Aislamiento de doble negación células T αβ del Riñón

1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine
Immunology and Infection

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ERRATUM NOTICE

Summary

Células DNabT son raros entre las células T periféricas; sin embargo, que son abundantes en ciertos tejidos no linfoides. Dificultad de aislar las células T DN de tejidos no linfoides dificulta su análisis funcional a pesar del aumento reconocida importancia fisiopatológica. Se describe un nuevo protocolo para el aislamiento de células DN T altamente purificadas de riñón murino.

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Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney. J. Vis. Exp. (87), e51192, doi:10.3791/51192 (2014).

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Abstract

Actualmente no hay ningún protocolo estándar para el aislamiento de células DN T de los tejidos no linfoides a pesar de su participación cada vez informado en varias respuestas inmunes. Células DN T son un tipo de célula inmune única que ha sido implicado en la regulación de las respuestas y la tolerancia inmunes y autoinmunes a alotrasplantes 1-6. Células DN T son, sin embargo, rara en la sangre periférica y órganos linfoides secundarios (bazo y nódulos linfáticos), pero son importantes los residentes de la normal del riñón. Muy poco se sabe acerca de su función fisiopatológica 7 debido a su escasez en la periferia. Recientemente hemos descrito un análisis fenotípico y funcional integral de esta población en el riñón 8 en estado estacionario y durante la lesión por isquemia-reperfusión. Análisis de la función de las células T DN se verá muy reforzada por el desarrollo de un protocolo para su aislamiento del riñón.

Aquí, se describe un nuevo protocolo que permite isolation de alta pureza + CD8 + células T CD4 AB y las células DN T de riñón murino. En pocas palabras, digerimos tejido renal mediante colagenasa y aislar las células mononucleares de riñón (KMNC) por gradiente de densidad. Esto es seguido por dos pasos para enriquecer las células T hematopoyéticas de 3% a 70% de KMNC. El primer paso consiste en una selección positiva de las células hematopoyéticas CD45 + utilizando un kit de aislamiento. En el segundo paso, las células DN T se aíslan negativamente por la eliminación de células no deseadas utilizando CD4, CD8, MHC de clase II y anticuerpos monoclonales y CD1d α-GalCer tetrámero. Esta estrategia conduce a una población de más de 90% de pureza células T DN. Tinción de la superficie con los anticuerpos mencionados anteriormente, seguido por el análisis FACS se utiliza para confirmar la pureza.

Introduction

Periférico αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - doble negativa células (DN) T se dividen en varios subconjuntos que poseen fenotipos y funciones 1-4 distintos. DN células T, son poco conocidos, pero cada vez más implicados en la respuesta inmune fisiopatológicos en diferentes modelos de enfermedad 4-6.

Células DN T son un tipo de célula inmune única que está implicada cada vez más en la regulación de diversas respuestas inmunes y autoinmunes y la modulación de la tolerancia alotrasplante. 4-6, 9 son raros en la sangre periférica y órganos linfoides secundarios (bazo y los ganglios linfáticos ). Sin embargo, son importantes los residentes del riñón y el intestino epitelio normal 10-12. Muy poco se sabe acerca de su función 7 en el riñón en el estado estacionario y en condiciones patológicas como la lesión renal aguda (LRA) asociado con trasplantación de riñónhormiga.

Debido a las funciones complejas de diferentes células inmunes en la regulación de respuestas inmunes incluyendo alloresponses, definir el papel de cada jugador es fundamental para entender alloresponses y el diseño de nuevas terapias. Teniendo en cuenta los números significativos de células DN T presentes en el riñón bajo condiciones fisiológicas y de enfermedad diferentes, las células DN T es probable que desempeñen un papel crítico en la regulación de respuestas inmunes y autoinmunes en ratones y seres humanos, y alloresponses en receptores de trasplante. La acumulación de pruebas, aunque todavía dispersos implica células T DN en ambas funciones patogénicas e inmunosupresores, pero no se comprende bien por qué y cómo se exhiben una función perjudicial o supresora específica y cómo el ambiente influye en ellos.

Debido a su baja abundancia en el riñón, mejora de los métodos de aislamiento son necesarios.

Actualmente no hay ningún protocolo estándar para el aislamiento de células DN T de Tél tejidos no linfoides. Nuestro protocolo describe un nuevo método para el aislamiento de células DN T de los riñones; Sin embargo, el método también se puede utilizar para diversos tejidos no linfoides.

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Protocol

1. Preparación de los instrumentos, los medios de cultivo y reactivos

  1. Instrumentos: Preparar los reactivos en condiciones estériles y utilizar bajo una campana de flujo laminar.
  2. Preparar 1 L de medio de cultivo tisular RPMI, añadir 5% de suero fetal bovino, 2,1 g de bicarbonato, 10 ml de glutamato 100x, 10 mg de HEPES, piruvato de sodio 1 mg y 10 ml de 100X penicilina / estreptomicina.
    Nota: el medio de cultivo tisular recomendada, RPMI, es intercambiable con DMEM.
  3. Preparar la solución de 5% de colagenasa "D" (5 ml de colagenasa "D" a 9 ml de medio de cultivo tisular).
  4. Hacer solución de Percoll a tres concentraciones diferentes: 100%, 80% y 40%. Las siguientes concentraciones se calculan para 1 muestra. Mantenga las soluciones a temperatura ambiente.
    1. Solución de Percoll: añadir 9 ml de Percoll (sin diluir de solución madre); añadir 1 ml de PBS 10x.
    2. Solución de Percoll: añadir 8 ml de Percoll 100%; añadir 2 ml de PBS 1x.
    3. Solución de Percoll:añadir 4 ml de Percoll al 80%; añadir 4 ml de PBS 1x.
  5. Hacer 1 L de fluorescencia de células activadas por la clasificación tampón (FACS); añadir 5 ml de 10% de BSA (BSA al 0,1%), azida de sodio 1 ml al 10% (0,1%), 2 ml de agente EDTA, completar a 1 000 ml con PBS 1x.

2. Preparación de la digestión de riñón

  1. Habiendo adquirido cualquier aprobación institucional necesario, sacrifica y Exsanguinate los ratones con los métodos estándar y siguiendo las normas vigentes y las directrices de cuidado de animales.
    1. Se anestesia el ratón con pentobarbital (0,07 mg / kg).
    2. Continúe con el desangramiento.
    3. Coloque el ratón en una posición supina sobre una mesa quirúrgica.
    4. Pulverizar la zona abdominal con etanol al 70%.
  2. Añadir 10 ml de solución de colagenasa D para la placa de Petri.
  3. Retire y decapsulate ambos riñones de cada ratón.
    1. Abra la cavidad abdomimal haciendo una incisión en la línea media a través de la piel abdominal y el peritoneo desde el esternón hastael pubis.
    2. Exponer el riñón izquierdo moviendo el intestino lateralmente a un lado.
    3. Separe con cuidado la cápsula a la izquierda con las pinzas.
      Nota: La cápsula aparece como una capa transparente que rodea el riñón y parcialmente cubierto por el tejido adiposo perirrenal.
    4. Retire el riñón izquierdo cortando los vasos del pedículo utilizando una tijera quirúrgica.
    5. Repita mismo procedimiento para el riñón derecho.
      Nota: El riñón derecho es más craneal y más cerca de la línea media (pedicelos son más cortos).
  4. Coloque el riñón en la placa de Petri.
  5. Cortar el tejido renal en trozos pequeños (1-2 mm de dimensión) usando una cuchilla regular de la conformación de metales y colocar las piezas en la solución de colagenasa durante 30-45 minutos en la incubadora a 37 ° C (Figura 1).

3. Preparación de las células mononucleares de riñón (KMNC) de la digestión del Riñón

  1. Obtener una suspensión de células del riñónla digestión mediante la interrupción mecánicamente el tejido usando un filtro (70 micras) y se resuspende en 25 ml de medio de cultivo tisular y mezclar.
  2. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 º C para sedimentar la suspensión de células.
  3. Vuelva a suspender el sedimento en 4 ml de solución de Percoll 40% y suavemente superponer en 4 ml de solución de Percoll al 80% con una pipeta de plástico de transferencia, muy despacio y con cuidado. Esto dará como resultado dos fases claramente separadas por una capa translúcida. En la parte superior será una capa de color amarillo que corresponde a los lípidos.
  4. Se centrifuga a 1500 × g durante 30 min a temperatura ambiente con la centrífuga en el modo de freno.
  5. Quite por aspiración de la capa superior de color amarillo y grueso (unos 1-2 ml).
  6. Recoger sólo la capa translúcida de color blanquecino ligero de la interfase de las dos fases con una pipeta de transferencia. De transferencia muy cuidadosamente esta suspensión en un tubo cónico de 15 ml que contiene 2 ml de medio de cultivo tisular y a continuación, añadir 13 ml de medio para hacer un volumen total de15 ml.
  7. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C.
  8. Resuspender las muestras en 1 ml del medio.
  9. Cuente el número de KMNC mediante exclusión con azul de tripano en un hemocitómetro y expresar los resultados como números de KMNC por ml por cada riñón.
  10. Lavar una vez que el anterior.

4. Aislamiento de hematopoyéticas (CD45 +) las células de KMNC (Paso I)

  1. Resuspender las células a 10 7 a 90 l de tampón.
  2. Añadir 10 l de microperlas CD45 y se incuba durante 15 min a 4 ° C.
  3. Añadir 1 ml de tampón de desarrollo para detener la reacción. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C y resuspender en 500 l de tampón de ejecución.
  4. Preparar la columna magnética colocando en el imán y enjuague con 3 ml de tampón.
  5. Pasar la suspensión de células a través de la columna magnética y recoger las células no marcadas que pasan a través de la columna.
  6. Lavar las células tres veces con 3 ml de runnción tampón. Luego recoger el efluente.
  7. Retire la columna del separador y una pipeta 5 ml de tampón en las columnas y enjuagar la fracción marcada inmediatamente. Esta fracción contiene las células CD45 +. Contar las células.
  8. Para calcular el número absoluto de diferentes subconjuntos de células T en los riñones multiplicar el número total de KMNC por el porcentaje de células positivas determinado por citometría de flujo (Figura 2).

5. Aislamiento de DN T Móvil desde CD45 + Preparación por selección negativa (Etapa II)

  1. Añadir 2,5 l (0,5 mg / ml, 1,25 microgramos) de cada uno de los siguientes anticuerpos biotinilados anti-CD4, anti-CD8, anti-receptor de Fc (CD16/32), anti-MHC de clase II (IA b), anti- CD1d PBS-57 tetrámero por cada 10 células hematopoyéticas 7.
  2. Se incuban las células durante 30 min en la habitación fría.
  3. Añadir 1 microperlas anti-biotina ml.
  4. Incubar durante 30 minutos en una cámara frigorífica.
  5. Colocar el tubo en tél imán y proceder al agotamiento.
  6. Contar las células viables para determinar el número total de células DN T en la fracción negativa mediante el uso de un hemocitómetro.
  7. Compruebe la pureza de las células T DN con citometría de flujo, siguiendo esta estrategia gating: primero CD45 + puerta, segunda puerta TCRαβ +. Excluir las células CD1d +. Parcela CD4 + CD8 + vs Para identificar las células DN T (Figura 3).
  8. Multiplique el número total por el porcentaje determinado en la pureza.
    Nota: El uso de este protocolo resulta en una población de más de 90% de pureza células T DN.

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Representative Results

Tipo salvaje C57BL / 6 (B6) riñón contiene aproximadamente 1.5 a 2.1 x 10 6 células mononucleares por el riñón. Aproximadamente menos de 10% son células hematopoyéticas CD45 +. Para la preparación de células mononucleares de riñón (KMNC), los riñones se cortan en trozos pequeños, como se muestra en la Figura 1 seguido por la digestión usando 5% de colagenasa.

Esto es seguido por la realización de una centrifugación en gradiente de densidad para recoger KMNC capa (Figura 2, panel izquierdo). KMNC se somete a selección positiva utilizando CD45 + microperlas magnéticas como se describe en la sección 4 (etapa I). Las celdas de la columna unidos se eluyen y se analizaron para CD45 + por FACS. Esto da como resultado el enriquecimiento de las células CD45 + a aproximadamente 80 a 95% según el análisis por citometría de flujo (Figura 2, panel central). Entre las células hematopoyéticas CD45 + enriquecidos, alrededor de 40-60% era αβ TCR + (datos no mostrados), sobre 30-60% eran células DN T (Figura 2, panel derecho).

El paso final implicado someter células enriquecidas CD45 + para la selección negativa para etiquetar y eliminar las células CD4 +, CD8 +, MHC de clase II + y células CD16/32 + utilizando mAb específicos de biotina y microperlas anti-biotina y columnas magnéticas. Este resultado en altamente purificada (90-95%) de las células DN T (Figura 3). Siguiendo este protocolo era posible obtener hasta 0,5 x 10 6 hematopoyéticas CD45 + células marcadas magnéticamente por ratón (dos riñones).

Figura 1
Figura 1. Preparación del riñón para la digestión con solución de colagenasa 5%. El riñón de ratón se corta en pequeños trozos de 1-2 mm y se coloca en colagenasa D solución al 5% durante 30 min para excavaciónestion. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
. Figura 2 Estrategia para el enriquecimiento de CD45 + células hematopoyéticas del riñón izquierdo:.. Tinción CD45 de riñón MNC antes del enriquecimiento mediante kit CD45 + por selección positiva Center: tinción CD45 de riñón MNC después del enriquecimiento mediante kit CD45 + por selección positiva Derecho.: CD4 y CD8 perfil de + células αβTCR entre CD45 + células cerradas diferentes subconjuntos de células T. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
. Figura 3 La pureza de las células T aisladas DN Izquierda:. Tinción CD45 de células de riñón aislado DN T por selección negativa Centro:. TCRαβ tinción de células de riñón aislado DN T por selección negativa Derecha: CD4 y CD8 tinción entre las células T aisladas de DN. selección negativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Linfocitos en el riñón antes de la purificación. derecha:.. Tinción CD45 en el tejido del riñón antes de la purificación por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Existe un interés creciente en las células T DN ya que están siendo implicados en diferentes condiciones patológicas tales como enfermedades autoinmunes, el cáncer, la tolerancia del injerto, y las enfermedades primarias del riñón incluyendo lesión renal aguda (LRA), glomerulonefritis 8, 13. Por lo tanto, no hay necesidad de entender mejor y caracterizar las funciones fisiopatológicas de las células T DN. Sin embargo, actualmente hay una falta de comprensión de la función de estas células en comparación con CD4 y las células T CD8. Una razón importante es la escasez de células DN T en órganos linfoides secundarios y por lo tanto la dificultad de obtener suficientes células para el análisis in vitro y experimentos de transferencia adoptivos. DN células T se encuentran principalmente en los tejidos no linfoides como el riñón 8 pero la falta de métodos confiables para su aislamiento de órganos sólidos está obstaculizando los esfuerzos para investigar su función. Por lo tanto, nuestro nuevo protocolo para el aislamiento de células T DNSe espera que s desde el riñón a acelerar la investigación sobre la función de las células T DN. Células DN T acumulan en los ganglios linfáticos en grandes números en Fas deficiente (LPR) o FasL deficiente (GLD) ratones y que pueden ser fácilmente aisladas de órganos linfoides 9, 14, 15, pero todavía sigue siendo un reto para aislar estas células de otra tejidos.

De acuerdo con este protocolo, los riñones de dos ratones producen aproximadamente 0,5 x 10 6 células hematopoyéticas (CD45 +) y alrededor de 0,2 x 10 6 células T DN. Este número es suficiente para llevar a cabo el cultivo in vitro, ensayos funcionales y / o análisis FACS. La pureza de la población de células T DN debe ser confirmado por citometría de flujo. Este protocolo proporciona una población de células T DN que pueden ser tan puro como el 98%. Mientras que este protocolo está diseñado para el aislamiento de células DN T de los riñones, que puede ser modificado para el aislamiento de células T a partir de otros órganos no linfoides tales como el corazón, tiroides, etc

Dado que las células DN T representan una población pequeña, a veces es necesario para aumentar el rendimiento mediante la realización de rondas adicionales de purificación. Sin embargo, si se requiere un número mayor de células T (DN superiores a 0,5 x 10 6 células) se recomienda realizar la clasificación de separación con el fin de reducir el tiempo y el costo de reactivos.

En resumen, este protocolo se describe un nuevo método para el aislamiento de células DN T de los riñones. Se compone de una preparación (a través de la digestión y el enriquecimiento de KMNC) Paso seguido por la selección positiva y selección negativa a continuación, para el agotamiento de las poblaciones de células no deseadas. Por lo tanto, existe la manipulación directa mínimo de células DN T durante el proceso de aislamiento. Es de destacar que hay protocolos existentes para el aislamiento de células DN T de sangre periférica en ratones y los seres humanos y de los órganos linfoides secundarios, similares a los utilizados para el aislamiento de células T convencionales.

ove_content "> Debido a que se ha demostrado que algunas células DN T expresan FcR-γ, una opción alternativa es no incluir CD16/32 + en el cóctel 16, 17. aislamiento con éxito de células DN T requiere gran atención al detalle. particularmente crucial pasos incluyen: la digestión del tejido, el corte del tejido renal en trozos pequeños, y la correcta identificación y la recogida de la capa de luz en el gradiente de densidad En general, se requieren varias rondas de práctica y algo de destreza manual para conseguir el resultado deseado..

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Este trabajo es apoyado por el NIH PBS (R21 AI095484). Damos las gracias a instalaciones básicas tetrámero NHI para CD1d tetrámero.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laminar flow hood  Baker Company, Inc Or equivalent equipment 
Centrifuge Beckman Coulter Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Atmosphere-controlled incubator Fisher Scientific  (37 °C with 5% CO2)
Analytical flow cytometer LSR II
RPMI 1640 Media Tech 10-040-CV
Collagenase D Roche 11088858001
Percoll  GE Healthcare 17-0891-01
Fetal bovine serum  Corning Cellgro 35-011-CV
0.1% sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich S2002
Buffer phosphate buffered saline (PBS) Corning Cellgro 21-040-CV
PBS 10x Mediatech 46-013-CM
EDTA buffer  Sigma-Aldrich E1161
LS columns  MiltenyiBiotec 130-042-401
CD45+ microbeads MiltenyiBiotec 6.78E-51
Biotin microbeads  MiltenyiBiotec 130-090-485
anti-CD45 (clone: 30-F11)  PerCP  eBioscience G1397
anti-CD45 (clone: 30-F11)  APC-Cy7 Biolegend 103116
anti-TCR Pacific Blue  (ab-chain, clone: H57-597) Invitrogen HM3628
anti-CD4 PE eBioscience 12-0043
anti-CD8 FITC eBioscience 8011-0087
anti-CD4 biotinylated (GK1.5) BD 553728
anti-CD8 biotinylated  (clone 53-6.7) BD 553029
anti-MHC class II (I-A b) biotinylated BD 553609
AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer  MIlteny I Biotec 130-091-221
C57BL/6J mice Jackson Labs 000664 Kidneys - Lymph Nodes
Petri dish  BD Biosciences 356517
70 μm filter  Fisher Scientific 22363548
Plunger  Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 50 ml Bioexpress C-3394-3 Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 15 ml Bioexpress C-3394-1 Or equivalent equipment 
CD1d α-galcer tetramer NHI

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 02/10/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.

There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:

Samatha Bandapelle

instead of:

Samantha Bandapelle

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