Feinabstimmung der Größe und Minimierung der Lärm von Solid-State-Nanoporen

Engineering
 

Summary

Eine Methodik zur Herstellung von Festkörper-Nanoporen in Lösung für biomolekulare Translokation Experimente vorgestellt. Durch Anlegen kurzer Impulse hoher elektrischer Felder kann die Nanoporendurchmesser steuerbar mit Sub-Nanometergenauigkeit vergrößert und seine elektrischen Rauscheigenschaften deutlich verbessert. Dieses Verfahren wird in situ unter Verwendung von Standard-Laborausrüstung unter experimentellen Bedingungen durchgeführt.

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Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. Fine-tuning the Size and Minimizing the Noise of Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (80), e51081, doi:10.3791/51081 (2013).

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Abstract

Solid-State-Nanoporen wurden als vielseitiges Werkzeug für die Charakterisierung von einzelnen Biomolekülen, wie Nukleinsäuren und Proteine ​​1 entstanden. Allerdings bleibt die Schaffung eines Nanoporen in eine dünne isolierende Membran herausfordernd. Herstellungsverfahren mit Fach fokussierten Elektronenstrahl-Systeme können gut definierte Nanoporen zu produzieren, aber Ausbeute von zuverlässigen und geräuscharmen Nanoporen in kommerziell erhältlichen Membranen bleibt niedrig 2,3 und Größenkontrolle nicht trivial ist 4,5. Hier ist die Anwendung von hohen elektrischen Feldern, um die Feinabstimmung der Größe der Nanoporen, während eine optimale Geräuscharmut demonstriert. Diese kurzen Impulse des hohen elektrischen Feld werden verwendet, um eine unberührte elektrisches Signal zu erzeugen und damit zur Vergrößerung von Nanoporen mit Sub-Nanometer Genauigkeit bei längerer Exposition. Dieses Verfahren wird in situ in einer wässrigen Umgebung unter Verwendung von Standardlaborausrüstung durchgeführt wird, die Verbesserung der Ausbeute und der Reproduzierbarkeit solid-Zustand nanopore Fertigung.

Introduction

Biologische und Festkörper-Nanoporen ein Mittel zur Erfassung biomolekulare Analyten auf der Einzelmolekülebene ein. Einzelne Nanoporen sind in der Regel in dünne isolierende Membranen eingebettet und bietet den einzigen Kanal für Ionenstrom zwischen zwei Flüssigkeitsreservoirs geben. Unter Verwendung der Prinzipien der größeren Coulter-Zähler, nanopore Experimente betreffen Änderungen im Ionenstrom, um die Länge, Größe, Ladung und Konformation von geladenen Biomolekülen zu bestimmen, wie sie elektrophoretisch durch eine Nanoporen in der Gegenwart von einem äußeren elektrischen Feld angetrieben.

Während biologische Nanoporen wie α-Hämolysin bieten in der Regel eine höhere Empfindlichkeit und niedrigem Rauscheigenschaften 3 ist die Unterstützung von Lipid-Doppelschicht zerbrechlich und eine feste Größe, was ihre Anwendbarkeit. Festkörper-Nanoporen, auf der anderen Seite, sind in dünnen (10-50 nm), Siliziumnitrid oder Siliziumoxid-Membranen hergestellt und kann von verschiedenen siz werdenes, leicht mit Wafer-Scale-Technologien 6,7 integriert und sind robuster, so dass für ein breiteres Spektrum von experimentellen Bedingungen. Trotz dieser Vorteile leiden Festkörper-Nanoporen-Technologien aus mehreren praktischen Nachteile, die ihre Nützlichkeit für molekularbiologische Untersuchungen zu begrenzen. Während die Steuerung des Nanoporengröße möglich ist, ist es in der Regel teuer und mühsam zu erreichen, spezialisierte Ausrüstung und qualifiziertem Personal erfordern. Beispielsweise wurden Nanoporen durch fokussierten Ionenstrahl gebohrt kürzlich gezeigt worden, dass unter bestimmten experimentellen Bedingungen in einem Rasterelektronenmikroskop (SEM) 5 schrumpfen. In anderen Ansätzen kann Nanoporen durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) gebohrt vergrößern oder verkleinern, je nach Strahlbedingungen und anschließende Einwirkung von wässrigen Lösungsmitteln 8. In diesen Fällen ist die erzielbare Reichweite von Nanoporengrößen begrenzt, schwer zu kontrollieren und auch unzuverlässig, da die Größe der Nanoporen können folgende chemische Behandlung ändern oderwenn in einem bestimmten flüssigen Umgebung 9 eingetaucht.

Der Ionenstrom durch Festkörper-Nanoporen können auch von hohen Lärm leiden, deren Quellen sind ein intensiv untersuchten Thema in Nanoporen-Literatur 2,3,10,11. Obwohl verschiedene Verfahren vorgeschlagen worden, um elektrisches Rauschen zu reduzieren, die Ausbeute zuverlässige, stabile rauscharme Nanoporen in der Regel gering. Die Abscheidung von kohlenstoffhaltige Rückstände beim Bohren und Bildgebung kann nachteilige Auswirkungen auf die elektrische Signalqualität haben, machen oft eine vollständige Benetzung eine Herausforderung und was die Bildung von Nanobläschen, die schwer zu entfernen 12 sein kann. Außerdem Verstopfung der Nanoporen durch Analyt-Moleküle abbaut Signalqualität Rendering Poren unbrauchbar weiteren Versuch 13,14. Insgesamt diese Effekte stark Ausbeute von funktionellen Nanoporen-Geräte zu reduzieren und die Kosten, die mit Festkörper-Nanoporen-Forschung verbunden.

Die Anwendungtion einer Spannung mit Ag / AgCl-Elektroden zu hohe elektrische Felder im Bereich von 0,15 bis 0,3 V / nm erzeugen präsentiert eine überraschend einfache Lösung für diese Herausforderungen. Durch die zyklische Anwendung von kurzen Spannungsimpulse, eine saubere, geräuscharme Nanoporen-Oberfläche ideal für Einzelmolekülstudien erzeugt. Längerer Einwirkung von hohen elektrischen Feldern zur Beseitigung von Membranmaterial der Porenwand bildet, was zu einer Erhöhung der Nanoporendurchmesser. Dieses Wachstum kann genau durch Abstimmen der Impulsstärke und Dauer gesteuert werden. Umlaufbahnen verschlechtern sich im Laufe eines Versuchs durch Verstopfung der Nanopore als Moleküle adsorbieren Fläche der Nanopore kann dieser Vorgang wiederholt werden, um verstopfte Geräte, die ansonsten verworfen worden wäre erholen. Als solches ist die Ausbeute an funktionsNanoPoren durch die Fähigkeit, die gleiche Vorrichtung mehrere Male verwenden erhöht. Dieses Verfahren bietet mehrere Vorteile, da sie sich schnell in Flüssigkeit unter experimentellen durchgeführtBedingungen, erfordert nur Standard-Laborgeräte, können mit der Software automatisiert werden, und produziert Funktions hochwertigen Nanoporen mit einer Ausbeute von über 95%.

Protocol

1. Nanopore Herstellung und Reinigung

Anmerkung: Wenn eine Nanopore in einer isolierenden Membran vorhanden ist, kann es direkt in der Flüssigzelle ohne weitere Aufarbeitung oder Reinigung montiert werden, wie in Schritt 2 beschrieben. Oder durch die Einwirkung von Sauerstoff-Plasma 2: Wenn es jedoch notwendig ist, um Spuren von Verunreinigungen zwischen den Experimenten zu entfernen, Nanopore Chips können entweder 3,15,16 Piranha-Lösung (H 2 O 2 3.01 H 2 SO 4) gereinigt werden. Als solche werden die Schritte 1,2 bis 1,9 in dem folgenden Protokoll sind optional, wenn eine Vorreinigung durch Belichtung mit Piranha-Lösung ist nicht notwendig.

  1. Entgasen filtriert deionisiertem (DI) Wasser, indem unter Vakuum in ein Ultraschallbad für 30 min bei 40 ° C.
  2. Vorbereitung Piranha-Lösung in einem 10 ml-Becherglas durch vorsichtige Zugabe von 3 ml Schwefelsäure, gefolgt von 1 ml Wasserstoffperoxid. Mischen Sie gründlich unter Rückfluß in der Pipette. ACHTUNG: Piranha-Lösung ist extrem gefährlich. Bitte ta ke alle Vorkehrungen.
  3. Mit säurebeständige Pinzette vorsichtig Kanten zuerst in die Piranha-Lösung legen Sie die Nanoporen-haltigen Membranchip vollständig versenken den Chip und vermeiden Sie es auf der Oberfläche schwimmen.
  4. Pinzette gründlich spülen in gefiltertes Wasser.
  5. Becherglas auf einer Heizplatte voreingestellt auf 90 ° C und lassen Sie es für mindestens 30 Minuten zu reinigen.
  6. Die Piranha-Lösung vorsichtig aus dem Becherglas mit einem sauberen Glaspipette und entsorgen in reichlich Wasser.
  7. Mit einem sauberen Glaspipette 5 ml des entgasten entsalztem Wasser aus Schritt 1.1 in den Becher zu spülen. Entfernen Sie den Wasser und wiederholen Sie mindestens 5x.
  8. Die Nanopore Chip vorsichtig aus dem Becherglas mit sauberen scharfen Spitze Pinzette. Mit äußerster Sorgfalt wie die Nanoporenmembran ist sehr zerbrechlich.
  9. Trocknen Sie den Chip vorsichtig eine Saugwirkung zu deren Rand unter Verwendung eines Gebläses. Lagern Sie den Chip in einem sauberen Petrischale bis zur Verwendung.
ve_title "> 2. Montage der Nanopore

  1. Reinigen des Teflon Nanopore Zelle (Fig. 1), indem sie in 20%-iger Salpetersäure-Lösung und Kochen für 10 Minuten. VORSICHT: Verwenden Sie alle notwendigen persönlichen Schutzausrüstung und Griff Säuren mit Sorgfalt.
  2. Die Zelle vorsichtig aus Salpetersäure und in koch DI-Wasser für 10 min.
  3. Man kocht die Zelle in DI-Wasser für weitere 10 Minuten, um eine vollständige Entfernung der Salpetersäure zu gewährleisten. Das Becherglas von der Heizplatte und lassen es auf Raumtemperatur abkühlen.
  4. Entfernen Sie die Zelle aus dem Becher und trocken blasen mit gefilterter Luft oder N 2. Bewahren Sie die Zelle in einer sauberen Petrischale.
  5. Entgasen filtriert KCl-Lösung (mit HEPES bei pH 8 gepuffert), indem unter Vakuum in ein Ultraschallbad für 30 min bei 40 ° C.
  6. Rein zwei Silikonelastomer-Dichtungen für jede Nanopore Chip im Ultraschallbad in Ethanol für mindestens 10 min.
  7. Legen Sie die Nanopore Chip auf einem sauberen Elastomerdichtung Befinden careful die Membranfenster mit der Dichtungsöffnung auszurichten. Zeigen und richten Sie eine zweite Dichtung oben auf dem Chip.
  8. Platzieren des Chips und die Dichtungen auf der Behälter-Einlaß von einer Hälfte der Zelle gereinigt Nanopore. Montieren Sie die Zelle durch Einschrauben die andere Hälfte an Ort und Stelle. Eine Explosionsansicht der Nanopore Zellkomponenten ist in Fig. 1 gezeigt.
  9. Befeuchten Sie die Nanoporen-Chip durch Pipettieren von Ethanol in der Zellreservoirs und Platzierung in einer Vakuumkammer, bis ein paar Blasen gesehen werden, um die Eingänge zu verlassen.
  10. Entfernen von Ethanol durch Spülen der Vorratsbehälter mit mindestens 3 ml KCl-Lösung filtriert, entgast. Achten Sie darauf, um den Überlauf unter Verwendung eines Gebläses entfernen.

3. Nanopore Charakterisierung

  1. Legen Sie die Zelle in der Nanoporen elektrisch abgeschirmt Versuchsaufbau und legen Ag / AgCl-Elektroden in jedem Reservoir. Diese Einrichtung ist ähnlich der in Fig. 2 mit Ausnahme der externen Stromversorgung und der Stromverstärker, die dargestellt sindmit einer geräuscharmen Widerstandsrückkopplungsverstärker ersetzt.
  2. Mit dem rauscharmen Verstärker in Voltage-Clamp-Modus gelten Potentiale Kehren von -200 mV bis 200 mV und notieren Sie die IV-Kennlinien.
  3. Setzen Sie die IV-Kurve zu nanopore Leitfähigkeit, die verwendet werden kann, um seinen Durchmesser in Lösung 17 berechnen zu erhalten. Wenn die berechnete Durchmesser viel kleiner als von TEM erwartet, ist die Poren wahrscheinlich nicht vollständig benetzt und / oder Schmutz oder Verunreinigungen enthält.
  4. Tragen Sie eine 200 mV Potential über die Nanoporen und Aufzeichnung der Ionenstrom für 30 Sekunden.
  5. Durchführen einer spektralen Leistungsdichte (PSD) Analyse der Ionenstrom zu integrieren und um die elektrischen Rauscheigenschaften der Nanopore zu quantifizieren. Wenn das Rauschen oberhalb von 15 pA RMS bei 5 kHz-Bandbreite ist, dann ist die Poren wahrscheinlich nicht vollständig benetzt und / oder Verunreinigungen enthält, und können nicht zuverlässig in Experiment verwendet werden.

4. Anlage Nanoporen Mit High Elektro Fields

Hinweis: Wenn die IV-Kurve ausgestellten Asymmetrie erzeugt oder weniger als erwartet Leitfähigkeit oder die aktuelle Spur zeigte Instabilität und hohe Geräuschpegel bei niedrigen Frequenzen ist es notwendig, die Nanoporen mit hohen elektrischen Feldern zu konditionieren, um Verunreinigungen zu entfernen, von der Poren Oberfläche und / oder Benetzung der Pore. Während dieses Verfahren keinen Einfluss auf die Hochfrequenzrauschen von der Membrankapazität oder eine parasitäre Kapazität mit dem Eingang des Stromverstärkers gekoppelt Messungen verursacht werden, Niederfrequenzrauschen (auch als 1 / f Rauschen) 18 stark reduziert werden. Eine schematische Darstellung der Einrichtung verwendet werden, um diese Konditionierung durchzuführen, ist in Fig. 2 gezeigt.

  1. Trennen Sie die Elektroden von der Patch-Clamp-Verstärker.
  2. Schließen Sie eine der Elektroden mit einem Computer-gesteuerte Stromversorgung in der Lage ist> 6 V (> 0,2 V / nm elektrischen Feldstärke für die 30 nm dicke Membranen verwendet) und die andere an einen EXternal Stromverstärker, die in Echtzeit überwacht werden können.

    Hinweis: Die Anwendung von hohen elektrischen Feldern verwendet werden, um Nanoporen in verschiedenen Membranmaterialien und-dicken zu konditionieren. Während die beiden 30-nm-und 10-nm-Membranen hier diskutiert werden, beschrieben Spannungen beziehen sich auf die 30-nm dicke Membranen verwendet, wenn nicht anders angegeben.

  3. Anwenden einer Potentialdifferenz von 400 mV (Messspannung) über die Nanopore für mindestens 5 Sekunden.
  4. Berechnen der Durchschnittsstromwert von der letzten 1 s von Daten, um die Leitfähigkeit der Nanopore zu bestimmen. Berechnen des Durchmessers der Nanopore auf der Grundlage dieser Leitfähigkeit, die automatisch über die Software und die Nanopore Leitwert Modell der Wahl auf Basis der wahrscheinlichsten Geometrie durchgeführt werden sollte. Es sollte dem Durchmesser der IV-Kurve gemessen entsprechen.
  5. Anwenden eines 200 ms-Impuls von 6 V (Netzspannung) über die Nanopore um ein elektrisches Feld von 0,2 V / nm, gefolgt von einer 5 sec Messdauer zu erzeugenbei 400 mV. Wiederum berechnen einen Durchmesser der Nanopore mit der Abschluss 1 sec von Daten und Vergleichen mit dem Wert aus TEM-Messungen erwartet, dass die Nanoporen vollständig naß. Wenn nötig, mehrmals wiederholen.
  6. Falls erforderlich, wiederholen Sie die Anwendung hoher elektrischer Feldpulse mit steigender Spannung, bis die aktuelle Signal während der Messperiode ist stabil und zeigt die erwartete Leitfähigkeit. Es wird nicht empfohlen, 10 V (dh> 0,3 V / nm) überschreiten, da dies wesentlich vergrößern oder Nanoporen schnell beschädigen.

5. Vergrößern Mit Nanoporen hohe elektrische Felder

Hinweis: Der Durchmesser der Nanopore ist entscheidend bei der Bestimmung ihrer Funktionalität für einen bestimmten biomolekularen Erfassungsanwendung. Zu diesem Zweck mit einem TEM kann auf eine gewünschte Größe durch die Anwendung hoher elektrischer Felder vergrößert, bis der geeignete Durchmesser ist mit dem gleichen Aufbau verwendet, zu reinigen und zu befeuchten erreicht werden erzeugt ein die NanoporeNanopore (Abbildung 2).

  1. Mit der gleichen Elektronenkonfiguration wie in Teil 4, gelten ein 200-500 mV Vorspannung über den Porendurchmesser, um eine Messung zu erhalten. Während weniger präzise als Anpassung einer IV-Kurve kann eine Einzelpunktmessung zur groben schnell schätzen die Nanoporen-Größe werden.
  2. Anwenden eines 2 sec Impuls von 8 V über die Nanopore, gefolgt von einer Messzeit von mindestens 5 sec bei 400 mV. Die Berechnung der neuen Durchmesser wird in der Regel zeigen eine sehr geringe Erhöhung der Nanoporengröße (<0,1 nm).
  3. Wiederholen Sie diesen Vorgang zyklisch, im Wechsel zwischen Erweiterung und Messspannungen in-situ-und Echtzeit-Messungen der zunehmenden nanopore Durchmesser zu erhalten.
  4. Wenn schnellere Wachstumsrate ist wünschenswert, erhöhen die Grße der schrittweise bis zu 10 V. Wachstum angelegte Spannung beschleunigt die typischerweise Poren vergrößert sich mit der Rate der Zunahme der Leitfähigkeit im Bereich von 0,03 nS / s ec & #160; 10 nS / sec, je nach der Größe der Nanoporen, der Stärke des elektrischen Feldes und Elektrolytlösungseigenschaften.
  5. Wenn der gewünschte Durchmesser erreicht ist, beenden Sie die Anwendung von hohen elektrischen Feldern. Dies kann automatisch mit Hilfe des Computerprogramms erfolgen.
  6. Schließen Sie die Patch-Clamp-Verstärker an den Elektroden.
  7. Gewinnen Sie neue IV und aktuelle Trace-Daten bei 200 mV, um den Durchmesser der Nanoporen zu bestätigen und geräuscharme Stromsignale wie in Schritten von 3,2 bis 3,5 höher. Falls erforderlich, wiederholen Anlage und Erweiterung Protokoll (Schritte von 4,1 bis 5,5).

6. DNA-Translokation

  1. Vor der Zugabe einer biomolekularen Probe, eine Kontrollexperiment durchzuführen, um sicherzustellen, dass es keine Kontamination in dem Reservoir. Erwerben eine aktuelle Trace unter einem angelegten Potential von 150 bis 300 mV in Abwesenheit einer Probe, um zu überprüfen, dass keine Strom Blockaden nach 2 min festgestellt.
  2. In λ-DNA (48,5 kbp Doppelstrang) zu der <em> cis Reservoir für eine Endkonzentration von 0,5-2 ng / ul. Vorsichtig mit einer Pipette unter Rückfluß für mindestens 10 Sekunden, um eine homogene Verteilung der Probe während des Reservoirs zu gewährleisten.
  3. Für eine 30 nm dicke Nanoporen, gelten eine mögliche Verzerrung von 150 bis 300 mV an das transBehälter und messen den Ionenstrom durch die Nanopore. Für sehr kurze Translokationsereignisse, ist es erwünscht, bei einer hohen Frequenz (250 kHz oder höher) mit einem relativ hohen Tiefpaßfilterung Frequenz (100 kHz) abzutasten.
  4. Überwachen Sie den Ionenstrom mit Hilfe von Software transiente Strom Blockaden erkennen als Moleküle Translokation durch die Nanopore. Die Ionenstrom-Spuren Molekular Translokation kann analysiert werden, um Verstopfungen Tiefe, Dauer und Frequenz, um Informationen über die Probe von Interesse schließen bestimmen. Umgekehrt, wenn Informationen über die zu translozieren Molekülen bekannt ist, können diese Daten verwendet, um die Eigenschaften der Nanopore sich zu untersuchen.

Representative Results

Die in dieser Studie verwendeten Nanoporen wurden in 30-nm bzw. 10 nm dicke Siliziumnitrid-Membran Fenster gebohrt. Während das beschriebene Protokoll kann zu Festkörper-Nanoporen verschiedener Material hergestellt unter Verwendung von Verfahren angewendet werden, werden sie häufig von TEM gebohrt mit vorher festgelegten Protokolle 11,14. Nanoporen durch TEM gebohrt sind typischerweise zwischen 4-8 nm Durchmesser (Fig. 2). Während die beiden 30-nm-und 10 nm dicke Membranen befestigt und mit dem obigen Protokoll konditioniert werden, beschrieben Vorspannungen beziehen sich die 30 nm dicke Membranen erforderlich, sofern nicht anders angegeben. Für Membranen von unterschiedlicher Größe, sollte die angelegte Spannung eingestellt, um ein elektrisches Feld im Bereich von 0,15-0,3 V / nm innerhalb der Nanoporen zu erzeugen.

3a zeigt zwei typische Leitfähigkeit Spuren einer 10-nm-Nanoporen in einem 30-nm dicke Membran vor und nach der Behandlung mit hohen elektrischen Feldern. Bei der Montage eines neu dgerillt Nanoporen, ist die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens eines instabilen und laut Ionenstromsignal, einen hohen Grad von Niederfrequenzschwankungen, in der Regel hoch. Die in Fig. 3a gezeigt Nanopore hebt dieses Verhalten. Dessen Leitfähigkeit wesentlich geringer ist wegen unvollständiger Benetzung als eine Nanopore seiner Größe, wahrscheinlich zu erwarten. Bei der Anwendung von hohen elektrischen Feldern von 0,27 V / nm in der Größe von 8 V Impulsen (90 Impulse von 2 sec Dauer) erzeugt, wird die Nanopore vollständig zu benetzen und anschließend bis 21 nm im Durchmesser vergrößert. An dieser Stelle weist die Poren eine stabile Leitfähigkeit mit geräuscharmen Eigenschaften. Quantitative Analyse von Rauschen in ähnlicher Nanoporen als spektrale Leistungsdichtedarstellungen in Fig. 3b gezeigt. Das niederfrequente Rauschamplitude unwet und / oder verstopfte Poren ist sehr hoch (> 20 Pa RMS), wodurch sie unbrauchbar Experiment. Nach Anlage mit hohen elektrischen Feldern, Rauschleistung bei niedrigen Frequenzen (<10 kHz) ist diminisum bis zu drei Größenordnungen und bereit für den Low-Noise-Experimente hed.

Figur 4a zeigt eine typische Strommessung als das Potential angelegt wird zwischen hohen elektrischen Feldern zum Vergrößern und niedrigen elektrischen Feldmessperioden gepulst. Nach jedem nachfolgenden Impuls, der resultierende Ionenstrom durch die Nanopore zu der Messspannung (dh die Nanopore Leitfähigkeit) erhöht um einen endlichen Betrag. Dies zeigt, dass die Nanopore wird vergrößert, wenn der Durchmesser d von seiner Leitfähigkeit G in einer Lösung von Leitfähigkeit σ abgeleitet werden, wie in etwa der Nanopore mit zylindrischer Geometrie der effektiven Länge L eff. Während verschiedene andere Modelle für Nanopore bezüglich Leitfähigkeit seiner Geometrie 17,19-21 bestehen, die folgende Beziehung, die einen geometrischen Begriff und einer Zugangswiderstand Begriff umfasst, ist gültig für TEM bohrt Nanoporen in hoher Salz erwiesenKonzentrationen über einen weiten Bereich von Durchmessern von Interesse für dsDNA Translokation 17,22.

Sobald der gewünschte Durchmesser erreicht ist, wird der Prozess durch die Software automatisch gestoppt. Die resultierende Nanopore Durchmesser kann dann unter Verwendung präziser IV-Messungen bestätigt werden, wie in Fig. 4b gezeigt.

Es ist wichtig zu bemerken, dass Nanoporen mit hohen elektrischen Feldern behandelt sind voll funktionsfähig. Dies wird durch den Nachweis von λ DNA Translokation validiert, wie in den Spuren Leitfähigkeit in 5a dargestellt gezeigt. In dieser Figur ist dsDNA durch zwei Nanoporen, die auf 11 nm und 32 nm mit dem beschriebenen Verfahren ein gefahren wurden. In jedem Fall ist die Grundlinie Leitfähigkeit extrem stabil und klar Blockaden beobachtet, wie dsDNA-Moleküle Translokation durch die Nanopore, zeigt hohes Signal-Rauscheinzelmolekül Translokationsereignisse im Vergleich zu unbehandelten Poren, die hohe Rausch aufweist. Wie in den Einsätzen von 5a dargestellt ist, sind mehrere diskrete Blockade Ebenen beobachtet, wie einzelne Moleküle gefaltet transloziert, wie Nanoporen dieser Größen erwartet. Histogramme der Nanopore während der Translokation Leitfähigkeit Ereignisse durch jede Pore in Fig. 5b gezeigt. Die geräuscharmen Eigenschaften der Nanoporen zeigen deutlich, leicht auflösbare Peaks, die der Grundlinie (keine DNA), Single (ein DNA-Strang - aufgeklappt) und Doppel Blockade-Staaten (zwei DNA-Stränge - gefaltet). Bemerkenswert ist die Tatsache, dass die Änderung der Leitfähigkeit entsprechend einem einzelnen dsDNA-Molekül besetzen die Poren ist für die großen und kleinen Nanoporen. Dies ist ein indirekter Beweis, daß die Anwendung von hohen elektrischen Feldern ist in der Tat Erweiterung bestehender Nanoporen, die gleiche Amplitude Blockierung würde beobachtet werden, wenn andere Poren oder Risse wurden in t erzeugtMembran er während des Prozesses 17.

Ähnlich Fig. 6 veranschaulicht die Wirksamkeit von hohen elektrischen Feldern zur Vergrößerung Nanoporen in Membranen unterschiedlicher Dicke hergestellt. Hier ist ein Nanoporen in einem 10-nm SiNx Membran erstellt zunächst teilweise unwet, die Anzeige instabil und relativ geringe Leitfähigkeit. Bei der Anwendung von Wechselstrom ± 3 V (± 0,3 V / nm) Impulse von 4 sec Dauer (30 insgesamt), wird die Nanopore nassen und IV zeigt ideale Eigenschaften für eine 3 nm Poren. Die Methodik wurde dann für 400 aufeinanderfolgenden Impulsen wiederholt und die Nanopore auf 8 nm vergrößert. Diese Erweiterung, bei vergleichbaren elektrischen Feldern durchgeführt, aber niedrigere angelegte Vorspannung als bei Nanoporen in 30-nm-Membranen hergestellt werden, zeigt, dass der Prozess in erster Linie elektrischen Feld angetrieben. Da die Translokation durch eine dünnere Membran erzeugten Strom-Blockade ist größer als bei dickeren Poren Nanoporen in dünnen Membranen hergestelltauf diese Weise behandelt werden können, verwendet werden, um kürzere Moleküle wie Proteine ​​mit erhöhter Empfindlichkeit zu untersuchen.

Figur 1
Fig. 1 ist. Nanopore Zellenanordnung. Ein Silizium-Nitrid-Membran, die eine Nanoporen zwischen Silikon-Elastomer-Dichtungen, die wiederum durch zwei Teflon Halbzellen haltigen Elektrolyten Druckbehältern sind platziert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Figur 2
2. Nanopore Anlage und Erweiterung Setup. Ein Nanoporen in einer 30 nm dicken Silizium-Nitrid-Membran (links) gebohrt verbindet zwei Elektrolyt-Stauseen. AComputer verwendet wird, um entweder eine Patch-Clamp-Verstärker oder externe Stromversorgung (DAQ-Karte), die eine potenzielle Verzerrung über Ag / AgCl-Elektroden in den Elektrolyten eingetaucht Stauseen gilt über die Nanopore steuern. Der Stromverstärker leitet die Ionenstrom gemessen, um die in Echtzeit unter Verwendung von Computer-Software überwacht werden. Diese Zahl wurde von [11] geändert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 3
3. Strombahnen vor und nach Anwendung von hohen elektrischen Feldern. (A) Bei der Montage und auch nach der Reinigung mit Piranha-Lösung ist die Leitfähigkeit der Nanopore instabil und kleiner als bei einem zylindrischen 10-nm-Poren (blau) erwartet. Nach der Anwendung von 2 sec Impulse von 8 V, dasNanopore vollständig benetzt und vergrößert, zeigt eine stabile Leitfähigkeit und kann für molekularbiologische Experimente Erkundung (grün) verwendet werden. (B) spektrale Leistungsdichte Plots von einem unvollständig benetzt und verstopft Nanoporen (blau und orange, beziehungsweise). Bei Anwendung von 200 ms Impulsen von 8 V wurden die Nanoporen benetzt und Schmutz entfernt (grün bzw. rot). Diese Zahl wurde von [11] geändert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 4
4. Nanopore Erweiterung mit hohen elektrischen Feldern. (A) Der Wechsel zwischen Erweiterung und Mess potentielle Vorurteile (rot) zeigt, dass der Ionenstrom durch die Nanopore (blau) in endlichen Schritten erhöht. Die daraus resultierende Verhaltenrungs Messung kann verwendet werden, um Nanoporen-Durchmesser abzuleiten. Sobald der gewünschte Durchmesser erreicht worden ist, wird der Prozess beendet. (B) Präzise IV-Messungen der Leitfähigkeit bestätigen, dass Nanoporen-Größen haben sich erhöht. Solche Grundstücke bieten eine bessere Abschätzung der Porengröße als Einzelpunkt-Stromwerte, wie sie fit werden können und deren symmetrische und Ohmsche Verhalten kann bestätigt werden. Diese Zahl wurde von [11] geändert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Figur 5
5. DNA-Translokation durch Anlage Nanoporen. (A) Die Zugabe von dsDNA (48,5 kbp) zu einer Seite der Nanopore bei einer Vorspannung von 150 mV erzeugt transiente Blockaden in den Spuren Leitfähigkeit von 11 nm (blau) und 32-nm-porES (rot). (B) Histogramme der Leitfähigkeit von jedem der Nanoporen zeigen diskrete Peaks, die der Grundlinie, Einzel-und Doppel Translokation Veranstaltungen. Diese Zahl wurde von [11] geändert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 6
6. Erweiterung der Nanoporen in 10 nm Membranen. Ein Nanoporen in einem 10-nm-Membran ursprünglich eine sehr geringe Leitfähigkeit und asymmetrische IV-Charakteristiken (orange). Bei Anwendung von 30 Impulsen von abwechselnd ± 3 V (4 sec Dauer), die Nanopore benetzt und zeigt ideale Eigenschaften IV mit einer Leitfähigkeit im Einklang mit der für eine 3 nm Poren (blau) erwartet. Weitere 400 Impulse von ± 3 V vergrößert die Nanopore zu einem Durchmesser von 8 nm(Grün). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Discussion

Kontrolle der Nanoporengröße ist von grundlegender Bedeutung in der biomolekularen Erfassungsanwendungen. Nanoporendurchmessern muss die Reihenfolge der Größe der Moleküle, die geprüft werden, sie müssen groß genug sein, um die Probe aufzunehmen, aber klein genug, um eine optimale Signal-zu-Rauschen zu erreichen. Während die Steuerung der Größe der Anwendung mit der hohen elektrischen Feldern vorgestellte Methode ist unidirektional, dass Nanoporendurchmesser sind nur während des Prozesses erhöht wird, kann Nanoporen mit Durchmessern zwischen 3-100 nm fashioned sein, mit Sub-Nanometerpräzision. Wie 3-4 nm Poren kann leicht mit einem TEM 23 hergestellt werden, ermöglicht dies für die zuverlässige Herstellung von Festkörper-Nanoporen für eine breite Palette von Anwendungen von Sondierungs ssDNA Struktur der Wechselwirkung von sperrigen Protein-Ligand-Komplexe. Während Nanoporen-Wachstum von über 100 nm sehr schnell und weniger genau zu sein, können weitere moderate Vergrößerung Bedingungen eingesetzt werden, um eine bessere Kontrolle über den Prozess zu erreichen. Als such, ist der wichtigste Schritt für eine wirksame Steuergröße die Wahl der Impulsstärke und Dauer, um die Effizienz und die Vergrößerung Präzision bei der Erreichung eines gewünschten Porendurchmesser erforderlich auszugleichen. Dies wird auch durch die Erweiterung der dünner Nanoporen (10-nm Dicke), wobei die Erweiterung wird eine geringere Vorspannung aber vergleichbare elektrische Feldstärke beobachtet hervorgehoben. Abhängig von der endgültigen Größe, ist es generell möglich, zu vergrößern, um eine Nanoporen-Sub-100-nm Durchmesser in ein paar Minuten.

Ähnlich große Niederfrequenzstromschwankungen ausschließen Einzelmolekülstudien, wie es ist fast unmöglich, Translokation Signale vom Hintergrundrauschen zu unterscheiden. Unvollständige Benetzung 24, kann die Anwesenheit von kohlenstoffhaltige Rückstände nach der ersten Herstellung 25 und Adsorption von Schmutz auf der Nanoporenwand 13 verbleibenden Signalqualität verschlechtern, die zusätzliche Reinigung mit aggressiven chemischen Behandlungen, die oft inefficacious. Interessanterweise ist es üblich, für Festkörper-Nanoporen-Protokolle, um die Bedeutung der Reinigung der Nanoporen in Piranha-Lösung oder mit Sauerstoffplasma vor der Montage um die Benetzung zu unterstützen oder eine Kontamination über von den Bohr-, Imaging-und Abwicklungsprozesse zu entfernen verließen betonen. Auch mit dieser Behandlung jedoch Nanoporen oft nicht nass oder weiterhin hohe Lärm zeigen und die vorgeschlagene Lösung für die fehlgeschlagenen Versuche ist es, zusätzliche Reinigung, die sehr zeitaufwendig sein kann, 14 durchzuführen. Mit der Anwendung von hohen elektrischen Feldern, diese langen Protokollen nicht notwendig in Abhängigkeit von der Anwendung sein. Es wurde festgestellt, dass die meisten Geräte könnten in situ unter Verwendung der hier beschriebenen Methode überholt werden, damit die Vorbereitungszeit zu reduzieren und die Notwendigkeit, mit ätzenden Chemikalien umzugehen. Die wichtigsten Schritte bei der Eindämmung des elektrischen Störungen ist eine einfache Erhöhung der Spannung und / oder Pulsdauer vollständig benetzen die Poren und entfernt lose gebundenen Schmutz.Nanoporen in dieser Weise behandelt werden können, zuverlässig Biomolekül Translokation Experimente, wie den Durchgang von DNA und Proteinen verwendet werden. Wenn diese Moleküle an die Porenwand, die zu einer Verstopfung und laut elektrisches Signal halten, können hohe elektrische Feldimpulse erneut angewendet werden, um das Hindernis zu entfernen und wieder geräuscharmen Eigenschaften für weitere Experimente, ohne Aushängen der Nanopore Chip von fluidischen Zelle.

Die Anwendung von hohen elektrischen Feldern mit dem beschriebenen Aufbau wird durch die Anforderung von einer externen Stromversorgung, die bis zu 10 V und Stromverstärker, der die Empfindlichkeit und geräuscharmen Eigenschaften bei hohen Bandbreiten (> 1 kHz) fehlt beantragen kann, begrenzt Einzelmolekül-Erkundung. Während typische molekularbiologische Experimente stützen sich auf eine geräuscharme Stromverstärker, die begrenzt auf ± 1 V ist, ist es einfach, ein einzelnes System, das sowohl hohe elektrische Feldanlage und empfindliche Strommessung mit einem einstell erreichen könnte entwerfenstabile Verstärkung. Trotz dieser Einschränkung ist der Übergang von einer Einrichtung in die andere schnell und unkompliziert. Im Vergleich zu bestehenden Techniken zur Steuerung nanopore Größe wie der Einsatz von SEM 5, thermische Oxidation und Membran Neugestaltung 8, bieten einen hohen elektrischen Feldern ein schneller, präziser und kostengünstiger Methodik, die mit Standard-Ausrüstung auf dem Labortisch durchgeführt werden können und bieten ein breiteres Spektrum von Nanoporen-Größen. Die Fähigkeit, schnell und reproduzierbar zu reduzieren niederfrequente Rauschen macht auch erste Herstellung zuverlässiger und verlängert die Lebensdauer von Festkörper-Nanoporen, wie vorher verwendet Poren für weitere Experimente verjüngt werden. Insgesamt wurden über 95% der Nanoporen unterschiedlicher Dicke mit hohen elektrischen Feldern Anlage zeigte sehr wenig Niederfrequenzrauschcharakteristik, geeignet für Biomolekül Erfassungs wodurch sie. Die Herstellung ist somit einfacher und zuverlässiger, so dass Solid-State-Nanoporen Experimente mehr ZugänglichkeitBLE, die Forscher und können potenziell für einen Weg zur Kommerzialisierung von Nanoporen-Technologien durch robuste Fertigungsprozesse.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir danken für die Unterstützung durch die Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Canada Foundation for Innovation, und dem Ontario Research Fund. Wir danken Y. Liu für Hilfe in Nanoporen-Herstellung und Charakterisierung, L. Andrzejewski für wertvolle Diskussionen und technische Unterstützung, und A. Marziali für die Hilfe bei Nanoporen-Software und Mess-Design.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEM-2100F TEM JEOL Drilling requires 200 kV accelerating voltage
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier Molecular Devices Low-noise voltage and current amplifier
X-Series data acquisition card National Instruments PCI-6351 Interfacing with setup, apply of high electric fields
LabVIEW 2012 software National Instruments Apply voltages, record current, data analysis
Current amplifier Keithley Current amplification during high electric field pulses
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows Norcada Inc. NT005X Substrate in which nanopores are created
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows Norcada Inc. NT005Z Substrate in which nanopores are created
Silicone elastomer O-rings Marian Chicago HT6135 Punched for sealing the nanopore chip
Ag/AgCl electrodes In Vivo Metric E255
Nitric acid Fisher Scientific 52004P Used for cleaning cells - handle with caution
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H323 Used for piranha solution - handle with caution
Sulfuric acid Fisher Scientific A300 Used for piranha solution - handle with caution
Potassium chloride Fisher Scientific P335
HEPES Fisher Scientific BP310 Buffering KCl solution
Primary Faraday cage Shielding nanopore cell, electrodes
Secondary Faraday cage Shielding headstage, electrode wires
Teflon cell To hold nanopore chip and reservoirs
Hot plate VWR Heating piranha solution

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References

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