 770-775 (1978).
  23. Provost, G. S., et al. Transgenic systems for in vivo mutation analysis. Mutat. Res. 288, (1), 133-149 (1993).
  24. Schaaper, R. M., Danforth, B. N., Glickman, B. W. Mechanisms of spontaneous mutagenesis: an analysis of the spectrum of spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene. J. Mol. Biol. 189, (2), 273-284 (1986).
  25. Schaaper, R. M., Dunn, R. L. Spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene. Genetics. 129, (2), 317-326 (1991).
  26. Burkhart, J. G., Burkhart, B. A., Sampson, K. S., Malling, H. V. ENU-induced mutagenesis at a single A: T base pair in transgenic mice containing phi X174. Mutat. Res. 292, (1), 69-81 (1993).
  27. Valentine, C. R., et al. Characterization of mutant spectra generated by a forward mutational assay for gene A of Phi X174 from ENU-treated transgenic mouse embryonic cell line PX-2. Environ. Mol. Mutagen. 39, (1), 55-68 (2002).
  28. Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20, (12), 3254 (1992).
  29. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, (7), 1109-1121 (2005).
  30. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, (6674), 193-197 (2000).
  31. Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. J. Vis. Exp. (65), (2012).
  32. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, (5272), 242-245 (1996).
  33. Stratagene, Transpack packaging extract for lambda transgenic shuttle vector recovery. Instruction manual. (2001).
  34. Stratagene, RecoverEase DNA isolation kit. Instruction manual. (2009).
  35. Stratagene, Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay system. Instruction manual. (1992).
  36. Nishino, H., Buettner, V. L., Sommer, S. S. Towards validation of the Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay: the mutational spectrum of ex vivo pinpoint mutant plaques. Muta. Res. 372, (1), 97-105 (1996).
  37. Stuart, G. R., Gorelick, N. J., Andrews, J. L., de Boer, J. G., Glickman, B. W. The genetic analysis of lacI mutations in sectored plaques from Big Blue transgenic mice. Environ. Mol. Mutagen. 28, 385-392 (1996).
  38. Bielas, J. H., Heddle, J. A. Proliferation is necessary for both repair and mutation in transgenic mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (21), 11391-11396 (2000).
  39. Paashuis-Lew, Y., Zhang, X. B., Heddle, J. A. On the origin of spontaneous somatic mutations and sectored plaques detected in transgenic mice. Mutat. Res. 373, (2), 277-284 (1997).
  40. de Boer, J. G., Glickman, B. W. The lacI gene as a target for mutation in transgenic rodents and Escherichia coli. Genetics. 148, (4), 1441-1451 (1998).
  41. Piegorsch, W. W., et al. Study design and sample sizes for a lacI transgenic mouse mutation assay. Environ. Mol. Mutagen. 25, (3), 231-245 (1995).
  42. Yang, L., et al. Identification of Lin(-)Sca1(+)kit(+)CD34(+)Flt3- short-term hematopoietic stem cells capable of rapidly reconstituting and rescuing myeloablated transplant recipients. Blood. 105, (7), 2717-2723 (2005).
  43. Hilbe, J. M. Negative Binomial Regression. second edn. Cambridge University Press. (2011).
  44. de Boer, J. G., Provost, S., Gorelick, N., Tindall, K., Glickman, B. W. Spontaneous mutation in lacI transgenic mice: a comparison of tissues. Mutagenesis. 13, (2), 109-114 (1998).
  45. Huffman, M. D. An improved approximation to-sample poisson test. Appl. Stat. 33, (2), 224-226 (1984).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics