Ajuste del tamaño y la reducción al mínimo del ruido de estado sólido Nanoporos

Engineering
 

Summary

Se presenta una metodología para la preparación de nanoporos en estado sólido en solución para los experimentos de translocación biomoleculares. Mediante la aplicación de pulsos cortos de campos eléctricos elevados, el diámetro de nanoporos puede ser controlable ampliada con precisión subnanometer y sus características de ruido eléctrico mejorado significativamente. Este procedimiento se lleva a cabo in situ utilizando el equipo de laboratorio estándar bajo condiciones experimentales.

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Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. Fine-tuning the Size and Minimizing the Noise of Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (80), e51081, doi:10.3791/51081 (2013).

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Abstract

Nanoporos de estado sólido han surgido como una herramienta versátil para la caracterización de biomoléculas individuales tales como ácidos nucleicos y proteínas 1. Sin embargo, la creación de un nanoporos en una membrana aislante delgada sigue siendo un reto. Los métodos de fabricación que implican sistemas especializados de haz electrónico enfocado pueden producir nanoporos bien definidos, pero el rendimiento de nanoporos fiables y bajo nivel de ruido en las membranas disponibles en el mercado sigue siendo baja 2,3 y el control de tamaño es trivial 4,5. En este caso, la aplicación de campos eléctricos elevados para ajustar el tamaño de la nanopore al tiempo que garantiza un rendimiento óptimo de bajo ruido se demuestra. Estos pulsos cortos de alta campo eléctrico se utilizan para producir una señal eléctrica prístina y permitir la ampliación de nanoporos con precisión subnanometer tras la exposición prolongada. Este método se realiza in situ en un medio acuoso utilizando equipos de laboratorio estándar, mejorando el rendimiento y la reproducibilidad de sfabricación nanoporo estado Olid.

Introduction

De estado sólido nanoporos Biológica y proporcionan un medio de detección de analitos biomoleculares en el único nivel de la molécula 1. Nanoporos individuales suelen ser incrustados en las membranas aislantes delgadas, ofreciendo el único conducto para la corriente iónica para pasar entre dos depósitos de líquidos. Utilizando los principios de contadores Coulter a mayor escala, los experimentos de nanoporos relacionan cambios en la corriente iónica para determinar la longitud, tamaño, carga y conformación de biomoléculas cargadas, ya que son impulsados ​​por electroforesis a través de un nanoporos en presencia de un campo eléctrico externo.

Mientras nanoporos biológicos tales como α-hemolisina se caracterizan por ofrecer una mayor sensibilidad y propiedades de bajo ruido 3, la bicapa lipídica de soporte es frágil y de tamaño fijo, lo que limita su aplicabilidad. Nanoporos de estado sólido, por otra parte, se fabrican en delgada (10-50 nm) de nitruro de silicio o de las membranas de óxido de silicio y se pueden hacer de diferentes SIZES, ser integrado fácilmente con tecnologías oblea de escala 6,7, y son más robustos, lo que permite una gama más amplia de condiciones experimentales. A pesar de estas ventajas, las tecnologías de nanoporos de estado sólido sufren de varios inconvenientes prácticos que limitan su utilidad para estudios biomoleculares. Si bien es posible el control del tamaño de nanoporos, que es típicamente caro y laborioso para lograr, que requiere un equipo especializado y personal calificado. Por ejemplo, nanoporos perforados por haz de iones enfocado Recientemente se han demostrado para reducir el tamaño en condiciones experimentales específicas en un microscopio electrónico de barrido (SEM) 5. En otros enfoques, nanoporos perforados por microscopía electrónica de transmisión (TEM) pueden ampliar o reducir en función de las condiciones de haz y la posterior exposición a disolventes acuosos 8. En estos casos, la gama de tamaños de nanoporos alcanzable es limitada, difícil de controlar e incluso poco fiable como el tamaño de la nanoporos puede cambiar después de un tratamiento químico ocuando se sumerge en un medio líquido especial 9.

