הדפסה השקועה של תאים על גבי משטח שונה באמצעות זרימת Microspotter רציפה

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Davidoff, S. N., Miles, A. R., Romanov, V., Gale, B. K., Eckman, J. W., Brooks, B. D. The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter. J. Vis. Exp. (86), e51273, doi:10.3791/51273 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

ההתקדמות שחלה באחרונה בתעשיית התרופות הובילה לעניין מוגבר בבאמצעות מערכים הסלולר בתהליך גילוי תרופות להקרנת סמים 1,2,3 ניתוח cytotoxicological. ההתפתחות במבחני חוץ גופית תפוקה גבוהה ושיטות הקרנה באמצעות מערכי תא יקל על הפיתוח המהיר וחסכוני של מועמדי תרופה, כמו גם לקדם את ההבנה הבסיסית של התא 1,4. הגישה המסורתית להקרנה עם תאים משתמשת בפלטפורמות היטב צלחת קונבנציונלית; עם זאת גישה זו מוגבלת בשל העלות הגבוהה, תפוקה מוגבלת, והיכולת המוגבלת לקבלת מידע כמוני על 1,5 תפקוד תא. בשל המגבלות הללו, מחקר בטכנולוגיות microarray הסלולרי המתפתח לאפיון מולקולרי ביולוגי, הנדסת רקמות, ו1,6 הקרנת סמים. היתרונות של microarrays הסלולרי כוללים שימוש מדגם קטן יותר, לוואי מינימאלי שלההטרוגניות פנוטיפ הסלולרי מיסוך מידע, והכי חשוב היכולת למכן מבחני עבור יותר יישומי תפוקה גבוהה 1,7,8.

תעשיית התרופות כיום מנצלת מבחני מיון מבוסס תאי תפוקה גבוהה עם תרבויות monolayer תא 2D להקרנת סמים בצלחות גם microtiter 9. תאי ריבוב בבארות של צלחות microtiter מציעים את הפוטנציאל לתפוקה גבוהה יותר עם אפשרויות ניסויים ייחודיות. יתר על כן, בטכנולוגיות עדכניות לmicroarrays הסלולר לאפשר לתאים יבשים שיכול לשנות באופן דרמטי את הפנוטיפ של התאים מin vivo 10,11. כדי להתגבר על בעיות אלה, MFCA תוכנן ומוצגת באיור 1. העיצוב של fluidics MFCA 3D מאפשר את קצה ראש ההדפסה באיור 1 שהוריד לתוך אמבט ודחוס כנגד משטח כדי ליצור חותם. קצה סיליקון הרך של ראש ההדפסה מתנהג כמואטם ומהווה חותם הפיך. טכנולוגית MFCA מתאימה באופן ייחודי להתממשק עם משטחים מתחת למים, אשר נדרש עבור שניהם בתרביות תאים ומערכות פרוסה רקמה, וקשה או בלתי אפשרי עם רוב גישות אחרות. סיכות או הדפסת הזרקת הדיו לא תעבוד, ומכשירי microfluidic 2D אינם מתאימים להפקדה או התממשקות עם מערכים גדולים של נקודות בדידות. יתר על כן, על ידי miniaturizing והלוקליזציה של הניסוי - microarray הסלולרי - MFCA מתגבר על הבעיות העיקריות הקשורות למבחני מיון מבוסס תאי תפוקה גבוהה.

CFM משתמש ברשתות ערוץ 3D לדגימות נפח נוזל קטנות מחזור פני מקומות נקודה מיקרוסקופיים על משטח 12,13. על ידי הדפסה עם זרימה, ביומולקולות, תאים, וחומרים כימיים אחרים נשמרות בסביבה נוזלית לאורך כל תהליך ההדפסה, המאפשרות ההדפסה של ביומולקולות ותאים הרגישים ללא חשיפה לאוויר, אשר מעכב את טכניקות הדפסת התא הנוכחיות. כמו כן ניתן להדפיס ישירות מחומר גולמי כגון hybridoma או supernatants בתנאים שיש מנגנון לכידה על פני המערך. המטרה של כתב יד זה היא להסביר בפירוט את הדפוס השקוע של שני סוגי תאים על גבי משטח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תא תרבות הכנה

  1. אחסן מניות תא NIH/3T3 בחנקן נוזלי עד לשימוש.
  2. הכן תקשורת מלאה עבור תאי NIH/3T3 באמצעות הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי, 10 חיץ HEPES מ"מ, 50 יחידות / מיליליטר פניצילין, ו50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין.
  3. להפשיר תאים ל2-3 דקות באמבט מים רועדים ב 37 ° C.
  4. תאי resuspend ב 5 מיליליטר של תקשורת ו צנטריפוגות המלאה ב1,500 XG במשך 3 דקות.
  5. הסר את supernatant התא מבלי להפריע תא גלולה.
  6. Resuspend תאי 5 מיליליטר של תקשורת ולספור תאים באמצעות hemocytometer.
    1. הסר 10 μl של ההשעיה התא והמקום בצינור microcentrifuge 0.5 מיליליטר.
    2. הוסף 10 μl של Trypan הכחול להשעית התא ומערבבים עם קצה פיפטה.
    3. פיפטה 10 μl של התאים המוכתמים לתוך תא hemocytometer.
    4. ספירת תאים בhemocytometer ב10xההגדלה.
      1. לספור את תאי חיים (כדורים קטנים, לבן) עבור 4 מתוך 9 הריבועים גדולים. לספור רק תאי החיים שאינו מופיעים בצבע כחול כהה מכתם Trypan הכחול.
      2. חשב את המספר הממוצע של תאים לכל כיכר גדולה, וכתוצאה ממספר התאים x 10 4 תאים / מיליליטר בהשעית התאים המקורי.
      3. תאי זרע בצפיפות של x10 1 5 תאים / מיליליטר עם סך של 5 מ"ל בכל בקבוק T25.
    5. תרבות תאים לבין 70% וconfluency 80% לפני ניסויים מתחילים. רענן תקשורת בכל 2-3 ימים או לפי צורך.

2. הכנת שטח הדפסה

  1. מארק מלבן עם סמן על החלק התחתון של רקמות שטופלה תרבות קלקר (TCTPS) 12 צלחת גם בגודל של ראש ההדפסה (7 מ"מ x 19 מ"מ).
  2. פיפטה 50 μl של סרום שור עוברי לתוך השטח מלבני ופרש אותה על פני האזור כולו עם הקצה.
  3. השאר את צלחת פטריבO מכסה המנוע הבטיחות הביולוגי / N סטרילי כדי לאפשר מקום הסרום להתייבש לחלוטין. צריכה להיות מוכנות צלחות אלו לא יותר מ -2 ימים לפני השימוש.

3. הדפסה השקועה

  1. יש לשטוף את ראש ההדפסה עם מים מזוקקים.
    1. למלא צלחת פטרי 60 מ"מ עם מים מזוקקים ולעגן את ראש ההדפסה על גבי המשטח.
    2. זרימת מים מזוקקים באמצעות כל אחד מהקווים למשך 2 דקות ב150 μl / min באמצעות משאבת פנאומטי.
    3. מחק את המים מצלחת פטרי ולמלא אותה במים נקיים.
    4. הזז את ראש ההדפסה מעלה ומטה בתוך המים 3 פעמים.
  2. לעגן את מרכז ראש ההדפסה על המקום מצופה בסרום בצלחת גם מוכנה מראש 12.
  3. ראש בראש ההדפסה עם תקשורת מלאה מראש חיממה, 300 μl לכל ערוץ.
  4. הדפסה מושעה תאים בריכוז של 50,000 תאים / מיליליטר על פני השטח ו60 μl / דקה, לכל ערוץ 100 μl.
  5. הנח את ראש ההדפסה, עזב עגן נגדפני השטח, והסעפת בתרבית תאי חממה מוגדרת 5% CO 2 ו37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  6. לאחר הדגירה 2 שעות, הסר את ראש ההדפסה והנח את המכסה על צלחת התרבות. הזמן שבו ראש ההדפסה הוסר נחשב נקודת זמן 0 שעות.

4. תרבית תאים רגילה

  1. הוסף 1 מיליליטר של תקשורת מחוממת מראש לאחד של צלחת TCTPS 12 גם הסרום-הבחין מוכנה בשלב 2.
  2. קח 1 מיליליטר של ההשעיה התא שנותרה משלב 2 וטפטפו לתוך באר בודד של צלחת TCTPS 12 היטב. זה יהיה לייצר תרבות המכילה 50,000 תאים במנה.
  3. מניחים את צלחת תרבית התאים באינקובטור ב C ° 37 במשך שעה 2.
  4. לאחר הדגירה 2 שעות תתחיל עיתוי; לעקביות בין דגימות מודפסות וזריעה, זה נחשב לנקודת הזמן 0 שעות.

5. יזואליזציה התרבות

  1. לאחר 0, 2, 24, ו48 תאים לקחת שעות מכל אחת משתי השיטות דescribed לעיל ותמונה באמצעות מיקרוסקופ הפוכה סטנדרטית.
    1. כתם התאים באמצעות יודיד propidium, כתם ניאון אדום ששולב רק לתוך הגרעין של תאים מתים.
      1. לשטוף בעדינות את התאים 3 פעמים עם 1 מיליליטר של בופר פוספט סידן ומגנזיום (PBS + +) כדי להסיר כל פסולת.
      2. הוסף 1 מיליליטר של PBS חימם מראש + + לכל כלי תרבות.
      3. הוסף 1 μl של פתרון מניות יודיד propidium (1 מ"ג / מיליליטר) לכל כלי תרבות.
      4. דגירה התאים מוכתמים יודיד propidium על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. תמונת התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה ב10x ו 40X ההגדלה.
  2. מחק את התאים במכל Biohazard מתאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תאי NIH/3T3 שורת תאי פיברובלסטים הודפסו או זורעים על פני השטח מתחת למים. התאים גדלו לצפיפות של 5 X 10 4 תאים לכל מיליליטר. תאי זרע תוך שימוש בטכניקות תא תרבות מסורתיות. תאים היו שהודפסו בפורמט גדול, ראש הדפסה תא עשר זרימה שבו הערוצים גדולים יותר (~ 500 מיקרומטר) מCFM משמש לחלבונים וביומולקולות אחרות. התאים היו מודפסים או זורעים על פני השטח בסרום מצופה. תהליך ההדפסה מוצג באיור 1.

לאחר הדפסה וזריעה, התאים היו דמיינו להעריך צפיפות ומורפולוגיה בנקודות רלוונטיות זמן (0, 2, 24, ו48 hr). צפיפות התאים והמורפולוגיה של התאים בנקודות הזמן אלה הוערכו באמצעות 10X ו40X בהגדלה מיקרוסקופית. התמונות מראות כי התאים בעלי פנוטיפים כמעט זהים בכל נקודת זמן ובכל איור בהגדלה 2. בהתבסס על נתונים אלה, את ההשפעה שלדפוס היה נחוש להיות מינימאלי.

כדאיות התא הוערכו באמצעות כתם לצרכן. כפי שניתן לראות באיור 3, כדאיות התא לתא המודפס לא היו שונות באופן משמעותי מתאי זרע לכל נקודת זמן. ההבדל העיקרי בין שתי השיטות של הצמדת התאים על פני השטח הוא הצפיפות של התאים מודפסים. צפיפות תאים יורדת בנקודת זמן שעות 2 מ -50% בשני תאי זרע ומודפסים. מחקר נוסף הוא מוצדק כדי לקבוע את הגורם לירידה זו; עם זאת, יחסי צפיפות מודפסות בכללותו בהשוואה לזרע נשארים גבוהים באופן משמעותי. צפיפות התאים המודפסת בflowcell הייתה כעשר פעמים צפופות כמו בכל נקודה כתאי זרע תאים שוקלים הודפסו באותה הצפיפות כמו זריעה זמן, אבל בשטח קטן יותר (0.6 2 סנטימטר באזור לתא זרימה, 3.8 סנטימטר 2 עבור גם צלחת 24 גם). בנקודת הזמן הסופית התאים נמצאים באותה הצפיפות which צפוי בשל מגבלות צריכת תנועתיות תא ומשאבים.

איור 1
תמונת איור 1. (א) לCFM. (B) סכמטי של תא זרימה. (C) תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים הסורקת של ראש ההדפסה מראה flowcells הבודד. (ד ') סכמטי של הדפסה שקועה בו רציפי ראש ההדפסה למשטח תואם בתרבית רקמה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. תמונות השוואת מורפולוגיה של זרע לעומת תאים מודפסים. ב() 3T3 תאיםהודפסו microfluidically על BSA והוערך ב 0, 2, 24, ו48 שעות. ב (ב) 3T3 תאים היו זורעים במקום מודפס. המורפולוגיה של התאים דומה אם לא זהה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. השוואה של צפיפות תאים וכדאיות בין דפוס תא וזריעת תאים בנקודות זמן שונים, כולל 0, 2, 24, ו48 שעות. ב() צפיפות התאים בתאים לכל מ"מ 2 הוערכה. ב( ב ') את הכדאיות של התאים נקבעה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של figu זהמחדש.

איור 4
איור 4. 10x תמונה בהגדלה של ארבעה תאי זרימה של הזרימה הרציף microspotter microarray התא שבזרמו תאי NIH/3T3 דרך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טכנולוגיית הדפסת microfluidic 3D שתוארה כאן היא מסוגל מערכי הדפסת microfluidically של תאים באופן ייחודי לנוזל מילא היטב, כלומר משטח מתחת למים. על ידי הדפסה על משטחים מתחת למים, ניתן לייצר microarrays התא, כי לשמור על הפנוטיפ רלוונטי מבחינה פיזיולוגית התאי של תאים, כמו גם את היכולת זמנית תאים בחלק התחתון של איור ויחיד 4. התוצאות של המחקר מראה כי microfluidically הדפסת תוצאות בתאים קובץ מצורף תא עם מורפולוגיה של תאים דומים וכדאיות; לעומת זאת, התאים המודפסים יכולים להיות מחוברים יותר בצפיפות במיקום מוגדר וכתוצאה מכך פעמים מחקר הכוללות קצרות יותר. זמני לימוד קצרים יכולים להביא לחיסכון משמעותי בעלויות עבור תרופת תפוקה גבוהה הקרנת 14.

מיקרופלואידיקה יש בעבר שימשה במשך microarrays הסלולרי והקרנת סמים תפוקה גבוהה. עשרות מחקרים מפורטים כיצד זרימה מבוססת מבחנילחסל את בעיות הזרימה סטטית; למרבה הצער, מחקרים אלה להשתמש מיקרופלואידיקה 2D (לא להתבלבל עם תרביות רקמת 2D and 3D), אשר מגביל את הצפיפות, ריבוב, ושילוב מיקרוסקופ לניתוחים מקבילים מאוד 15-19. מיקרופלואידיקה דיגיטלי ומיקרופלואידיקה מבוסס אגל הוצעו עבור סוגים אלה של יישומים ויכולים לפעול בפערים מקבילים, תצורות מרובבות 15,17,18, אבל הם מוגבלים לקבוצות תא בודדות או קטנות ולאבד את כל 3-D, רב מבנה רקמת סוג התא במהלך הכנת מדגם. זרימת cytometry תפוקה גבוהה נוצל להקרנת תאים מהירה; עם זאת, cytometry זרימה דורש תאים להישאר בהשעיה, אשר אינו אידיאלי לסינון שורות תאים חסיד ש, in vivo, הם קשורים למטריצה ​​תאית 20. שיתוף תרבויות סובלות גם מהיעדר ייצוג רקמה האמיתי 19. בניגוד לכך, טכנולוגיית 3D MFCA מאפשרת דה האוטומטי לחלוטיןמיקום של ביומולקולות ומשלוח של מגיב לכתמי תא או פרוסות רקמה שלמות במערך צפוף. המערכת המוצעת תהיה לא רק להיות מסוגלת לייצר מערכים, אבל תעשה זאת בסביבה "זורם" המאפשרת ללימודים של מאמצי גזירה, משלוח של תרכובות שונות, ותנאי גידול במערכים אלה ויובילו לסמים חזוי יותר במבחנה הקרנת כלים. מגוון רחב של יישומים יכול להיות שחזה המאפשר חדשנות להמשיך ללא הגבלת זמן. כזה כלי מאפשר גילוי רומן סלולארי סמים ומבחני cytotoxicological במגוון רחב של תחומי מחקר קריטיים כגון סרטן, סוכרת, דלקות, זיהומים, ומחלות לב וכלי דם.

בעוד MFCA היא השיטה המועדפת כדי לספק תאים למשטח מתחת למים, האתגר נשאר לצרף את התא אל פני השטח, במיוחד עבור שורות תאים שאינן חסיד. כיוונים עתידיים של טכנולוגיה זו יתמקדו בשיטות לתא מצורף עבורעל פני השטח. טכניקות לדפוסי תא על משטחים מלאכותיים קיימות כיום וכוללות: הדפסת דיו, microextrusion או נימה מזימות, הכלאה ה-DNA, והעברה קדימה לייזר 21. הטכניקות הללו, את הקובץ המצורף של תאים באמצעות טכנולוגית הכלאת DNA בעל מספר תכונות ייחודיות וחשובות. ראשית, השיטה של התקשרות סלולרי אינה תלויה בקולטנים שבידי תאים בודדים כך ששני התאים חסיד וnonadherent הם מסוגלים להיות בדוגמת שימוש בשיטה זו 22. בשלב הבא, את שיטת הדפוסים הסלולרית DNA מאפשרת לדור של מערכים תאיים מורכבים הכוללים סוגי תאים רבים באמצעות השימוש ברצפי DNA מרובים כרוך משטח 23. יישומים או כיוונים עתידיים יתמקדו בשימוש בטכנולוגית הכלאת DNA לתא מצורף 19,24

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

הכותבים הם עובדים ובעלי מניות של מיקרופלואידיקה Wasatch שמייצר חומרים כימיים ו / או מכשירים המשמשים בכתב היד הזה.

Acknowledgments

המחברים רוצים להכיר כריס מורו לקבלת סיוע טכני. מימון ניתן על ידי NIH SBIR (R43) להעניק GRANT10940803 1R43GM101859-01 (MPI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Continuous flow microspotter Wasatch Microfluidics
NIH/3T3 cells ATCC CRL-1658
Dubbleco's Modified Eagle Medium Invitrogen 11965-092 Base media for cells
HEPES buffer Invitrogen 15630-080 Cell media additive (control pH)
Sodium pyruvate Invitrogen 11360-070 Cell media additive
Penicillin-streptomycin  Invitrogen Cell media additive
Trypan blue Invitrogen 15250-061 Stain cell sfor counting
Hemocytometer Fisher 267110 Cell chamber to count cells
Nikon Eclipse TS100 Nikon Used to check on cells
Nikon Eclipse TE2000-U Nikon Used for collecting images
Phosphate buffered saline (with calcium and magnesium) Invitrogen 14040-133 Rinsing cells before passaging and before staining with PI
TrypLE Express  Invitrogen A12177-01 Used to remove cells from surface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).
  2. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).
  3. Gao, D., et al. Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).
  4. Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).
  5. Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature. 453, 338-344 (2008).
  6. Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. Microscale technologies for tissue engineering and biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).
  7. Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).
  8. Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
  9. Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. (2013).
  10. Gottwald, E., et al. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).
  11. Liu, R., Lee, A. P. Integrated Biochips for DNA Analysis. Springer. (2008).
  12. Natarajan, S., et al. Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).
  13. Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow. Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).
  14. Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. Summer 2011. Drug Discovery World Online at: http://www.ddw-online.com/p-149288 (2011).
  15. Xu, F., et al. A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform. Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).
  16. Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding. Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107 (1993).
  17. Roberts, C., et al. Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces. Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).
  18. Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).
  19. Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).
  20. Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).
  21. Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
  22. Onoe, H., et al. Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences. Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).
  23. Hsiao, S. C., et al. DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells. Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics