Réduit la concentration et la durée d'itraconazole et efficace dans le traitement

Immunology and Infection

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Summary

infection Batrachochytrium dendrobatidis chez les amphibiens peut être éliminé en utilisant une concentration réduite (0,0025%) et de plus courte durée (bains cinq minutes pendant six jours) de l'itraconazole que ce qui est généralement utilisé. Moins de mortalité et moins d'effets secondaires négatifs ont été observés en utilisant ce protocole de traitement modifié.

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Brannelly, L. A. Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians. J. Vis. Exp. (85), e51166, doi:10.3791/51166 (2014).

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Abstract

Amphibiens connaissent la plus forte baisse d'une catégorie de vertébrés et la principale cause de ce déclin est un champignon pathogène, dendrobatidis Batrachochytrium (BD), ce qui provoque la chytridiomycose, maladie. Colonies d'assurance captives sont importantes dans le monde entier pour les espèces d'amphibiens menacées et peuvent être la seule bouée de sauvetage pour ceux qui en menace critique d'extinction. Le maintien de maladies colonies libres est une priorité des gestionnaires captifs, encore des traitements sûrs et efficaces pour toutes les espèces et à travers les étapes de la vie n'ont pas été identifiés. Le traitement chimiothérapeutique le plus utilisé est l'itraconazole, même si la dose utilisée peut être nocif pour certains individus et d'espèces. Nous avons effectué un essai de traitement clinique pour déterminer si une dose plus faible et plus sûr mais efficace de l'itraconazole peut être trouvé pour guérir les infections Bd. Nous avons trouvé que, en réduisant la concentration de 0,01 à 0,0025% le traitement et la réduction de la durée de traitement de 11-6 Jours de 5 min des thermes, grenouilles pourraient être guéris de l'infection Bd avec moins d'effets secondaires et de la mortalité associée au traitement moins.

Introduction

Amphibiens connaissent actuellement le plus grand déclin de la biodiversité de tous les taxons de vertébrés 1. Chytridiomycose, une maladie de la peau causée par les champignons dendrobatidis pathogène Batrachochytrium chytrides (BD), est l'une des principales causes de ces déclins dramatiques 2 Bd est la pire pathogène sur dossier à entraîner la perte de la biodiversité:. Qu'il infecte plus de 600 espèces d'amphibiens et a ont provoqué une baisse de plus de 300 espèces, dont pas moins de 200 espèces sont devenues danger critique d'extinction ou éteintes 2,3. La chytridiomycose amphibie n'est pas l'hôte spécifique et il n'est pas clair quelles sont les qualités de l'hôte permet à l'infection Bd de progresser provoquer une maladie grave. Chytridiomycose provoque la mort en perturbant les canaux ioniques dans la peau, entraînant une perte d'électrolyte et l'insuffisance cardiaque 4. En outre, Bd surnageant (contenant aucun zoospores Bd) provoque une réponse immunitaire chez des têtards 5 leading chercheurs croient Bd produit un sous-produit toxique 6.

Parce que de nombreuses espèces sont en déclin rapide, les colonies d'assurance captives et les programmes d'élevage sont importantes mesures de conservation, et peut-être la seule bouée de sauvetage pour certaines espèces. Établir et maintenir des colonies libres maladie est un défi pour les installations de gestion des amphibiens. Les méthodes actuelles de chimiothérapie pour le traitement des infections Bd, bien qu'efficaces, peuvent être nuisibles pour les animaux qui sont traités, et aucune méthode unique de traitement a été un succès à travers les espèces et classes d'âge de 7 amphibiens.

Peu d'essais cliniques de traitements pour l'infection Bd ont été réalisées 7. Les trois méthodes les plus couramment utilisées sont le traitement thérapie par la chaleur, le chloramphénicol et itraconazole. la thérapie de chaleur est une option de traitement nonchemotherapeutic qui semble avoir peu d'effets secondaires, peuvent être utilisés sur plusieurs étapes de la vie, et est généralementallié efficace. Dans un essai de traitement, Chatfield et Richards Zawacki 8 ont trouvé que 96% des animaux traités a dégagé infections après avoir été logé à 30 ° C pendant 10 jours. Bien que cet essai n'était pas à 100% de réussite, il fournit une base pour d'autres pour évaluer la thérapie de chaleur pour leur propre espèce. Thérapie par la chaleur, mais efficace pour de nombreuses espèces, n'est pas pratique pour de nombreuses espèces alpines qui ne peuvent pas rester à des températures élevées pendant une période de temps prolongée. Chloramphénicol, un antibactérien, a été utilisée avec succès pour traiter Bd chez de nombreuses espèces, et inhibe la croissance fongique in vitro. Comme antibactérien, le chloramphénicol n'attaque pas spécifiquement le champignon mais a été connu pour provoquer l'apoptose dans les cellules eucaryotes 9. Il a été spéculé que la thérapie de chloramphenicol provoque l'apoptose dans la peau, en tuant des sporanges intracellulaire, bien que le mécanisme d'action exact n'est pas connu. Bien qu'aucune étude clinique a été menée, et doncdose et la durée du traitement n'ont pas été évalués, les protocoles de traitement actuels exigent généralement immersion pour deux à quatre semaines 10,11, ce qui en fait un traitement pratique pour les amphibiens terrestres. Chloramphénicol a également été restreinte dans certains pays à usage vétérinaire, car l'exposition humaine a été associée à une forme rare d'anémie aplasique 12.

Itraconazole, un antifongiques azolés, est le plus largement utilisé pour le traitement de l'infection Bd des amphibiens en captivité. Le protocole le plus utilisé est les animaux de bain dans une solution itraconazole 0,01% pour cinq minutes par jour pendant 11 jours consécutifs. Ce protocole a été dérivé de normes utilisées pour l'administration de mammifères, et, tout en étant efficace pour les amphibiens, il n'est pas basé sur les essais cliniques chez les amphibiens 11,13. Ce protocole peut entraîner des effets secondaires négatifs dans certaines espèces, en particulier dans le genre Rana et des têtards et métamorphes dernières 11.Têtard traitement a été couronnée de succès en utilisant une concentration beaucoup plus faible (0,0005%) de l'itraconazole, mais était associée à une dépigmentation 14. Cette concentration a été mis à l'essai même sur métamorphes récentes et a constaté à l'échec à traiter une infection 15. Parce qu'il ya risque d'effets secondaires négatifs avec le traitement itraconazole, certains praticiens ont utilisé la moitié de la concentration habituelle (0,005%) pour 11 jours consécutifs et trouvé ceci pour être réussi à guérir les infections Bd 16.

La présente étude est un résumé d'un essai clinique de traitement utilisant l'itraconazole pour traiter l'infection Bd 15. Le protocole décrit une tentative de trouver la dose la plus faible et le traitement du temps qui est à la fois sûr et efficace pour traiter les animaux infectés Bd avec l'itraconazole. Les animaux utilisés dans cette étude étaient récentes métamorphes de crapauds de côte du golfe, Incilius nebulifer.

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Protocol

Approbation éthique: Cette étude et ses méthodes ont été approuvés par l'utilisation des animaux et des Soins de la commission de l'Université de Tulane (protocole n ° 0407.).

Une. Test pour Bd infection

  1. Pistonnage pour Bd
    1. animaux écouvillon avec un coton-tige stérile cinq fois sur la ventrale, cinq fois sur chaque cuisse, de chaque côté, et chaque membre pour un total de 45 coups. Le décolmatage est une méthode non invasive d'échantillonnage pour Bd sur la peau des amphibiens.
    2. Tournez doucement l'écouvillon pendant et entre les courses pour assurer la plus grande quantité d'ADN est recueillie sur le coton.
    3. tampons de magasins dans 1,5 ml microtubes à -20 ° C.
  2. Extraction de l'ADN et analyse qPCR
    1. Extraire l'ADN génomique à partir des écouvillons en utilisant un kit d'isolement d'ADN disponible dans le commerce, conformément aux instructions d'un tissu animal.
    2. Analyser l'ADN extrait en utilisant la PCR quantitative en temps réel (qPCR) suivant Boyle 17, avec les modifications suivantes.:
    3. Diluer les échantillons d'extraction d'ADN à 1:10 avec de l'eau doublement désionisée.
    4. Ajouter 0,7 pi d'albumine de sérum bovin (BSA) afin d'empêcher l'inhibition de la PCR.
    5. Inclure un contrôle positif interne dans chaque échantillon afin de s'assurer inhibition de la PCR n'a pas influé sur les résultats.
    6. Échantillons fonctionnent avec un contrôle positif et négatif et une série de normes de dilution pour estimer zoospore (infection) charge.

2. Inoculation

  1. Culture Bd
    1. Préparer un bouillon de tryptone en ajoutant 10 g de tryptone à 1 L d'osmose inverse ou de l'eau désionisée, à l'autoclave (121 ° C pendant 40 min) et on le laisse refroidir. Une fois refroidi à 23 ° C, ajouter 1 ml de pénicilline-streptomycine.
    2. Cultivez souche Bd (JEL411 de J. Longcore, isolé de Guabal, Panama d'une Phyllomedusa lémurien) dans un bouillon de tryptone pendant sept jours à 23 ° C.
  2. Transférer la broth culture tryptone et des plaques d'agar.
    1. Pour fabriquer des plaques, ajouter 10 g de tryptone et 10 g d'agar à 1 L d'osmose inverse ou de l'eau déminéralisée et autoclave (121 ° C pendant 40 min).
    2. Une fois le mélange à l'autoclave est suffisamment froid au toucher, mais avant qu'il ne se fige, verser dans des boîtes de Pétri, 1/4-1/3 plein, dans une hotte à flux laminaire.
    3. Lorsque la gélose a figé et complètement refroidi, ajouter 0,5 ml de bouillon Bd de chaque plaque et répartir uniformément autour de la plaque. Laisser sécher.
    4. Une fois les plaques sont inoculées avec des zoospores Bd, plaques d'étanchéité avec Parafilm.
    5. Laisser les plaques à incuber à 23 ° C pendant cinq à sept jours. Vérifiez zoospore mouvement pour assurer la viabilité avant l'inoculation.
  3. plaques d'inondation pour la solution d'inoculation zoospore
    1. Après les cinq à sept jours de Bd incubation et la croissance, inonder chaque plaque avec 5 ml d'eau du robinet d'âge et permettent zoospores d'entrer les médias pendant 10 min.
    2. Verser le suspe de zoosporesnsion dans un récipient portable.
    3. Estimer la concentration de zoospores avec un hématimètre.
    4. Diluer le mélange à une concentration de 1 x 10 6 par 3 ml avec de l'eau du robinet vieilli.
  4. Inoculer des animaux
    1. Dans individuels de 50 ml conteneurs, inoculer chaque animal en versant 3 ml de mélange d'inoculum sur son ventrale. Laisser inoculum supplémentaire de s'écouler dans le fond du récipient d'inoculation.
    2. Chaque animal restera dans le récipient d'inoculation pendant 24 heures afin d'assurer l'infection.
    3. Après 24 h de l'inoculation, les animaux de terrariums retourner désinfectés individuels.
    4. Laisser infection de construire pour deux semaines. Confirmer l'infection avec la tige et les résultats de qPCR, et commencer le traitement.
    5. Pour les contrôles Bd-négatifs, inondations Bd sans plaques d'agar avec 5 ml âgés de l'eau du robinet, et ensemencer maquette les animaux en utilisant les mêmes méthodes que ci-dessus.