La corriente iónica a través de nanoporos en estado sólido puede también sufrir de ruido elevado, las fuentes de los cuales son de un tema intensamente investigado en la literatura nanoporo 2,3,10,11. Aunque se han propuesto varios métodos para reducir el ruido eléctrico, el rendimiento de nanoporos, de poco ruido estables fiables es típicamente baja. La deposición de residuos carbonosos durante la perforación y formación de imágenes puede tener efectos perjudiciales sobre la calidad de la señal eléctrica, a menudo haciendo humectación completa un desafío y causando la formación de nanoburbujas que pueden ser difíciles de retirar 12. Por otra parte, la obstrucción de la nanopore por moléculas de analito degrada calidad de representación de la señal poros inutilizable para su posterior experimento 13,14. En conjunto, estos efectos reducen en gran medida el rendimiento de los dispositivos nanopore funcionales y aumentan el costo asociado a la investigación de nanoporos en estado sólido.

La aplicaciónción de una tensión con electrodos de Ag / AgCl para producir altos campos eléctricos en el rango de 0,15-0,3 V / nm presenta una solución sorprendentemente sencilla a estos desafíos. A través de la aplicación cíclica de pulsos cortos de voltaje, un lugar limpio, de bajo ruido de superficie nanoporo ideal para los estudios de una sola molécula que se produce. La exposición prolongada a los altos campos eléctricos inicia la eliminación de material de la membrana que constituye la pared de los poros, lo que resulta en un aumento en el diámetro de nanoporos. Este crecimiento puede ser controlada con precisión mediante la regulación de la intensidad y la duración del pulso. Como trazas de corriente se degradan en el transcurso de un experimento debido a la obstrucción de la nanoporos como moléculas se adsorben a la superficie de nanoporos, este proceso se puede repetir para recuperar dispositivos obstruidos que de otro modo habrían sido descartados. Como tal, el rendimiento de nanoporos funcionales se incrementa aún más por la capacidad de utilizar el mismo dispositivo varias veces. Este método ofrece varias ventajas, ya que se lleva a cabo rápidamente en líquido bajo experimentalescondiciones, sólo requiere equipo de laboratorio estándar, se pueden automatizar con el software, y produce nanoporos de alta calidad funcionales con un rendimiento de más del 95%.

Protocol

1. Fabricación Nanopore y limpieza

Nota: Una vez que existe una nanoporos en una membrana aislante, que puede ser montado directamente en la celda de líquido sin más procesamiento o limpieza, como se describe en el paso 2. Sin embargo, si es necesario para eliminar las trazas de contaminantes entre los experimentos, los chips de nanoporos pueden limpiarse usando solución Piranha 3,15,16 (03:01 H 2 SO 4: H 2 O 2) o por la exposición a plasma de oxígeno 2. Como tal, los pasos 1.2 a 1.9 en el siguiente protocolo son opcionales si la limpieza previa por la exposición a la solución Piranha no es necesario.

  1. Degas filtrada desionizada (DI), colocando al vacío en un baño de ultrasonidos durante 30 min a 40 ° C.
  2. Preparar la solución de pirañas en un vaso de 10 ml añadiendo cuidadosamente 3 ml de ácido sulfúrico seguido de 1 ml de peróxido de hidrógeno. Mezclar bien por calentamiento a reflujo en la pipeta. PRECAUCIÓN: solución Piranha es extremadamente peligroso. Por favor, ta ke todas las precauciones.
  3. Con ayuda de pinzas de ácido-resistentes, insertar cuidadosamente el chip de membrana que contiene nanoporos-borde-primero en la solución Piranha para sumergir completamente el chip y evitar que flote en la superficie.
  4. Enjuagar las pinzas a fondo en agua filtrada.
  5. Colocar el vaso en un preset de la placa caliente a 90 ° C y deje que se limpia durante al menos 30 min.
  6. Retire con cuidado la solución de pirañas del vaso de precipitados con una pipeta de vidrio limpio y deseche en cantidades abundantes de agua.
  7. Usando una pipeta de vidrio limpio añadir 5 ml de agua desionizada desgasificada del paso 1.1 en el vaso de precipitados para enjuagar. Retire el agua y repetir al menos 5 veces.
  8. Retire con cuidado el chip nanopore del vaso de precipitados con unas pinzas con puntas cortantes limpios. Manipular con extremo cuidado ya que la membrana nanopore es muy frágil.
  9. Secar el chip mediante la aplicación de succión suavemente a su borde utilizando un aspirador. Guarde el chip en un plato de Petri limpia hasta que esté listo para su uso.
ve_title "> 2. Montaje del Nanopore

  1. Limpiar el nanoporo de células de Teflón (Figura 1) mediante la colocación en una solución de ácido nítrico 20% e hirviendo durante 10 minutos. PRECAUCIÓN: Utilice todo el equipo de protección personal necesario y manejar ácidos con cuidado.
  2. Retire con cuidado la célula de ácido nítrico y colocar en agua desionizada hirviendo durante 10 min.
  3. Hervir la célula en agua DI para un adicional de 10 min para asegurar la eliminación completa del ácido nítrico. Retire el vaso de precipitado de la placa caliente y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
  4. Sacar la cubeta del vaso de precipitados y secar con aire filtrado o N2. Guarde el celular en una placa de Petri limpia.
  5. Degas filtró solución de KCl (tamponada con HEPES a pH 8) por la puesta bajo vacío en un baño de ultrasonidos durante 30 min a 40 ° C.
  6. Limpie las dos juntas de elastómero de silicona para cada chip nanopore sonicando en etanol durante al menos 10 min.
  7. Coloque el chip nanopore sobre una junta de elastómero ser carefu limpial para alinear la ventana de membrana con la abertura de la junta. Coloque y alinee una segunda junta de la cima de la viruta.
  8. Coloque el chip y las juntas en la entrada del depósito de la mitad de la célula de nanoporos limpiado. Montar la célula atornillando la otra mitad en su lugar. Una vista en despiece ordenado de los componentes de la célula de nanoporos se muestra en la Figura 1.
  9. Moje el chip nanopore pipeteando etanol en los reservorios de células y la colocación en una cámara de vacío hasta que algunas burbujas se ven para salir de las entradas.
  10. Eliminar el etanol por lavado de los depósitos con al menos 3 ml de solución de KCl desgasificados filtrada. Tenga cuidado de eliminar desbordamiento utilizando un aspirador.

3. Nanopore Caracterización

  1. Coloque la celda nanopore en el montaje experimental eléctricamente blindado y colocar electrodos Ag / AgCl en cada depósito. Esta configuración es similar a la mostrada en la Figura 2 con la excepción de la fuente de alimentación externa y amplificador de corriente que sonsustituido con un amplificador de realimentación resistiva de bajo ruido.
  2. Utilizando el amplificador de bajo ruido en el modo de fijación de voltaje, se aplican los potenciales que barren desde -200 mV a 200 mV y registrar las características IV.
  3. Montar la curva IV para obtener la conductancia de nanoporos, que se puede utilizar para calcular su diámetro en solución 17. Si el diámetro calculado es mucho menor de lo esperado a partir de imágenes TEM, el poro es probable que no completamente humedecida y / o tiene residuos o contaminación.
  4. Aplique una potencial mV 200 a través de la nanopore y registrar la corriente iónica durante 30 segundos.
  5. Realizar un análisis de densidad espectral de potencia (PSD) de la corriente iónica e integrar para cuantificar las características de ruido eléctrico de la nanoporos. Si el ruido está por encima de 15 pA RMS a 5 kHz de ancho de banda, entonces es probable que el poro no completamente humedecida y / o contiene la contaminación y no se puede utilizar de forma fiable en el experimento.

4. Acondicionado Nanoporos Uso de Alta Energía Fields

Nota: Si la curva IV genera asimetría exhibieron o menos de lo esperado de la conductancia, o la traza actual mostró niveles de inestabilidad y de alto ruido a bajas frecuencias, es necesario acondicionar el nanopore con altos campos eléctricos para eliminar cualquier contaminación en el poro superficie y / o humedecer el poro. Aunque este método no afecta el ruido de alta frecuencia causada por la capacitancia de la membrana o de cualquier capacitancia parásita acoplada a la entrada del amplificador de corriente utilizado en las mediciones, el ruido de baja frecuencia (también llamado ruido 1 / f) 18 se puede reducir en gran medida. Un diagrama esquemático de la configuración utilizada para llevar a cabo este acondicionamiento se muestra en la Figura 2.

  1. Desconectar los electrodos desde el amplificador de patch-clamp.
  2. Conectar uno de los electrodos a una fuente de alimentación controlada por ordenador capaz de generar> 6 V (> 0,2 V / nm intensidad de campo eléctrico de las membranas de espesor 30 nm utilizadas aquí) y el otro a un correoXternal amplificador de corriente que se puede supervisar en tiempo real.

    Nota: La aplicación de campos eléctricos elevados se puede utilizar para condicionar nanoporos en diversos materiales y espesores de membrana. Mientras que ambas membranas 30 nm y 10 nm se discuten aquí, los voltajes descrito se refieren a los utilizados para las membranas de espesor 30 nm a menos que se indique lo contrario.

  3. Aplique una diferencia de potencial de 400 mV (tensión de medición) a través de la nanopore durante al menos 5 segundos.
  4. Calcular el valor de la corriente media de la final de 1 seg de datos para determinar la conductancia de la nanoporos. Calcular el diámetro de la nanoporos basado en esta conductancia, que debe ser realizado automáticamente utilizando el software y el modelo de la conductancia de nanoporos de elección basado en la geometría más probable. Se debe corresponder al diámetro medido a partir de la curva IV.
  5. Aplicar un pulso de 200 mseg de 6 V (tensión de humectación) a través de la nanoporos para producir un campo eléctrico de 0,2 V / nm seguido de un periodo de medición 5 sega 400 mV. Una vez más, calcular un diámetro de la nanoporos usando el final de 1 seg de datos y comparar con el valor esperado a partir de mediciones de TEM para asegurar que el nanoporo es totalmente mojado. Si es necesario, repita varias veces.
  6. Si es necesario, repetir la aplicación de pulsos de alto campo eléctrico al aumentar el voltaje hasta que la señal de corriente durante el periodo de medición es estable y muestra la conductancia se esperaba. No se recomienda exceder de 10 V (es decir,> 0,3 V / nm), ya que esto puede aumentar significativamente o dañar el nanopore rápidamente.

5. Ampliación Nanoporos Uso de los campos eléctricos de alta

Nota: El diámetro de la nanoporos es crucial en la determinación de su funcionalidad para una aplicación de detección biomolecular en particular. Para este fin, un nanoporos creado usando un TEM se puede ampliar a un tamaño deseado mediante la aplicación de campos eléctricos elevados hasta que se logre el diámetro apropiado con la misma configuración utilizada para limpiar y humedecer elnanoporo (Figura 2).

  1. Usando la misma configuración electrónica como en la parte 4, aplicar una polarización de 200-500 mV a través del poro para obtener una medición del diámetro. Aunque menos preciso que el ajuste de una curva IV, un solo punto de medición puede ser utilizado para estimar aproximadamente el tamaño de nanoporos rápidamente.
  2. Aplicar un pulso de 2 seg de 8 V a través de la nanoporos seguido por un período de medición de al menos 5 segundos a 400 mV. Cálculo del nuevo diámetro típicamente mostrará un aumento muy pequeño en tamaño nanoporos (<0,1 nm).
  3. Repita este proceso cíclico, alternando entre la ampliación y la medición de voltajes para obtener in situ y mediciones en tiempo real de diámetro creciente nanopore.
  4. Si la tasa de crecimiento más rápido es deseable aumentar la magnitud de la tensión aplicada gradualmente hasta 10 V. El crecimiento se acelerará a medida que normalmente el poro se agranda con la tasa de aumento de la conductancia que van desde 0,03 ns / s ec & #160; de 10 ns / seg, dependiendo del tamaño de la nanoporos, la fuerza del campo eléctrico y propiedades de la solución de electrolitos.
  5. Cuando se alcanza el diámetro deseado, detener la aplicación de campos eléctricos elevados. Esto se puede hacer automáticamente mediante el programa de ordenador.
  6. Vuelva a conectar el amplificador de patch-clamp a los electrodos.
  7. Adquirir nuevo IV y datos de rastreo actuales a 200 mV para confirmar el diámetro de la nanopore y verificar las señales de corriente de bajo ruido que en los pasos 3.2 a 3.5 supra. Si es necesario, repita acondicionado y protocolo de ampliación (pasos 4.1 a 5.5).

6. La translocación de ADN

  1. Antes de la adición de una muestra biomolecular, lleve a cabo un experimento de control para asegurar que no hay contaminación en el depósito. Adquirir una traza actual bajo un potencial aplicado de 150 a 300 mV en ausencia de cualquier muestra para verificar que no hay bloqueos actuales se detectan después de 2 min.
  2. Añadir el ADN λ (48,5 kpb de doble cadena) a la <em> depósito cis para una concentración final de 0,5-2 ng / l. Se calienta a reflujo suavemente con una pipeta durante al menos 10 segundos para asegurar una distribución homogénea de la muestra en todo el depósito.
  3. Para una nanoporo de espesor 30 nm, aplicar una polarización de potencial de 150 a 300 mV al depósito trans y medir la corriente iónica que pasa a través de la nanoporos. Para eventos de translocación muy cortos, es deseable muestrear a una alta frecuencia (250 kHz o mayor) con una frecuencia relativamente alta de filtrado de paso bajo (100 kHz).
  4. Supervise la corriente iónica usando software para detectar bloqueos de corriente transitoria como moléculas translocan a través de la nanopore. Las trazas de corriente iónica de la translocación molecular pueden ser analizados para determinar la profundidad bloqueo, la duración y la frecuencia para inferir información sobre la muestra de interés. A la inversa, si la información sobre las moléculas de translocación es conocido, estos datos se puede utilizar para investigar las propiedades de la propia nanoporos.

Representative Results

Los nanoporos utilizados en este estudio fueron perforados en 30 nm o 10 nm ventanas de membrana de nitruro de silicio de espesor. Si bien el protocolo descrito se puede aplicar a nanoporos de estado sólido de diversos materiales fabricados usando cualquier método, comúnmente se les perforados por TEM usando protocolos establecidos previamente 11,14. Nanoporos perforados por TEM son típicamente entre 4-8 nm de diámetro (Figura 2). Mientras que ambas membranas gruesas 30 nm y 10 nm pueden ser montados y se acondicionó usando el protocolo anterior, sesgos de tensión descritos se refieren los requeridos para las membranas de espesor 30 nm a menos que se indique lo contrario. Para las membranas de diferente tamaño, la tensión aplicada debe ajustarse para generar un campo eléctrico en el intervalo de 0,15-0,3 V / nm dentro de la nanoporos.

La figura 3a muestra dos trazas de conductancia típicas de un nanoporos 10-nm en una membrana de espesor de 30 nm antes y después del tratamiento con campos eléctricos elevados. Tras el montaje de un recién dnanoporos con surcos, la probabilidad de obtener una señal de corriente iónica inestable y ruidosa, mostrar un elevado grado de fluctuación de baja frecuencia, es generalmente alta. El nanopore se muestra en la Figura 3a destaca este comportamiento. Su conductancia es considerablemente menos de lo esperado para un nanoporo de su tamaño, muy probablemente debido a la humectación incompleta. Tras la aplicación de campos eléctricos elevados de 0,27 V / nm en magnitud producida por 8 V pulsos (90 pulsos de 2 segundos de duración), la nanoporos se convierte totalmente mojado y, posteriormente, se amplía a 21 nm de diámetro. En este punto, el poro exhibe una conductancia estable con propiedades de bajo ruido. El análisis cuantitativo de ruido en nanoporos similares se muestra como gráficos de densidad espectral de potencia de la Figura 3b. El ruido de amplitud de baja frecuencia de los poros unwet y / u obstruidas es muy alta (> 20 pA RMS), inutilización en el experimento. Al acondicionado con altos campos eléctricos, de potencia de ruido a bajas frecuencias (<10 kHz) es diminisHed por hasta 3 órdenes de magnitud y listo para los experimentos de bajo ruido.

La figura 4a muestra una medición de corriente típico como el potencial aplicado es pulsada entre los altos campos eléctricos para la ampliación de los períodos de baja y de medición de campo eléctrico. Después de cada impulso siguiente, la corriente iónica resultante a través de la nanopore a la tensión de medición (es decir, la conductancia nanoporo) aumenta en una cantidad finita. Esto demuestra que el nanoporo se aumenta de tamaño, como el diámetro d se puede deducir de su conductancia G en una solución de σ la conductividad, la aproximación de la nanoporos como tener geometría cilíndrica de longitud efectiva L ef. Si bien existen varios otros modelos de relación conductancia nanoporo a su geometría 17,19-21, la siguiente relación, que incorpora un término geométrico y un término de la resistencia de acceso, se ha demostrado una validez de nanoporos perforados-TEM en altas concentraciones de salconcentraciones, más de una amplia gama de diámetros de interés para ADN de doble cadena translocación 17,22.

Una vez que se alcanza el diámetro deseado, el proceso se detiene automáticamente por el software. El diámetro de nanoporos resultante puede ser confirmada usando mediciones precisas IV, como se muestra en la Figura 4b.

Es importante señalar que nanoporos tratados usando campos eléctricos elevados son completamente funcionales. Esto es validado por la detección de la translocación de ADN λ, como se muestra en las huellas de conductancia presentados en la Figura 5a. En esta figura, ADN de doble cadena es impulsada a través de dos nanoporos que fueron ampliadas a 11 nm y 32 nm utilizando el método descrito. En cada caso, la conductancia de la línea de base es muy estable y no se observan bloqueos claros como moléculas de ADN de doble cadena translocan a través de la nanopore, demostrando el gran señal-Ruido eventos de translocación de una sola molécula en comparación con los poros no tratados que presentan altos niveles de ruido. Como se muestra en las inserciones de la figura 5a, se observan múltiples niveles discretos de bloqueo como moléculas individuales plegadas translocan, como se esperaba para nanoporos de estos tamaños. Los histogramas de la conductancia de nanoporos durante los eventos de translocación a través de cada poro se muestran en la Figura 5b. Las propiedades de bajo nivel de ruido de los nanoporos revelan distintos picos, fácilmente resolubles correspondientes a la línea de base (sin ADN), solo (una cadena de ADN - desplegada) y los estados de bloqueo doble (dos cadenas de ADN - doblado). Es de destacar el hecho de que el cambio en la conductancia correspondiente a una única molécula de ADN de doble cadena que ocupa el poro es diferente para las grandes y pequeñas nanoporos. Esto proporciona evidencia indirecta de que la aplicación de campos eléctricos elevados es, de hecho, la ampliación de nanoporos existentes, como se observó la misma amplitud bloqueo si se creaban otros poros o grietas en tél de la membrana durante el proceso 17.

Del mismo modo, la Figura 6 ilustra la eficacia de campos eléctricos elevados para la ampliación de nanoporos fabricadas en las membranas de diferente grosor. Aquí, un nanoporos creado en una membrana SiNx 10-nm es inicialmente parcialmente unwet, que muestra la conductancia inestable y relativamente pequeña. Tras la aplicación de la alternancia ± 3 V (± 0,3 V / nm) pulsos de 4 segundos de duración (30 en total), el nanopore se moja y presenta características ideales IV para un poro de 3 nm. A continuación, la metodología se repitió para 400 pulsos sucesivos y la nanopore se amplió a 8 nm. Esta ampliación, realizado en campos eléctricos comparables pero de polarización de tensión inferior aplicada que para nanoporos fabricados en membranas de 30 nm, muestra que el proceso es principalmente el campo eléctrico impulsado. Como el bloqueo corriente producida por la translocación a través de una membrana más delgada es más grande que el producido en más gruesos poros, nanoporos en membranas delgadastratada de esta manera se puede utilizar para estudiar moléculas más cortas, tales como proteínas con mayor sensibilidad.

Figura 1
Figura 1. Conjunto de célula Nanopore. Una membrana de nitruro de silicio que contiene un nanopore se coloca entre las juntas de elastómero de silicona, que son a su vez comprimido por dos medias células de teflón que contienen depósitos de electrolito. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 2
Figura 2. Nanopore acondicionado y ampliación de la instalación. A nanoporo perforado en una membrana de nitruro de silicio de 30 nm de espesor (izquierda) conecta dos depósitos de electrolito. Laordenador se utiliza para controlar ya sea un amplificador de patch-clamp o fuente de alimentación externa (tarjeta DAQ) que se aplica un sesgo potencial a través de la nanoporos a través de electrodos de Ag / AgCl sumergidos en los depósitos de electrolito. El amplificador de corriente transmite la corriente iónica medida para monitorizar en tiempo real el uso de los programas informáticos. Esta cifra se ha modificado a partir de [11]. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 3
Figura 3. Trazas actuales antes y después de la aplicación de campos eléctricos elevados. (A) Al montar, e incluso después de la limpieza con una solución de pirañas, la conductancia de la nanopore es inestable y menos de lo esperado para un poro cilíndrico 10-nm (azul). Después de la aplicación de pulsos de 2 seg de 8 V, elnanoporos está completamente humedecida y ampliada, que presenta una conductancia estable y se puede utilizar para los experimentos de detección biomoleculares (verde). (B) las parcelas de densidad espectral de potencia de un nanopore incompletamente humedecida y se obstruyen (azul y naranja, respectivamente). Tras la aplicación de pulsos de 200 ms de 8 V, los nanoporos se humedecieron y escombros removidos (verde y rojo, respectivamente). Esta cifra se ha modificado a partir de [11]. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 4
Figura 4. Nanopore ampliar usando campos eléctricos elevados. (A) alterna entre la ampliación y la medición de los sesgos potenciales (rojo) revela que la corriente iónica a través de la nanopore (azul) se incrementa en pasos finitos. La conducta que haya ocasionadomedición ción se puede usar para inferir diámetro de nanoporos. Una vez que el diámetro deseado ha sido alcanzado, se detiene el proceso. (B) Las mediciones precisas IV de la conductancia confirman que los tamaños de nanoporos se han incrementado. Dichas parcelas proporcionan una mejor estimación del tamaño de los poros de los valores actuales de un solo punto, ya que pueden estar en forma y su comportamiento simétrico y óhmico puede ser confirmada. Esta cifra se ha modificado a partir de [11]. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

La figura 5
Figura 5. Translocación del ADN a través de nanoporos condicionadas. (A) La adición de ADN de doble cadena (48,5 kpb) a un lado de la nanopore a un sesgo de 150 mV produce bloqueos transitorios en los rastros de conductancia de 11-nm (azul) y porción de 32 nmes (rojos). (B) Histogramas de la conductancia de cada uno de los nanoporos muestran picos discretos correspondientes a la línea de base, individuales y dobles eventos de translocación. Esta cifra se ha modificado a partir de [11]. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

La figura 6
Figura 6. Ampliación de nanoporos en 10 membranas nm. A nanopore en una membrana de 10 nm originalmente exhibe muy poca conductancia y características asimétricas IV (naranja). Después de la aplicación de pulsos de 30 alterna entre ± 3 V (4 segundos de duración), los moja nanoporos y exhibe propiedades ideales IV con una conductancia consistente con la esperada para un poro de 3 nm (azul). A otros 400 pulsos de ± 3 V agranda la nanopore a un diámetro de 8 nm(Verde). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Discussion

Control del tamaño de nanopore es de fundamental importancia en aplicaciones de detección biomolecular. Diámetros Nanopore deben estar en el orden del tamaño de las moléculas se realiza la palpación, sino que debe ser lo suficientemente grande para dar cabida a la muestra, pero lo suficientemente pequeño para lograr ruido de la señal-a-óptima. Si bien el control de tamaño utilizando el método presentado en aplicar campos eléctricos elevados es unidireccional en que los diámetros nanopore sólo se incrementan en todo el proceso, nanoporos con diámetros comprendidos entre 3-100 nm pueden ser de moda, con una precisión subnanometer. Como 3-4 poros nm se pueden fabricar fácilmente utilizando un TEM 23, esto permite la fabricación fiable de nanoporos de estado sólido para una amplia gama de aplicaciones de sondeo estructura de ssDNA a la interacción de los complejos proteína-ligando voluminosos. Si bien el crecimiento de nanoporos por encima de 100 nm puede ser muy rápido y menos precisa, las condiciones de ampliación de más moderadas se pueden emplear para lograr un mejor control sobre el proceso. Como sUCH, el paso más importante para lograr el control del tamaño efectivo es la elección de la fuerza del pulso y la duración con el fin de equilibrar la eficiencia ampliación y el nivel de precisión requerido en la consecución de un diámetro de poro deseado. Esto se refuerza aún más con la ampliación de nanoporos más delgadas (espesor de 10 nm), donde se observa la ampliación un sesgo más bajo, pero la intensidad de campo eléctrico comparable. Dependiendo del tamaño final, generalmente es posible ampliar una nanoporos para diámetros de sub-100-nm en unos pocos minutos.

Del mismo modo, grandes fluctuaciones de baja frecuencia actuales se oponen a los estudios de una sola molécula, ya que es casi imposible de diferenciar señales de translocación del ruido de fondo. Incompleto de humectación 24, la presencia de residuos carbonosos restantes después de la fabricación inicial 25 y la adsorción de los desechos en la pared de nanoporos 13 puede degradar la calidad de la señal, lo que requiere una limpieza adicional con los tratamientos químicos duros que son a menudo inefficacious. Curiosamente, es común que los protocolos de nanoporos en estado sólido para enfatizar la importancia de la limpieza de la nanopore en solución de pirañas o con plasma de oxígeno antes de montar para ayudar humectante o eliminar cualquier contaminación sobrante de los procesos de perforación, tratamiento de imágenes y la manipulación. Incluso con este tratamiento, sin embargo, nanoporos menudo no lo hacen mojado o siguen mostrando altos niveles de ruido, y la solución sugerida por los intentos fallidos es realizar una limpieza adicional que puede llevar mucho tiempo 14. Con la aplicación de campos eléctricos elevados, estos largos protocolos pueden no ser necesario dependiendo de la aplicación. Se encontró que la mayoría de los dispositivos podrían ser reacondicionados in situ usando el método descrito en el presente documento, por consiguiente, reducir el tiempo de preparación y la necesidad de tratar con productos químicos agresivos. Los pasos más importantes en la mitigación del ruido eléctrico es un simple aumento de la tensión y / o la duración del impulso para mojar completamente el poro y quitar restos poco atado-.Nanoporos tratados de esta manera de forma fiable se pueden utilizar en experimentos de translocación de biomoléculas, tales como el paso del ADN y las proteínas. Si estas moléculas se adhieren a la pared de los poros dando lugar a una señal eléctrica obstruido y ruidoso, pulsos de alto campo eléctrico puede ser de nuevo para eliminar la obstrucción y recuperar propiedades de bajo ruido para una mayor experimentación, sin necesidad de desmontar el chip nanopore de la celda de fluidos.

La aplicación de campos eléctricos elevados utilizando la configuración descrita está limitada por el requisito de una fuente de alimentación externa que puede aplicar hasta 10 V y amplificador de corriente, que carecen de la sensibilidad y propiedades de bajo ruido en el ancho de banda alto (> 1 kHz) para detección de moléculas individuales. Mientras que los experimentos típicos biomoleculares se basan en un amplificador de corriente de bajo ruido que se limita a ± 1 V, es sencillo de diseñar un sistema único que podría lograr tanto de alto campo eléctrico acondicionado y medición de la corriente sensible con un adyuganancia estable. A pesar de esta limitación, la transición de una configuración a la otra es rápido y sencillo. En comparación con las técnicas existentes para controlar el tamaño de nanoporos, tales como el uso de SEM 5, oxidación térmica y la remodelación de la membrana 8, los altos campos eléctricos ofrecen una metodología más rápido, más preciso y menos costoso que puede realizarse en el banco de laboratorio utilizando equipo estándar y proporcionar una gama más amplia de tamaños nanopore. La capacidad para reducir rápida y reproducible de ruido de baja frecuencia también hace que la fabricación inicial más fiable y prolonga la vida útil de nanoporos de estado sólido, como los poros utilizados anteriormente pueden ser rejuvenecidas para experimentos adicionales. En total, más del 95% de los nanoporos de espesores variables condicionadas con altos campos eléctricos exhibió muy poco característico ruido de baja frecuencia, lo que hace que sean adecuadas para la detección de biomoléculas. La fabricación es más sencillo y más fiable, por lo que los experimentos de nanoporos en estado sólido más accesibilidadble a los investigadores y potencialmente permitiendo un camino hacia la comercialización de las tecnologías a través de nanoporos procesos de fabricación más robustos.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Reconocemos el apoyo de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá, la Fundación Canadiense para la Innovación y el Fondo de Investigación de Ontario. Agradecemos Y. Liu para la ayuda en la fabricación y caracterización de nanoporos, L. Andrzejewski valiosa para los debates y el apoyo técnico, y A. Marziali ayuda con el software nanopore y diseño de instrumentación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEM-2100F TEM JEOL Drilling requires 200 kV accelerating voltage
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier Molecular Devices Low-noise voltage and current amplifier
X-Series data acquisition card National Instruments PCI-6351 Interfacing with setup, apply of high electric fields
LabVIEW 2012 software National Instruments Apply voltages, record current, data analysis
Current amplifier Keithley Current amplification during high electric field pulses
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows Norcada Inc. NT005X Substrate in which nanopores are created
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows Norcada Inc. NT005Z Substrate in which nanopores are created
Silicone elastomer O-rings Marian Chicago HT6135 Punched for sealing the nanopore chip
Ag/AgCl electrodes In Vivo Metric E255
Nitric acid Fisher Scientific 52004P Used for cleaning cells - handle with caution
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H323 Used for piranha solution - handle with caution
Sulfuric acid Fisher Scientific A300 Used for piranha solution - handle with caution
Potassium chloride Fisher Scientific P335
HEPES Fisher Scientific BP310 Buffering KCl solution
Primary Faraday cage Shielding nanopore cell, electrodes
Secondary Faraday cage Shielding headstage, electrode wires
Teflon cell To hold nanopore chip and reservoirs
Hot plate VWR Heating piranha solution

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References

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