L'impression submergé de cellules sur une surface modifiée à l'aide d'un flux continu Microspotter

Bioengineering

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Davidoff, S. N., Miles, A. R., Romanov, V., Gale, B. K., Eckman, J. W., Brooks, B. D. The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter. J. Vis. Exp. (86), e51273, doi:10.3791/51273 (2014).

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Abstract

Introduction

Les progrès récents dans l'industrie pharmaceutique ont conduit à un intérêt accru pour l'aide puces cellulaires dans le processus de découverte de médicaments pour le dépistage des drogues et de l'analyse cytotoxicological 1,2,3. Le développement de tests in vitro à haut débit et les méthodes de dépistage à l'aide de puces à cellules devrait faciliter le développement rapide et rentable de candidats-médicaments ainsi que l'avance la compréhension fondamentale de la cellule 1,4. L'approche traditionnelle de dépistage avec des cellules utilise des plates-formes et de plaques conventionnelles; Cependant cette approche est limitée en raison du coût élevé, le débit limité, et la capacité limitée d'informations quantitatives sur la fonction des cellules 1,5. En raison de ces limitations, la recherche dans les technologies de puces à ADN cellulaire est en plein essor pour la caractérisation moléculaire biologique, l'ingénierie tissulaire, et le dépistage de drogue 1,6. Les avantages de puces cellulaires comprennent l'utilisation réduite de l'échantillon, des effets minimes dephénotype cellulaire hétérogénéité masquage des informations, et surtout la possibilité d'automatiser des tests pour d'autres applications à haut débit 1,7,8.

L'industrie pharmaceutique utilise actuellement à haut débit des essais de criblage à base de cellules avec 2D cultures monocouches de cellules pour le criblage de médicaments dans des plaques de microtitration 9. Cellules de multiplexage dans les puits de plaques de microtitration offre la possibilité pour un débit plus élevé avec des options d'expérimentation uniques. En outre, les technologies actuelles de microarrays cellulaires permettent de sécher les cellules, qui pourrait modifier radicalement le phénotype des cellules in vivo à partir de 10,11. Afin de surmonter ces problèmes, le MFCA a été conçu et est représenté sur la figure 1. La conception de la fluidique MFCA 3D permet à la pointe de la tête d'impression sur la figure 1 pour être descendu dans un bain et comprimé contre une surface pour former un joint. La pointe en silicone souple de la tête d'impression se comporte comme unjoint d'étanchéité et forme un joint réversible. La technologie MFCA est particulièrement bien adapté pour l'interface avec les surfaces immergées, qui est nécessaire à la fois pour les cultures de cellules et des systèmes de découpe du tissu, et il est difficile, voire impossible, avec la plupart des autres approches. Pins ou l'impression à jet d'encre ne fonctionnera pas, et des dispositifs microfluidiques 2D ne sont pas adaptés pour le dépôt ou l'interfaçage avec les grands réseaux de points discrets. En outre, par la miniaturisation et la localisation de l'expérience - la puce à ADN cellulaire - la MFCA surmonte les problèmes majeurs associés à haut débit avec des essais de criblage à base de cellules.

Le CFM utilise des réseaux de canaux 3D à vélo de petits échantillons de fluide de volume sur les emplacements ponctuels microscopiques sur une surface 12,13. En imprimant avec écoulement, des biomolécules, des cellules, et d'autres réactifs sont maintenus dans un milieu liquide pendant tout le processus d'impression, ce qui permet l'impression des biomolécules et des cellules sensibles sans exposition à l'air, ce qui empêche les techniques d'impression actuelles de la cellule. Il est également possible d'imprimer directement à partir d'un matériau brut comme hybridome ou surnageants fournis il ya un mécanisme de capture sur la surface du tableau. L'objectif de ce manuscrit est d'expliquer en détail l'impression submergé de deux types de cellules sur une surface.

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Protocol

1. Culture cellulaire Préparation

  1. Stocker les stocks de cellules NIH/3T3 dans l'azote liquide jusqu'à utilisation.
  2. Préparer un milieu complet pour cellules NIH/3T3 à l'aide du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 10 mM de tampon HEPES, 50 unités / ml de pénicilline, et 50 pg / ml de streptomycine.
  3. Décongeler les cellules pour 2-3 min dans un bain d'eau sous agitation à 37 ° C.
  4. Resuspendre les cellules dans 5 ml de milieu complet et centrifuger à 1500 g pendant 3 min.
  5. Retirer le surnageant de cellule, sans perturber le culot cellulaire.
  6. Remettre en suspension les cellules dans 5 ml de milieu et compter les cellules en utilisant un hématimètre.
    1. Retirer 10 pi de la suspension cellulaire et le placer dans un tube à centrifuger de 0,5 ml.
    2. Ajouter 10 ul de bleu trypan à la suspension de cellules et les mélanger avec le bout de la pipette.
    3. Introduire à la pipette 10 ul de cellules colorées dans une chambre d'hémocytomètre.
    4. Compter les cellules en hématimètre à 10xgrossissement.
      1. Compter les cellules vivantes (petites boules blanches) pour 4 des 9 grands carrés. Compter que les cellules vivantes qui ne semblent pas bleu foncé de la tache bleu Trypan.
      2. Calculer le nombre moyen de cellules par grande place, résultant du nombre de cellules x 10 4 cellules / ml dans la suspension de cellules d'origine.
      3. cellules de semences à une densité de 1 x 10 5 cellules / ml avec un total de 5 ml dans chaque flacon T25.
    5. Culture de cellules à entre 70% et 80% de confluence avant commençant expériences. Actualiser les médias tous les 2-3 jours ou au besoin.

2. Impression Préparation de la surface

  1. Marquer un rectangle avec le marqueur sur le fond d'une culture traitée du tissu polystyrène (TCTPS) 12 de la plaque ainsi la taille de la tête d'impression (7 mm x 19 mm).
  2. Ajouter 50 ul de sérum de veau foetal dans la zone rectangulaire et l'étaler sur toute la région de la pointe.
  3. Laissez la boîte de Pétridans un stérile biosécurité capot O / N pour permettre au lieu de sérum sécher complètement. Ces plaques doivent être préparés à pas plus de 2 jours avant l'utilisation.

3. Impression immergé

  1. Rincer la tête d'impression avec de l'eau distillée.
    1. Remplissez une boîte de Pétri de 60 mm avec de l'eau distillée et ancrer la tête d'impression sur la surface.
    2. Couler de l'eau distillée à travers chacune des lignes pendant 2 minutes à 150 pl / min en utilisant une pompe pneumatique.
    3. Jeter l'eau de la boîte de Pétri et le remplir avec de l'eau propre.
    4. Déplacez la tête d'impression de haut en bas dans l'eau 3 fois.
  2. Ancrer le centre de la tête d'impression sur la place de sérum revêtue de la plaque 12 et pré-établi.
  3. Amorcer le tête d'impression avec les médias complets pré-chauffées, 300 pl par canal.
  4. Imprimer des cellules en suspension à une concentration de 50 000 cellules / ml sur la surface et 60 ul / min, 100 ul par canal.
  5. Placez la tête d'impression, à gauche amarré contre lasurface, et le collecteur dans un incubateur de culture cellulaire défini à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 2 heures.
  6. Après l'incubation de 2 heures, retirer la tête d'impression et placez le couvercle sur la boîte de culture. Le moment où la tête d'impression retirée est considéré comme le point de temps 0 h.

4. Portable standard Culture

  1. Ajouter 1 ml de milieu préchauffées à une de la plaque TCTPS 12 puits de sérum repéré préparé à l'étape 2.
  2. Prélever 1 ml de la suspension cellulaire restant de l'étape 2 à la pipette dans un seul puits d'une 12 bien TCTPS plaque. Ceci va produire une culture contenant 50 000 cellules dans le plat.
  3. Placer la plaque de culture de cellules dans un incubateur à 37 ° C pendant 2 heures.
  4. Après l'incubation de 2 h commencer le chronométrage; la cohérence entre les échantillons imprimés et semis, cela est considéré comme le point de temps 0 h.

5. Culture Visualisation

  1. Après 0, 2, 24, et 48 h cellules de prendre de chacune des deux méthodes described ci-dessus et de l'image en utilisant un microscope inversé standard.
    1. Colorer les cellules en utilisant l'iodure de propidium, un colorant fluorescent rouge qui est seulement incorporée dans le noyau des cellules mortes.
      1. Rincer délicatement les cellules 3 fois avec 1 ml de tampon phosphate salin avec le calcium et le magnésium (PBS + +) pour enlever les débris.
      2. Ajouter 1 ml de PBS + + préchauffée à chaque récipient de culture.
      3. Ajouter 1 ul d'une solution d'iodure de propidium stock (1 mg / ml) pour chaque récipient de culture.
      4. Incuber les cellules colorées avec de l'iodure de propidium à 37 ° C pendant 10 min.
    2. L'image des cellules en utilisant un microscope inversé à 10x et 40x.
  2. Jeter les cellules dans un container prévu appropriée.

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Representative Results

Les cellules NIH/3T3 de lignées cellulaires de fibroblastes ont été imprimées ou ensemencées sur une surface immergée. Les cellules ont été cultivées à une densité de 5 x 10 4 cellules par ml. Les cellules ont été ensemencées en utilisant des techniques de culture cellulaire classiques. Les cellules ont été imprimées à l'aide d'un grand format, douze flux de tête d'impression de la cellule où les canaux sont plus grands (~ 500 um) de la CFM utilisé pour des protéines et d'autres biomolécules. Les cellules ont été ensemencées sur des imprimés ou une surface revêtue de sérum. Le procédé d'impression est représentée sur la figure 1.

Après l'impression et l'ensemencement, les cellules ont été visualisées à évaluer la densité et la morphologie des points pertinents de temps (0, 2, 24, et 48 h). La densité cellulaire et la morphologie des cellules à ces points dans le temps a été évaluée à l'aide 10X et 40X grossissement au microscope. Les images montrent que les cellules possèdent des phénotypes presque identiques à chaque moment et à chaque grossissement Figure 2. D'après ces chiffres, l'effet deimpression a été jugée minime.

La viabilité cellulaire a été évaluée en utilisant une tache de PI. Comme le montre la figure 3, la viabilité cellulaire de la cellule imprimé n'était pas significativement différent de celui des cellules ensemencées pour chaque point de temps. La différence majeure entre les deux modes de fixation des cellules à la surface est la densité des cellules imprimés. La densité cellulaire diminue au 2 point de temps h de plus de 50% dans les deux cellules ensemencées et imprimés. Une étude plus approfondie est nécessaire pour déterminer la cause de cette diminution; Toutefois, les ratios de densité globale imprimés par rapport aux graines reste nettement plus élevé. La densité cellulaire imprimé dans la cuve à circulation a été d'environ dix fois plus dense au niveau de chaque point dans le temps que les cellules ensemencées des cellules qui envisagent ont été imprimées à la même densité que le semis, mais dans une zone plus petite (0,6 cm 2 à la surface pour une cellule d'écoulement, de 3,8 cm 2 pour un puits d'une plaque à 24 puits). Au point de temps final, les cellules sont à la même densité which est probablement due à la motilité cellulaire et de ressources limites de consommation.

Figure 1
Figure 1. (A) Image de la CFM. (B) Schéma d'une cellule d'écoulement. (C) SEM l'image de la tête d'impression montrant flowcells individuels. (D) Schéma de l'impression submergé où la tête d'impression quais à la culture de tissus surface compatible. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Images comparant la morphologie des cellules ensemencées par rapport imprimé. En (A) des cellules 3T3ont été microfluidically imprimé sur BSA et évalués à 0, 2, 24, et 48 h. (B) des cellules 3T3 ont été ensemencées à la place de l'impression. La morphologie des cellules est semblable, sinon identique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Comparaison de la densité cellulaire et la viabilité de la cellule entre l'impression et l'ensemencement des cellules à différents points dans le temps, y compris 0, 2, 24, et 48 h. En (A) la densité cellulaire en cellules par mm 2 a été évaluée. (B) la viabilité des cellules a été déterminée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. 10x de grossissement d'image de quatre cellules d'écoulement de la microspotter de flux continu de puces à ADN de la cellule dans laquelle les cellules NIH/3T3 ont traversé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La technologie d'impression 3D microfluidique décrit ici est le seul à pouvoir impression microfluidically réseaux de cellules dans un liquide bien remplie, c'est à dire une surface immergée. En imprimant sur ​​les surfaces immergées, puces à cellules peuvent être produites qui maintiennent le phénotype cellulaire physiologiquement pertinente de cellules ainsi que la possibilité de multiplexer les cellules dans le fond d'un puits unique figure 4. Les résultats de cette étude montrent que l'impression microfluidically cellules résulte en la fixation des cellules avec la morphologie des cellules et la viabilité comparable; Cependant, les cellules peuvent être imprimés plus densément fixées à un endroit défini qui raccourcit les temps globaux de l'étude. Réduction du temps de l'étude pourraient entraîner des économies de coûts significatives pour le dépistage de drogues à haut débit 14.

Microfluidique a déjà été utilisé pour puces cellulaires et le dépistage des drogues à haut débit. Des dizaines d'études ont détaillé comment écoulement tests baséeéliminer les problèmes de flux statiques; Malheureusement, ces études utilisent microfluidique 2D (à ne pas confondre avec les cultures de tissus 2D et 3D), ce qui limite la densité, le multiplexage et l'intégration de microscope pour des analyses très parallèles 15-19. Microfluidique digitale et de la microfluidique à base de gouttelettes ont été proposés pour ces types d'applications et peuvent fonctionner en parallèle hautement, configurations multiplexés 15.17.18, mais ils sont limités à des groupes de cellules uniques ou de petites et perdre tout 3-D, multi- Structure de tissu de type cellulaire au cours de la préparation des échantillons. Cytométrie en flux à haut débit a été utilisé pour le dépistage rapide des cellules; Toutefois, le débit des cellules nécessite la cytométrie à rester en suspension, ce qui n'est pas idéal pour cribler des lignées de cellules adhérentes qui, in vivo, sont attachés à la matrice extracellulaire 20. Co-cultures souffrent aussi d'un manque de véritable représentation de tissu 19. En revanche, la technologie 3D MFCA entièrement automatisé permet deposition des biomolécules et livraison de réactifs pour les taches de cellules ou coupes de tissus intacts à un réseau dense. Le système proposé ne serait pas seulement être en mesure de générer des tableaux, mais qu'il le ferait dans un environnement "coulant" qui permet des études de contraintes de cisaillement, la livraison de différents composés, et des conditions de croissance sur ces tableaux et mènera à plus de médicament in vitro prédictif outils de dépistage. Une variété d'applications peut être envisagé pour permettre l'innovation pour continuer indéfiniment. Un tel outil permet la découverte de nouveaux médicaments et des dosages cellulaires cytotoxicological dans une multitude de domaines de recherche critiques telles que le cancer, le diabète, l'inflammation, les infections et les maladies cardiovasculaires.

Alors que le MFCA est la méthode préférée pour délivrer les cellules à une surface immergée, le défi consiste à attacher la cellule à la surface, en particulier pour des lignées de cellules non-adhérentes. Les orientations futures de cette technologie se concentreront sur les méthodes de fixation des cellules pourla surface. Techniques pour un patron de cellules sur des surfaces artificielles sont actuellement et comprennent: l'impression à jet d'encre, microextrusion ou filament tracé, hybridation de l'ADN, et laser transfert avant 21. Parmi ces techniques, la fixation des cellules à l'aide de la technologie d'hybridation d'ADN possède plusieurs caractéristiques uniques et importantes. Tout d'abord, le procédé de fixation des cellules ne dépend pas possédées par les récepteurs des cellules individuelles afin que les deux cellules adhérentes et non adhérentes sont capables d'être modelé par l'utilisation de ce procédé 22. Ensuite, le procédé de formation de motif cellulaire de l'ADN permet la génération de réseaux cellulaires complexes comportant de nombreux types de cellules par l'utilisation de plusieurs séquences 23 d'ADN liés à la surface. Applications ou les orientations futures seront axées sur l'utilisation de la technologie d'hybridation d'ADN pour la fixation des cellules 19,24

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Disclosures

Les auteurs sont des employés et actionnaires de Wasatch microfluidique qui produit des réactifs et / ou des instruments utilisés dans ce manuscrit.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Chris Morrow pour l'assistance technique. Le financement a été fourni par le NIH SBIR (R43) accordent 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Continuous flow microspotter Wasatch Microfluidics
NIH/3T3 cells ATCC CRL-1658
Dubbleco's Modified Eagle Medium Invitrogen 11965-092 Base media for cells
HEPES buffer Invitrogen 15630-080 Cell media additive (control pH)
Sodium pyruvate Invitrogen 11360-070 Cell media additive
Penicillin-streptomycin  Invitrogen Cell media additive
Trypan blue Invitrogen 15250-061 Stain cell sfor counting
Hemocytometer Fisher 267110 Cell chamber to count cells
Nikon Eclipse TS100 Nikon Used to check on cells
Nikon Eclipse TE2000-U Nikon Used for collecting images
Phosphate buffered saline (with calcium and magnesium) Invitrogen 14040-133 Rinsing cells before passaging and before staining with PI
TrypLE Express  Invitrogen A12177-01 Used to remove cells from surface

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References

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