Subaraknoid Kanama bir fare modeli

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Willis perforasyon intralüminal Circle subaraknoid kanama standartlaştırılmış bir fare modeli tarif edilmektedir. Gemi perforasyon ve subaraknoid kanama intrakranial basınç izleme tarafından izlenir. Buna ek olarak, çeşitli çok önemli parametreler kaydedilir ve fizyolojik koşulları sağlamak için kontrol edilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schüller, K., Bühler, D., Plesnila, N. A Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage. J. Vis. Exp. (81), e50845, doi:10.3791/50845 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bu Video yayında subaraknoid kanama (SAK), standart bir fare modeli sunulmuştur. Kanama Willis perforasyon (KİP) endovasküler Çemberi tarafından uyarılan ve intrakranial basınç (ICP) izleme ile kanıtlanmıştır. Böylece arteriyel dolaşımı çevreleyen subaraknoid boşluk ve serebellar çatlaklar homojen bir kan dağılımı elde edilir. Vücut ısısı, sistemik kan basıncı, kalp hızı ve hemoglobin doygunluk: Hayvan Fizyolojisi, entübasyon, mekanik ventilasyon, ve çeşitli fizyolojik ve kardiyovasküler parametreler sürekli on-line izleme tarafından yapılmaktadır. Bu şekilde serebral perfüzyon basıncı sıkı bir şekilde ekstravaze kan daha az değişken bir hacim içinde elde izlenebilir. Bu farelerde endovasküler filament perforasyon daha iyi standardizasyonu sağlar ve tüm model yüksek tekrarlanabilir yapar. Bu nedenle, vahşi tip ve genetik ve farmakolojik çalışmaları için patofizyolojik hazırly değişmiş fareler.

Introduction

SAK hastalar için en yararlı sonuç ile inme alt tipi olduğu: Hastaların% 40 kanama 1 sonra bir ay içinde ölür ve hayatta kalanlar nadiren klinik olarak olumlu bir sonuç var.

Spontan UAHS (% 80) büyük çoğunluğu, çoğunlukla arter, baziler arter ve orta serebral arter (MCA) 2 iletişim anterior ve posterior boyunca yer intrakranial anevrizmaların yırtılması kaynaklanır.

Bu anevrizma hayvanlarda Modele zordur ve bu nedenle SAK hayvan modelleri ya da subaraknoid boşluk / beyin veya ventriküllere subaraknoid kabın endovasküler delme ile kan enjeksiyonu ile gerçekleştirilir.

Kan hacmi doğrudan 3 kontrol edilebilir gibi cisterna magna içine otolog kan enjeksiyonu yapmak kolay ve tekrarlanabilir. Ne yazık ki SAK fizyopatolojinin bazı yönleri, örneğindamar yaralanması, bu prosedür ile model olamaz. SAK indüksiyonu için başka bir teknik yaklaşım, bir intrasisternal ven 4 açılmasıdır.

Ancak, MCA şube intraluminal CWP modelleri insanlarda patofizyolojisi en yakın 5 prosedür olarak görünmektedir. Yöntem, Veelken ve arkadaşları 6,7 ile Bederson ve arkadaşları tarafından ve aynı zamanda geliştirilmiş ve ilk olarak sıçanlarda tarif edilmiştir. Daha sonra intraluminal perforasyon modeli farelere 8,9 uyarlanmıştır. Bir filament dış karotid arter (ECA) içine sokulur ve iç karotid arter (ICA) ile kafa tabanına ilerletilir. MCA dallanma noktasında filaman gemi deler ve kafatası tabanında subaraknoid boşluk içine bir kanama neden olur. Kan daha sonra çatlamalar ve kan damarları boyunca kalan subaraknoid alana dağıtır. Kanama perforasyon yerinde pıhtı oluşumu durdu, ama rebleedings, WH edilirich hastalarda 10, oluşabilir genellikle zararlıdır. Buna göre, endovasküler lif modeli son yıllarda yaygın olarak kullanılan SAK modeli oldu. Filaman perforasyon modelinde en sık bahsedilen dezavantajı kanama hacmi doğrudan kontrol edilemeyen ve bu nedenle de değişken olabilir olmasıdır. Bu değişkenlik anlamlı hayvan fizyolojisi ve post-hemorajik ICP sıkı kontrolü ile azaltılabilir.