3. Schéma de traitement

  1. Prepare bain de traitement
    1. Ajouter 2,50 ml itraconazole aqueuse (1% Sporanox Solution orale) à une solution de L amphibiens Ringer (0,0025% de l'itraconazole - la plus faible concentration de traitement efficace).
      1. Solution la recette de Amphibian sonnerie: 1 L d'osmose inverse ou de l'eau déminéralisée, 6,6 g de chlorure de sodium, 0,15 g de chlorure de potassium, 0,15 g de chlorure de calcium, et 0,2 g de bicarbonate de sodium. Solution autoclave (121 ° C pendant 40 minutes) et laisser refroidir à température ambiante.
      2. Pour 0,01% de la concentration de traitement itraconazole, ajouter 10,00 ml itraconazole aqueuse (1% Sporanox Solution orale) à la solution de 1 L amphibiens sonnerie
      3. Pour 0,005% la concentration de traitement itraconazole, ajouter 5,00 ml itraconazole aqueuse (1% Sporanox Solution orale) à la solution de 1 L amphibiens Ringer.
    2. Pour les contrôles Bd positifs et négatifs Bd, baigner les animaux dans une solution de Ringer amphibiens sans itraconazole.
  2. Traitement <ol>
  3. Placez amphibiens individuels désinfectés 50 ml conteneurs avec 35 ml de la solution de traitement.
  4. S'assurer que les animaux sont entièrement couverts pendant cinq minutes en remuant doucement le récipient.
  5. Animaux Retour à terrariums désinfectés. Répétez l'opération pour six jours.
  • Assurer le succès du traitement
    1. Les animaux de laboratoire pour l'infection Bd sur le traitement de jour commence.
    2. Les animaux de laboratoire pour l'infection Bd une semaine après la fin du traitement, et une fois par semaine pendant quatre semaines pour assurer infection a disparu.
  • 4. Bd comme Biohazard

    1. Désinfecter individuel hebdomadaire de terrariums.
      1. Baignez les terrariums et de traitement des conteneurs dans un bain d'eau de Javel solution à 10%.
      2. Rincer chaque conteneur blanchi deux fois à l'eau courante.
      3. Laisser les cartouches à sécher pendant 24 heures avant de les réutiliser.
    2. Porter des gants en nitrile propres lors de la manipulation des animaux pour éviter la contamination croiséeBd de l'agent pathogène. Changer de gants entre chaque manipulation des animaux.
    3. Désinfecter tous les déchets liquides avant leur élimination en apportant la solution à 10% l'eau de Javel.
    4. Autoclave tous les déchets solides qui est potentiellement exposée au Bd avant l'élimination.

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    Representative Results

    Traitement itraconazole a été considéré comme un succès si tous les animaux étaient Bd négatif quatre semaines après la fin du traitement. Avant le début du traitement, deux semaines après l'inoculation, tous les animaux Bd-inoculées ont été infectés, avec une charge zoospore moyenne de 1,121.7 (± 17,34), tandis que quatre semaines après la fin du traitement, les animaux témoins Bd-positifs avaient la charge d'un moyen de 16,765.12 ( ± 14643,08).

    Traitement des Incilius nebulifer (n = 15) a réussi en utilisant des bains à 0,0025% de la concentration d'itraconazole pendant cinq minutes par jour pendant six jours. Cette faible dose de concentration du traitement itraconazole ne différait pas significativement la mortalité par rapport aux contrôles Bd-positifs (Cox régression: 2,1 χ = 2.17, exp (b) = 20,500, p = 0,339) (figure 1B), un grand nombre de qui a survécu jusqu'à la fin de l'essai à l'infection Bd.

    Bains de 0,0025% itraconazole pendant 11 jours, et à la fois 0,005% et 0,0025% d'itraconazole pendant six jours se sont tous révélés être efficaces et les options de traitement de sécurité (figures 1A et 1B). La concentration de traitement recommandé et la moitié de cette concentration pendant une durée de traitement de 11 jours a augmenté significativement la mortalité par rapport aux contrôles Bd-positifs (régression de Cox: 0,01% itraconazole χ 2,1 = 35,68, exp (b) = 307,54, p <0,01; 0,005% itraconazole χ 2,1 = 16,17, exp (b) = 9,40 , p <0,01) (Figure 1A). Le traitement de l'itraconazole à 0,01% pendant 11 jours a entraîné une mortalité de 100% dans I. nebulifer, et la moitié de cette concentration (0,005% itraconazole pendant 11 jours) a entraîné une mortalité de 60% ​​(Figure 1A). Autopsie et l'histopathologie pour un petit sous-ensemble d'animaux morts au cours du traitement ont été menées. Aucun animal dans cette étude est mort de la chytridiomycose.


    Figure 1. Les différences de survie à travers les traitements itraconazole 15 (A) Incilius nebulifer:. 11 traitement de d (n = 15 pour chaque concentration d'itraconazole de 0,01, 0,005 et 0,0025%, n = 17 pour le groupe témoin Bd-positif et n = 9 pour l' Bd négatif groupe de contrôle). (B) I. nebulifer: 6 d traitement (n = 15 pour chaque concentration d'itraconazole de 0,01, 0,005 et 0,0025%, n = 17 pour le groupe témoin positif et Bd-n = 9 pour le groupe témoin négatif Bd). Les flèches noires indiquent le dernier jour de traitement. Les lignes pleines indiquent la survie de groupes de contrôle (noir = Bd-positif, gris = Bd négatif). Lignes brisées indiquent la survie des groupes de traitement itraconazole (points gris clair = 0,01%, Points gris moyen = 0,005%, des points noirs = 0,0025% itraconazole). (Ce chiffre a été modifié depuis Brannelly et al. 15, figure 1B et 1C). Cliquez ici pour agrandir l'image .

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    Discussion

    En utilisant ce protocole, nous avons pu réduire en toute sécurité et efficacement la dose et du temps de traitement de traitement pour l'itraconazole Bd des amphibiens. La plus faible dose de traitement et le temps (0,0025% pendant six jours) est un traitement efficace pour I. subclinique infectés nebulifer. L'efficacité des deux une dose plus faible et le temps de traitement de démontrer la nécessité d'essais cliniques de traitement pour les traitements de l'infection Bd, car il n'existe actuellement aucun traitement sûrs et efficaces pour être utilisés pour toutes les espèces et classes d'âge d'amphibiens.

    La cause du décès résultant d'un traitement itraconazole est inconnue à ce stade 11. L'autopsie et l'histopathologie ont été effectués sur un petit sous-ensemble d'individus qui sont morts pendant ou peu de temps après la période de traitement dans l'étude Brannelly et al. 15. Les résultats de ces analyses n'étaient pas concluants quant à la cause de la mort, mais il est clair que aucun animal n'est mortde la chytridiomycose. Autolyse modérée s'est produite entre la mort et la préservation exemplaire, qui pourrait avoir affecté notre capacité à détecter des différences subtiles entre les groupes de traitement.

    Bien que ce protocole prend en charge l'existence d'un régime de traitement sûr et efficace, plus de procès comme celui-ci doivent être en cours. Un deuxième traitement azole, le voriconazole, a été démontrée comme étant efficace pour au moins une espèce 18. Le voriconazole est plus stable dans une solution d'eau et d'itraconazole a été démontré qu'elles sont sûres pour une utilisation de têtard 18. Bien qu'une dose unique de traitement de l'itraconazole et le voriconazole sont similaires dans les prix, le voriconazole est beaucoup plus cher à l'achat que l'itraconazole, des chercheurs et des gestionnaires captifs de choisir l'itraconazole plus régulièrement. A ce moment, une seule étude publiée a montré l'efficacité du voriconazole de 18 ans. Pour démontrer l'efficacité, plusieurs espèces ont besoin d'être mis à l'essai.

    <antifongiques p class = "jove_content"> azolés représentent un type de chimiothérapie antifongique qui inhibent la croissance des champignons 13. Il existe d'autres méthodes de traitement qui visent à tuer le champignon pathogène plutôt que de simplement réduire la croissance. Bd est tué in vitro à des températures supérieures à 28 ° C et le traitement thermique a pour but de tuer Bd dans l'épiderme. chlorhydrate de terbinafine, un antifongique qui a réussi à traiter une infection à Bd dans certains espèces 19, agit en provoquant la lyse des cellules fongiques. Antifongiques qui attaquent directement l'agent pathogène pourraient être des traitements les plus efficaces, et plus de travail doit être fait pour tester les options de traitement prometteuses pour l'infection Bd.

    Traitement itraconazole a été montré pour être efficace chez les animaux infectés subcliniquement, mais le traitement de la chytridiomycose clinique a été largement infructueuse. Une seule étude à ce jour 20 a traité avec succès terminale i amphibiens ll, et le traitement en cause une combinaison de la thérapie agressive de l'électrolyte et de la chimiothérapie. Options de traitement efficaces pour les animaux malades en phase terminale sont nécessaires, en particulier pour les animaux en voie d'extinction dans les colonies en captivité où la protection de chaque individu est essentiel pour la conservation de l'espèce.

    Bien que la réduction de la dose et la durée du traitement a été un succès pour I. nebulifer, le traitement n'a pas été mis à l'essai sur d'autres espèces ou des animaux atteints d'infections cliniques. Certaines espèces et stades de la vie sont intolérants de traitement itraconazole, avant l'application d'un régime de traitement à grande échelle, les gestionnaires captifs devraient traitement d'essai sur un petit groupe de personnes pour déterminer l'innocuité et l'efficacité. Tester les animaux traités pendant au moins quatre semaines après l'achèvement du traitement est nécessaire pour assurer l'élimination de l'infection par le faible niveau 7, et devrait être mis en oeuvre après chaque régime de traitement.

    tente "> Mise en place des options de traitement sûr et efficace pour les infections Bd en priorité captif de la zone de colonies d'assurance pour les efforts de conservation des amphibiens. Maintenir Bd colonies libres est essentielle au succès des efforts de conservation et de colonies en captivité peut-être la seule bouée de sauvetage pour les espèces au bord de l'extinction .

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    Disclosures

    L'auteur déclare aucun intérêt financier concurrents.

    Acknowledgments

    Je tiens à remercier CL Richards Zawacki l'aide de conceptualiser la conception expérimentale et aider avec des matériaux, A. Pessier de l'aide instituant un régime de traitement et l'autopsie des analyses, MWH Chatfield, MJ Robak, K. Tasker et D. Lenger de l'aide à la laboratoire et de soutien et M. McFadden et P. Harlow au zoo de Taronga pour l'utilisation de leur espace pendant le tournage. Le projet a été financé en partie par la Louisiane Département de la faune et de la pêche grâce à la subvention de la Louisiane Commission de l'éducation de l'environnement décerné à LA Brannelly et par Life Technologies.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox Janssen Pharmaceutica Inc.
    NaCl Fisher Scientific S640-500
    KCl Fisher Scientific BP366-1
    CaCl2 Fisher Scientific BP510-100
    NaHCO3 Fisher Scientific BP328-500
    Sterile cotton swabs Medical and Wire Equipment MW113
    1.5 ml Microtubes Sarstedt 73.703.217
    Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69581
    7500 Real-time PCR Applied Biosystems 4351104
    VIC IPC Applied Biosystems 4308323
    BSA Applied Biosystems AM2618
    Agar Invitrogen 30391023
    Tryptone Invitrogen Q10029
    Penicillin-streptomycin Invitrogen 15070-063
    Petri Dish Sigma Aldrich CLS430589

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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