Fareler, genetik olarak modifiye edilmiş suşların çok sayıda mevcut olan büyük avantaj vardır. Ancak, küçük boyutları için cerrahi işlemler büyük türleri, örneğin, sıçan ya da tavşan daha karmaşık olma eğilimindedir. Bu nedenle farelere sıçanlar için geliştirilen tekniklerin küçültülür genellikle fareler hemoglobin saturasyonu ve kalp hızı izleme için çok sınırlı bir vücut ağırlığı ve kan hacmi noninvaziv kan basıncı ve kan gazı analizi için teknikleri yanı sıra gibi örneğin istenen sonuçlara yol açmazmümkün uygulanmalıdır. Buna uygun olarak, mevcut yayının amacı farelerde SAK için filaman delme modeli tanımlamak için ve bu model bir standart ve yüksek ölçüde tekrarlanabilir biçimde yapılabilir ne kadar göstermektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm cerrahi işlemler etik incelemeye tabi ve Yukarı Bavyera hükümeti (referans numarası: 55.2-1-54-2532.3-13-13 ve -2532-136-11) tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar yaklaşık 25 g bir vücut ağırlığına sahip erkek C57BL / 6 fareleri bulunmaktadır.

1.. Hayvan Preparasyon

  1. Bir odacık içine fare koyarak anestezi neden. Hayvan bilincini kaybedene kadar% 5 izofluran ile odasını yıkayın.
  2. Periton boşluğu içine enjekte edilir, önceden karıştırılmış anestezi: fentanil (0.05 mg / kg), midazolam (5 mg / kg) ve medetomidin (0.5 mg / kg). İşlem sırasında önce ve düzenli olarak refleksleri kontrol edin. Anesteziyi muhafaza etmek üzere saat başı başlangıç ​​miktarının üçte birini yeniden enjekte.
  3. Bir 20 G venöz kateter 11 yapılmış bir tüp ile orotracheally entübasyon. Entübasyon eğimli bir platform (30 °) üzerinde hayvan düzeltmek için, bükülmüş forseps ile dilini geri operasyon mikroskobu altında ses telleri görselleştirmek ve trakea içine tüp takıninspirasyon sırasında.
  4. Yüzükoyun pozisyonda fare yerleştirin ve pamuklu bir parça veya bir microcapnograph ile tüpün doğru yerleşimini kontrol edin.
  5. Respiratöre entübasyon tüpü bağlayın. 180-220 nefes / dak ve 200-250 ul bir vuruş hacmi bir frekans ile% 25 oksijen ile takviye oda havası ile fare havalandırın.
  6. Microcapnograph için entübasyon tüpü bağlayın. Havalandırma frekansını ayarlayarak 30 mmHg son ekspirasyon pCO 2 koruyun.
  7. Bir rektal sıcaklık probu yerleştirin ve 37 ° C iç vücut ısısını korumak için de bir ısıtma pedi üzerine hayvan.
  8. Sağ arka pençe üzerinde halka şeklindeki Pulsoximeter sensörü uygulanır.
  9. Bir makas ile kafatası üzerinde cildi açın. Kesi yaklaşık 0.5 cm uzunluğunda ve kulak ve gözün arasında olmalıdır.
  10. Temporal kemik bir neşter ile sol temporal kas teşrih.
  11. Lazer Doppler debimetre (LDF) prob tutkalsol temporal kemik. Tutkal sertleşir kadar sabit bir pozisyonda probu tutun.
  12. Sol temporal kemik içine bir diş matkap ile yaklaşık 1.5 mm çapında bir delik delin. Isı hasarı önlemek için tuzlu su ile kemik soğutun.
  13. Kafatası boşluğunun içine ICP probu yerleştirin. Beyin doku hasarı ve kanama önlemek için dorsal mümkün olduğunca ileri itin.
  14. Prob doğru pozisyonda ise, düzeltmek, ve çimento ile mühür. 5 dakika için çimento kurumasını bekleyin.
  15. Sırtüstü pozisyonda dikkatle fareyi çevirin.
  16. Sürekli kan basıncı izlenmesi için, sol femoral arter kateterize.
  17. Kan basıncı izleme cihazı için femoral kateter bağlayın.

2. SAK İndüksiyon

  1. Çene sternum bir makasla (2 cm) ile deriyi açın. Açık açık bağ dokusunu incelemek ve bir kenara tükürük bezleri itin.
  2. Sol karotis arter (CCA) ortaya çıkarmak ve harekete geçirmek. KoruCCA gibi aynı bağ dokusu kılıf çalışır vagus siniri,. Kranial Taşı ve aynı tekniği kullanarak ICA ve ECA ortaya çıkarmak ve harekete.
  3. Kadar cranially mümkün ECA Arter.
  4. ECA'nın etrafında filament için iki tane daha önceden düzenlemek ligasyonu.
  5. Microclips ile geçici CCA ve ICA tıkamak. Bir mikroklip aplikatör ile microclips yerleştirin. Klipleri nazikçe geri çekerek doğru uygulanır emin olun.
  6. Bir gemi makas ile ECA içine filament yerleştirilmesi için bir delik açın.
  7. ECA içine 12 mm uzunluğa sahip bir Prolene 5-0 filament yerleştirin.
  8. Bir danışıklı ligasyonu ile ekleme siteyi kapatın.
  9. CCA ve ICA bir mikroklip aplikatör ile microclips çıkarın.
  10. ICP yükselir kadar ICA içine bir forseps ile filament ilerlemek. ICP ani yükselişi kanama uyarıldığını gösterir.
  11. Hemen filamanın çekiniz ve pr hem kapatarak ECA Arterardışık earranged ligasyonu. Bu ekleme sitenin dışında kanama önler.
  12. Cilt yarayı dikin.
  13. Başka bir 20 dakika boyunca hayvanın fizyolojik parametreleri izlemek.
  14. ICP ve LDF probları kaldırmak ve cilt yara sütür.

3. Deney Sonu

  1. PBS içinde 20 ml% 4 PFA (4 ° C) ve ardından tuzlu su (oda sıcaklığı) 20 ml transcardially hayvan serpmek.
  2. Kafatasının dışında beyin teşrih. Orta hatta ve yörünge boşlukların arasındaki kafatası kesti. Daha sonra beyinden gelen kemik soyun.
  3. Subaraknoid aralığa kan dağılımını değerlendirmek.

4. Survival Cerrahi Durumunda Düşünceler (video gösterilmemiştir)

  1. Doğrudan anestezi indüksiyon sonrası postoperatif analjezi için Carprofen (4 mg / kg subkutan) enjekte edilir. Postoperatif gözlem süresi boyunca Carprofen (4 mg / kg deri altından), her 24 saat enjekte edilir. Bunun yerine invaziv kan basıncı ölçümü invaziv olmayan kan basıncı izleme sistemi kullanır.
  2. Nalokson (1.2 mg / kg), flumazenil (0.5 mg / kg) ve atipamezol (2.5 mg / kg) deri altından maddeler antagonize anestezi enjektö sonlandırılması için.
  3. Hayvan ekstübe.
  4. Refleksleri kazanmak sonra önceden ısıtılmış odasına hayvan koymak. 24 saat boyunca, yaklaşık 32 ° C 'de hayvan tutun.
  5. Hayvanlar ameliyattan sonra ilk saatlerde spontan solunum ve genel durum düzenli olarak kontrol edilir. Beyin sapı etkilenen ise hayvanların solunum problemleri ve ötenazi olmalı.
  6. Hayvanlar genel durumu ve vücut ağırlığı gibi nörolojik ve duyu eksikliklerinin 15 için her gün kontrol edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ölüm oranı

Cerrahi teknik hakim sonra prosedür ameliyat sırasında hiçbir ölüm temin etmez. Aynı zamanda kanama hemen hemen bütün hayvanlarda elde edilebilir. Postoperatif mortalite hayvanların çoğu ameliyattan sonra (Şekil 5) 1. gün ölüyor ile% 30-40 olduğunu.

ICP SAK sonrası değerleri

Kanama önce ICP yaklaşık 4 mmHg. 120 mmHg ICP keskin bir artış sonuçlar kanama. ICP değerler daha sonra, 5 dakika ile yaklaşık 30 mmHg (Şekil 1) içinde stabilize. 24 saat sonra ICP kanama sonra hala biraz 10 mmHg 5'e kadar yükselir.

SAK sonrası kan basıncı

Kan basıncı hemen indüksiyon (Şekil 2) kanama sonrasında yükselir. Bu, yüksek bir ICP ile başlatılır Cushing refleksi, kaynaklanmaktadır.

SAK sonrası serebral perfüzyon

After kanama indüksiyon serebral perfüzyon dramatik bir azalma izlenebilir. Bireysel olarak farklı bir düzeye reperfüzyon boşaltım (Şekil 3) 5 dakika sonra meydana gelir.

Kan beyin besleyen arterlerin ve serebellar çatlaklar boyunca dağıtır

Bu soğutulmuş% 4 PFA, 20 ml tuzlu su, ardından 20 ml transcardially SAK sonra hayvanlar 3 saat perfüze edildi. Beyin dikkatle uzaklaştırılmış ve subaraknoid aralığa kan dağılımı gözlenmiştir. Kan dorsal korteks karşı beyni besleyen damarların perivasküler alan boyunca dağıtır. Tüm durumlarda, ikinci kan damar dışına dallanma kadar MCA kapalı. Kanama yan ipsilateral kontralateral hemisferde (Şekil 4) daha fazla kanla kaplıydı.

Kan dağıtım ICP artış ile ilişkili değildir

5 hayvan biz ICP d yükselişi olup olmadığı araştırıldı uring SAK subaraknoid kan dağılımı üzerinde bir etkisi vardır. Bir hipotez, SAK sırasında sadece orta ICP artış gösterecek hayvanlar daha sonra korteksin dorsal bölgelerinde dağıtmak değil az ekstravaze kan, sergi olabilir oldu. Biz kafatası tabanında hematom sadece boyutu ICP yükselişi ile ilişkili gibi görünüyor bulundu. Beyin besleyen atardamarların boyunca kan dağılımı farklı ICP pik değerleri ile hayvanlar arasında farklılık yoktu.

Şekil 1
Şekil 1. SAK sonrası 5 hayvanların SAK. Temsilcisi ICP değerlerden sonra ICP değer. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

pload/50845/50845fig2.jpg "width =" 600px "/>
Şekil 2. SAK sonrası 5 hayvanların SAK. Temsilcisi kan basıncı değerlerinden sonra kan basıncı. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. SAK sonrası 5 hayvanların SAK. Temsilcisi lazer Doppler debimetre değerlerden sonra serebral perfüzyon. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 4,
Şekil 4. Beyin besleyen atardamarların boyunca kan dağılımı. Temsilcisi kan distSAK sonra 5 hayvan malara. Kırmızı çizgiler beyin besleyen atardamarların boyunca kan dağılımını göstermektedir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,
Şekil 5,. 49 erkek C57BL / 6 farelerde SAK sonrası SAK. Survival eğrisinin sonra sağkalım eğrisi. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SAK sonrası tedavi seçenekleri kısıtlı ve çoğunlukla etkisiz vardır. Bu nedenle post-hemorajik beyin hasarının patofizyolojisi daha yeni tedavi hedefleri belirlemek ve yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için anlaşılması gerekir. Standardize ve genetiği değiştirilmiş hayvanlar, yani farelerde, iyi tekrarlanabilir hayvan modelleri gibi soruşturma için çok önemlidir. Yakından insanlarda patofizyolojiye benzer olarak cwp modeli SAK için yaygın olarak kullanılan bir model haline gelmiştir, ancak farelerde kullanımı, düşük üretkenlik ve yüksek kişilerarası değişkenlik tarafından engellenmektedir. Modelin varyasyonları fizyolojik koşulları değiştirebilir farklı anestezi protokolleri, kaynaklanır. Kanama miktarı nedeniyle damar reaktivite, kan basıncı ve pıhtılaşma farklılıkları 12 hayvan arasında değişmektedir. Böylece işlem boyunca fizyolojik koşullarını izlemek ve va azaltmak cerrahi ve izleme protokolleri kurmak için önemlidirBu modelin riability.

SAK sonrası kan dağıtım türler arasında farklı olabilir. Sıçan modeli kanda eşit iki serebral hemisferde 6 dağılmış gibi görünüyor. Insan beyni bir gyrencephalic mimarisi gösterdiği gibi, kan çoğunlukla beyin sulkuslar boyunca değil öncelikle damarlar boyunca dağıtmak için muhtemeldir. Diğer taraftan, bu sulkuslar çalıştırmak beyin temin arterler yanal sulkusa MCA örn. Böylece damar patolojileri kemirgen hayvan modellerinde ve insan beyninin benzer olabilir.

Laboratuarımızda fentanil, medetomidin ve cerrahi anestezi için yukarıda anlatıldığı gibi midazolam bir arada kullanın. Bu kombinasyon, tansiyon ve damar reaktivite 11 üzerinde nispeten küçük bir etkiye sahiptir. Kontrast, izofluran yılında, SAK araştırmalarında yaygın olarak kullanılan anestezik, hemen arka periferik vazodilatasyon, ciddi bozulmuş serebral otoregulasyon 13, ve düşük kan basıncına neden olurer SAK 12, düzenli insanlarda SAK erken patofizyolojisi ile ilişkili değildir bulgular. Bu nedenle, post-hemorajik patofizyolojiye rahatsız etmeyen bir anestezik protokolünün kullanılması geçerli bir deneysel SAK modeli için önemli bir ön koşuldur.

Kanama miktarı kap lezyon bağlıdır ve filament büyüklüğü 14 ile, bu nedenle değişir. Modelin bir diğer önemli bir adımdır damar delinmesi sonra filamanın kesilmesidir. ICA kan akımı filamanın tarafından bozulur ve gecikmiş bir geri çekilme daha küçük kanamalarda neden olabilir. Bu duruma göre, kap perforasyon ve filament çekilmesi arasındaki süreyi standart için çok önemlidir. Damar perforasyon zaman noktası yüksek temporal hassasiyet ile tespit edilebilir bu elbette mümkündür. Bizim bu kurulum ICP sürekli ölçülmesi ile elde edilir. ICP keskin bir artış başarılı bir damar perforasyonu gösterir ve böylece standardizatio sağlarFilament çekilmesi ve dolayısıyla kanama yoğunluğu n. Buna ek olarak, kontrol ICP-damar delinmesi filament çok böylece beyin dokusu hasarının önlenmesinde ilerletilir önler. Buna göre, sürekli ölçümü ICP murin SAK modelinin değişkenliği en aza indirmek için mükemmel bir tekniktir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Güncel araştırma Solorz-Zak Araştırma Vakfı tarafından finanse edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
operation microscope Leica KL2500
isoflurane vaporizer Harvard Instruments Continuous Flow Vaporizer
respirator Hugo Sachs Minivent 845
microcapnograph Hugo Sachs Type 340
temperature controller FHC DC Temperature Controller
dental drill Paggen Labset- N
ICP monitor Codman ICP monitor
blood pressure monitor AD Instruments Bridge Amp FE221
syringe pump World Precision Instruments SP101IZ
pulsoximeter Kent Scientific MouseSTAT
LDF Perimed Periflux 5000
analog data monitor AD Instruments Power Lab 16/35
Material
cement for ICP probe fixation Speiko Carboxylate cement
glue for LDF probe fixation Bob Smith Industries Cyanoacrylate glue (Maxi Cure and Insta Set)
venous catheter Johnson Johnson Jelco winged i.v. catheter; REF 4076 modified intubation tube
tubing for femoral catheter Smiths Medical Fine Bore Polythene Tubing; ID 0.28 mm OD 0.61 mm; REF 800/100/100 cut to 30 cm length
filament for vessel perforation Ethicon Prolene 5-0 cut to 12 mm length
surgical equipment Fine Scientific Instruments forceps medical #5, vessel scissors 8 cm, microclip 4 mm jaw

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cahill, J., Zhang, J. H. Subarachnoid hemorrhage: is it time for a new direction. Stroke. 40, 86-87 (2009).
  2. van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369, 306-318 (2007).
  3. Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. J. Neurosci. Methods. 123, 89-97 (2003).
  4. Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J. Neurosci. Methods. 183, 136-140 (2009).
  5. Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. J. Neurosci. Methods. 190, 164-170 (2010).
  6. Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
  7. Veelken, J. A., Laing, R. J., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26, 1279-1283 (1995).
  8. Kamii, H., et al. Amelioration of vasospasm after subarachnoid hemorrhage in transgenic mice overexpressing CuZn-superoxide dismutase. Stroke. 30, 867-871 (1999).
  9. Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurol. Res. 24, 510-516 (2002).
  10. Broderick, J. P., Brott, T. G., Duldner, J. E., Tomsick, T., Leach, A. Initial and recurrent bleeding are the major causes of death following subarachnoid hemorrhage. Stroke. 25, 1342-1347 (1994).
  11. Thal, S. C., Plesnila, N. Non-invasive intraoperative monitoring of blood pressure and arterial pCO2 during surgical anesthesia in mice. J. Neurosci. Methods. 159, 261-267 (2007).
  12. Hockel, K., Trabold, R., Scholler, K., Torok, E., Plesnila, N. Impact of anesthesia on pathophysiology and mortality following subarachnoid hemorrhage in rats. Exp. Transl. Stroke Med. 4, 5 (2012).
  13. Wang, Z., Schuler, B., Vogel, O., Arras, M., Vogel, J. What is the optimal anesthetic protocol for measurements of cerebral autoregulation in spontaneously breathing mice? Exp. Brain Res. 207, 249-258 (2010).
  14. Schwartz, A. Y., Masago, A., Sehba, F. A., Bederson, J. B. Experimental models of subarachnoid hemorrhage in the rat: a refinement of the endovascular filament model. J. Neurosci. Methods. 96, 161-167 (2000).
  15. Feiler, S., Plesnila, N., Thal, S. C., Zausinger, S., Scholler, K. Contribution of matrix metalloproteinase-9 to cerebral edema and functional outcome following experimental subarachnoid hemorrhage. Cerebrovasc. Dis. 32, 289-295 (2011).

Comments

1 Comment

  1. Dear Dr.Schüller, I am a researcher focused in the field of neurovascular disease. I am planning to get a standardized murine SAH model for the test of some neural protective reagents. Can you kindly share this video to me. Please consider my request. THX.

    Reply
    Posted by: D K.
    February 23, 2014 - 10:04 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics